牦牛胎盤免疫調(diào)節(jié)因子對小鼠免疫器官指數(shù)及組織結(jié)構(gòu)的影響

寧鵬

摘要 [目的]研究牦牛胎盤免疫調(diào)節(jié)因子對小鼠免疫器官指數(shù)和組織結(jié)構(gòu)的影響。[方法]采用冷凍-超濾法制備牦牛胎盤免疫調(diào)節(jié)因子，用其對免疫抑制小鼠進(jìn)行腹腔注射，10 d后稱重并處死小鼠，剖檢取脾臟和胸腺并稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，同時(shí)進(jìn)行組織切片觀察并進(jìn)行脾臟淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。[結(jié)果]藥物組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著高于對照組和模型組（P<0.05）；藥物組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著高于對照組和模型組（P<0.05）；免疫抑制小鼠脾臟和胸腺組織結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯變化。[結(jié)論] 牦牛胎盤免疫調(diào)節(jié)因子可以減輕環(huán)磷酰胺所導(dǎo)致的免疫器官損傷。

關(guān)鍵詞 牦牛胎盤免疫調(diào)節(jié)因子；免疫器官；組織結(jié)構(gòu)；淋巴細(xì)胞數(shù)目

中圖分類號 R96 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）09-0090-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.026

Abstract [Objective] To study the effects of placental immunoregulatory factor of yak on the immune organ index and tissue structure in mice. [Method] The placental immunoregulatory factor of yak was prepared by freezeultrafiltration method， and it was used to make intraperitoneal injection of immunosuppressed mice. After 10 days， mice was weighed and killed， spleen and thymus were collected through anatomy and weighed， and thymus index and spleen index were calculated. Tissue section observation was made and spleen lymphocyte was counted. [Result]The spleen index and thymus index of mice in drug administration group were significantly higher than those of control group and model group （P<0.05）. The number of spleen lymphocytes in drug administration group was significantly higher than that in control group and model group （P<0.05）. The tissue structure of spleen and thymus in immunosuppressed mice obviously changed. [Conclusion] The placental immunoregulatory factor of yak could alleviate immune organ damage caused by cyclophosphamide.

Key words Placental immunoregulatory factor；Immune organ；Tissue structure；Lymphocytes number

胎盤作為傳統(tǒng)中藥，在我國已有400～500年的用藥史。胎盤免疫調(diào)節(jié)因子是從人胎盤中分離提取的小分子多肽，分子量在10 ku以下。研究發(fā)現(xiàn)[1-3]，胎盤免疫調(diào)節(jié)因子具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗疲勞、抗氧化和延緩衰老的作用。但由于人的胎盤短缺以及倫理學(xué)問題，目前開始使用動(dòng)物胎盤替代人胎盤。牦牛主要生長于青藏高原海拔3 000 m以上地區(qū)，具有耐高寒、耐勞、抗病能力強(qiáng)等生物學(xué)特征。筆者通過注射環(huán)磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型[4]，研究牦牛胎盤免疫調(diào)節(jié)因子對小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、組織學(xué)結(jié)構(gòu)以及脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)目的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胎盤及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。青海省大通種牛場待產(chǎn)牦牛，經(jīng)檢驗(yàn)布魯氏桿菌病和結(jié)核病均為陰性，自然分娩后采集其胎盤。選用60只雌、雄各半的小鼠（蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體重18～20 g，常規(guī)飼養(yǎng)3 d后觀察無異常，備用。

1.1.2 主要試劑與藥品。生理鹽水、環(huán)磷酰胺、酒精、蘇木素、二甲苯等。

1.1.3 主要儀器。冷凍離心機(jī)、組織勻漿機(jī)、組織搗碎機(jī)、濾膜、Millipore YM-10型濾器、電子天平、染色缸、顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 胎盤免疫調(diào)節(jié)因子的提取。將已采集冷凍貯存的牦牛胎盤自然解凍，沖洗其表面血液及臟物，將其剪碎，-20 ℃反復(fù)凍融3次，用組織搗碎勻漿機(jī)12 000 r/min勻漿（3 min/次）共10次，然后用冷凍離心機(jī)8 000 r/min離心20 min后取上清液，再用0.45 μm的濾器進(jìn)行微濾，將微濾出的濾液放入超濾器中，冷凍離心機(jī)7 000 r/min離心20 min，取上清液裝入滅菌的青霉素小瓶中，備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥。60只小鼠分為藥物組、對照組和模型組，每組20只，分籠喂養(yǎng)。對照組小鼠每天腹腔注射生理鹽水0.2 mL， 藥物組每天腹腔注射牦牛胎盤免疫調(diào)節(jié)因子0.2 mL，模型組每天腹腔注射0.2 mL生理鹽水，并在第2、4、6天腹腔注射環(huán)磷酰胺20 mg/kg。飼養(yǎng)10 d后稱重并處死小鼠。

1.2.3 免疫器官指數(shù)的測定。剖解小鼠，取脾臟和胸腺并稱重，按照以下公式計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)：

脾臟指數(shù)=脾臟重量/體重（1）

胸腺指數(shù)=胸腺重量/體重（2）

1.2.4 脾臟和胸腺組織結(jié)構(gòu)切片觀察。

將切好的小塊脾臟、胸腺組織放入中性甲醛溶液中固定，使用流水沖洗，梯度酒精進(jìn)行脫水、復(fù)水，應(yīng)用二甲苯透明后用石蠟進(jìn)行包埋，切片、附片、染色，使用顯微鏡進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)切片觀察。

1.2.5 脾臟組織內(nèi)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。

組織切片于顯微鏡40倍物鏡下選取以淋巴小結(jié)中心點(diǎn)為中央的面積15 000 μm2的正方形，對此范圍內(nèi)的淋巴細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并換算成1 μm2內(nèi)的淋巴細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛胎盤免疫調(diào)節(jié)因子對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

由表1可知，藥物組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)與對照組和模型組相比差異顯著（P<0.05）。

2.2 牦牛胎盤免疫調(diào)節(jié)因子對小鼠免疫器官組織結(jié)構(gòu)的影響 由圖1、2可以看出，注射牦牛胎盤免疫調(diào)節(jié)因子的藥物組小鼠與對照組相比脾臟淋巴小結(jié)更加明顯，脾臟組織結(jié)構(gòu)正常，成熟淋巴細(xì)胞增多；胸腺皮髓界限更加清楚，網(wǎng)狀細(xì)胞增生不明顯，成熟的淋巴細(xì)胞增多。

與對照組相比，模型組脾臟淋巴小結(jié)幾乎消失，成熟的淋巴細(xì)胞減少，組織結(jié)構(gòu)分界不清；模型組小鼠胸腺皮質(zhì)萎縮和髓質(zhì)增多，成熟的淋巴細(xì)胞減少和網(wǎng)狀細(xì)胞增多比較明顯。

2.3 脾臟組織內(nèi)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

從圖3可以看出，藥物組單位面積內(nèi)小鼠淋巴小結(jié)中淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著高于對照組和模型組（P<0.05）。

3 討論

免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子組成的免疫系統(tǒng)[5]是動(dòng)物機(jī)體的疾病防御系統(tǒng)。胸腺和脾臟是中樞免疫器官和外周免疫器官，分別為T淋巴細(xì)胞分化成熟和各種成熟淋巴細(xì)胞的定居及免疫反應(yīng)發(fā)生的主要場所，因此胸腺和脾臟的發(fā)育狀況直接影響機(jī)體的免疫功能，一定程度上反映機(jī)體的免疫水平[6-7]。

現(xiàn)代研究表明，胎盤中含有多種刺激機(jī)體免疫力的小分子活性物質(zhì)，從而能夠增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫力[8-10]。該研究中模型組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與對照組和藥物組相比差異顯著（P<0.05）；小鼠脾臟組織切片淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，藥物組小鼠脾臟淋巴小結(jié)中淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著高于對照組和模型組（P<0.05），說明牦牛胎盤免疫調(diào)節(jié)因子可以明顯提高小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)以及脾臟中淋巴細(xì)胞數(shù)目，而脾臟指數(shù)增高與淋巴細(xì)胞數(shù)量增加是否有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，與藥物組和對照組相比，免疫抑制小鼠脾臟和胸腺組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，說明牦牛胎盤免疫調(diào)節(jié)因子可以減輕環(huán)磷酰胺所導(dǎo)致的免疫器官損傷。

參考文獻(xiàn)

[1]劉澤隆，張涌.家畜胎盤生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，27（1）：82-87.

[2] 劉月新，王勛楚，段茂芳，等.一種新的免疫調(diào)節(jié)劑——胎盤因子的制備與研究[J].中國免疫學(xué)雜志，1985，1（5）：51-54.

[3] 賈萬鈞，韓志濤，劉建偉.胎盤制劑的抗衰研究I（抗衰免疫指標(biāo)觀察）[J].老年學(xué)雜志，1988，8（4）：233.

[4] 高芃，錢嘉林，劉長喜，等.環(huán)磷酰胺對小鼠免疫抑制的動(dòng)物模型建立[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2004，21（4）：314-318.

[5] 崔治中，崔保安.獸醫(yī)免疫學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[6] 楊漢春.動(dòng)物免疫學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[7] 陳興穎.中藥多糖免疫增強(qiáng)劑芪藿飲及作用機(jī)理研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[8] 吳凌，李金香，王國良，等.人和動(dòng)物胎盤藥理作用和臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，13（2）：68-71.

[9] 豐慧根.胎盤免疫調(diào)節(jié)肽對免疫抑制狀態(tài)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，12（2）：134-136，140.

[10] 周國華，浩洪龍，譚雷濤，等.牛和羊胎盤肽的制備及其生物活性的研究[J].中國生化藥物雜志，2006，27（3）：172-174.