南海具抑菌活性微生物的篩選與鑒定

田良玉 彭淑婭 顧卉卉 蔣超 朱道辰 周曉見(jiàn)

摘要：在南海深海海泥中采用平板法分離具有抑菌活性的微生物，以紙片法研究其抗菌活性，對(duì)分離到的活性細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行生長(zhǎng)特性研究。結(jié)果表明，從海泥中分離到9株具有抑菌活性的微生物，分別屬于Bacillus和Salinicola屬。菌株j65可在含鹽率20%的條件下生長(zhǎng)，除菌株gu8外其他菌株均可在pH 6～10的環(huán)境下生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：海洋微生物；分離鑒定；抑菌試驗(yàn)；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.99 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）10-0065-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.10.015

Isolation and Identification of Antibacterial Bacteria in South China Sea

TIAN Liang-yu1，PENG Shu-ya1，GU Hui-hui2，JIANG Chao2，ZHU Dao-chen2，ZHOU Xiao-jian1

（1.College of Environmental Science & Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225127，Jiangsu，China；

2.College of Environment and Safety Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 222013，Jiangsu，China）

Abstract： The bacteria which had antibacterial activity was isolated from the sediments of South China Sea by plate isolation.The antibacterial activity of isolates were identified by paper disk method. The active isolates were identified by 16S rRNA sequencing and the phylogenetic tree constructed by neighbour-joining method. The growth characteristics of bacteria were studied. The results showed that nine active antibacterial bacteria belonging to genus Bacillus and Salinicola were isolated from sediment samples. It was indicated that strain j65 could grow at the concentration of 20% NaCl，and all strains could grow at the range of pH 6～10，except for strain gu8.

Key words： marine microorganism； isolation and identification； antibacterial experiment； phylogenetic tree

海洋獨(dú)特的高壓、高鹽、高溫、嚴(yán)寒、無(wú)光照等環(huán)境特點(diǎn)，造就了海洋微生物物種的獨(dú)特性與多樣性[1]。微生物在這樣的特殊環(huán)境中，演化出了特殊的代謝途徑，能夠產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎和功能奇特的代謝產(chǎn)物[2，3]。近年來(lái)，人們從陸地微生物菌種資源中尋找新的活性物質(zhì)和新藥已變得越來(lái)越困難[3]，抗藥性問(wèn)題也日益嚴(yán)重[4]。因此，對(duì)海洋微生物的研究越來(lái)越受到世界各國(guó)和組織的重視[4，5]，對(duì)從海洋微生物中獲取新的特效活性物質(zhì)和新藥寄予了極大的希望[2，5，6]。目前，有研究者從海洋動(dòng)物和海洋植物體表或者體內(nèi)分離篩選得到具有抑菌活性的海洋微生物[1，7]，而直接從海洋深處的海泥中分離、篩選與鑒定具有抑菌活性微生物的研究則鮮有報(bào)道[6，7]。

隨著人們對(duì)畜產(chǎn)品安全和環(huán)保意識(shí)的不斷加強(qiáng)，益生菌作為抗生素的替代品受到廣泛的關(guān)注，并逐漸應(yīng)用于養(yǎng)殖動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)和飼料添加中。有研究指出，益生菌作為抗生素的最佳替代品之一，具有增強(qiáng)宿主抵抗力、提高集體健康水平、減少疾病發(fā)生等優(yōu)點(diǎn)[8]。作為新型的飼料添加劑，益生菌已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)、畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中。本研究擬從南海海泥中篩選抑菌海洋微生物，對(duì)其進(jìn)行鑒定和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并研究其生理特性，是新藥開(kāi)發(fā)的一項(xiàng)重要的前期工作[9]；同時(shí)，也可為畜禽飼料益生菌提供新的來(lái)源，為南海海洋微生物資源進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 采用南海海洋深處的海泥。

1.1.2 分離純化培養(yǎng)基 M1培養(yǎng)基：淀粉10 g，酵母粉4 g，蛋白胨2 g，純化瓊脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌25 min[10]。

2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，維生素1 mL（過(guò)濾滅菌），磷酸高鐵0.1 g，純化瓊脂18 g，海水定容至1 000 mL。pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌20 min。

高氏1號(hào)培養(yǎng)基：硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀0.5 g， 七水合硫酸鎂0.5 g，七水合硫酸鐵 0.5 g，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌20 min。

ISP3培養(yǎng)基：燕麥粉20 g，微量元素溶液W 1 mL，純化瓊脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌20 min。

ISP4培養(yǎng)基：淀粉10 g，磷酸氫二鉀1 g，七水合硫酸鎂1 g，硫化氨2 g，碳酸鈣2 g，七水合硫酸鐵0.001 g，氯化錳0.001 g，純化瓊脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌20 min[11]。

ISP5培養(yǎng)基：L-天門(mén)冬酰胺1 g（過(guò)濾滅菌），甘油10 g，磷酸氫二鉀1 g，微量元素溶液W 1 mL，純化瓊脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌20 min。

改良羅氏培養(yǎng)基：谷氨酸鈉7.2 g，檸檬酸鈉0.6 g，磷酸氫二鉀2.4 g，硫酸鎂0.1 g，孔雀綠0.4 g，丙三醇12 mL，雞卵液1 000 mL，海水定容至600 mL，90 ℃滅菌1.5 min。

無(wú)機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基：淀粉20 g，磷酸氫二鉀0.5 g，七水合硫酸鎂0.5 g，硝酸鉀1 g，七水合硫酸亞鐵0.01 g，純化瓊脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌20 min。

瓊脂培養(yǎng)基：純化瓊脂8 g，海水1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌20 min。

以上培養(yǎng)基用500 mL燒杯分裝，每瓶裝200 mL，過(guò)濾或高溫滅菌。培養(yǎng)基中海水均為人工海水，微量元素溶液W為Wolfe Trace[12]。人工海水組成：NaCl 20 g/L，MgSO4·7H2O 6 g/L，MgCl2·6H2O 3 g/L，（NH4）2SO4 1 g/L，NaHCO3 0.2 g/L，NaBr 0.05 g/L，CaCl2·2H2O 0.3 g/L，KH2PO4 0.42 g/L，SrCl·6H2O 0.02 g/L，F(xiàn)e（NH4）citrate 0.01g/L，KCl 0.5 g/L。維生素組分配方：煙酸10 mg/L，生物素4 mg/L，泛酸10 mg/L，硫辛酸10 mg/L，葉酸10 mg/L，維生素B1 10 mg/L，維生素B2 10 mg/L，維生素B6 10 mg/L，維生素B12 10 mg/L，對(duì)氨基苯甲酸10 mg/L。Wolfe Trace組分配方：Nitrilotracetic acid 1.5 g/L， MgSO4·7H2O 3.0 g/L，MnSO4·2H2O 0.5 g/L，NaCl 1.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L，CoCl2 0.1 g/L，CaCl2·2H2O 0.1 g/L， ZnSO4 0.1 g/L， CuSO4·5H2O 0.01 g/L， AlK（SO4）2 0.01 g/L，H3BO3 0.1 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.01 g/L。

1.1.3 主要試劑與儀器 Taq酶、dNTP等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，16S rDNA引物購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司，其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。凝膠成像儀、電泳儀、PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 分離純化、培養(yǎng)、保藏 海泥處理：用無(wú)菌藥勺秤取1 g于10 mL無(wú)菌生理鹽水中，用渦旋器激烈振蕩制成均勻的渾濁液，最后稀釋成10-2 g/mL。將處理后的海泥樣品用涂布法在瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布[13]。分別吸取50 μL稀釋液在上述每種培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，每種樣品2～3個(gè)重復(fù)，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1 d后觀察平板中菌落生長(zhǎng)狀況，避免菌苔生成影響分離取樣。2～4 d后觀察平板，根據(jù)菌落的不同顏色、不同形態(tài)進(jìn)行劃線分離，采用區(qū)域劃線法，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落，繼續(xù)重復(fù)劃線，純化2～3次，得到純菌株。挑取單個(gè)菌落于試管培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，于37 ℃搖床中培養(yǎng)1～2 d，在無(wú)菌臺(tái)上吸取200 μL菌液以及200 μL 30%的甘油1∶1進(jìn)行保存。存放于-80 ℃冰箱。

1.2.2 抑菌試驗(yàn) 采用紙片法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)[14-16]。選用國(guó)標(biāo)濾紙，剪成6 mm直徑的濾紙片，121 ℃滅菌20 min后烘干。分別在不同瓊脂培養(yǎng)基上加入稀釋適當(dāng)濃度的指示菌懸液200 μL，涂抹均勻。在紙片上加入50 μL待測(cè)菌株的去細(xì)胞培養(yǎng)液，以無(wú)菌培養(yǎng)基作空白對(duì)照，待自然干燥后輕放在涂有指示菌的培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)1 d。

指示菌液的配制：分別取經(jīng)過(guò)37 ℃培養(yǎng)24 h的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物與生理鹽水1∶9稀釋?zhuān)矣脺u旋器振蕩使菌體均勻分散。

操作步驟：稀釋指示菌液，涂布平板；加入載有相應(yīng)測(cè)試菌液的濾紙片；37 ℃培養(yǎng)1 d，觀察指示菌生長(zhǎng)情況。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 制備模板：將分離純化的菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)1 d，提取細(xì)菌基因組DNA[17]。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：TaKaRa Tag（5 μg/μL）0.25 μL，10×PCR Buffer（Mg2+ Free）5 μL， MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，模板DNA 2 μL，引物1（20 μmol/L）1 μL，引物2（20 μmol/L）1 μL，滅菌去離子水定容至50 μL[17]。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；16 ℃保存。以1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)16S rRNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果[18]。

1.2.4 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 將PCR擴(kuò)增的16S rDNA產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化后，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測(cè)序。用多重序列比對(duì)軟件ClustalW2進(jìn)行新型分離菌株16S rRNA序列與具有抑菌活性細(xì)菌的16S rRNA序列比對(duì)，用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 5.0進(jìn)行序列同源性分析，采用鄰接法（Neighbour-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[19]。

1.2.5 鹽及pH耐受性試驗(yàn) 測(cè)試含鹽率設(shè)置為5%、8%、10%、13%、15%、20%，測(cè)試pH設(shè)置為6、9、10、11，根據(jù)活性微生物的生長(zhǎng)情況確定鹽及pH耐受性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌微生物的分離篩選

對(duì)海泥樣品進(jìn)行平板涂布分離，通過(guò)觀察菌落形態(tài)特征，挑選單菌落。經(jīng)純化，并結(jié)合后期的抑菌活性試驗(yàn)，共得到9株活性菌株。將獲得的16S rRNA基因序列，提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)[19，20]。發(fā)現(xiàn)所獲得9株活性菌株分別屬于9種不同基因表型，除j65外，其余8株均屬于Bacillus（表1）。

2.2 抑菌作用

以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，9株菌株的抑菌活性見(jiàn)表2。由表2可知，菌株E205b、gu8、gu6、j65對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定抑制作用。菌株gu16、gu22、j24、j57對(duì)大腸桿菌有明顯抑制作用，而菌株gu2對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。其中g(shù)u6、j65對(duì)兩種指示菌均有明顯抑制作用，活性最優(yōu)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立

將菌株gu6序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示其16S rRNA基因序列與Bacillus vietnamensis、B. aquimaris的同源性最高，同源性分別為96.90%、95.67%。在比對(duì)結(jié)果中選取同源性較高菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA7.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[21，22]，從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）可以看出，菌株gu6與B. aquimaris同在一個(gè)進(jìn)化分支上，可以認(rèn)定gu6屬于芽孢桿菌屬。

將菌株j65序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示其16S rRNA基因序列與Salinicola salarius同源性最高，同源性達(dá)98.73%。在比對(duì)結(jié)果中選取同源性較高菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA7.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[21，22]，從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）可以看出，菌株j65與S. acroporae同在一個(gè)進(jìn)化分支上，可以認(rèn)定j65屬于棲鹽田菌屬。

鑒于篩選的兩株細(xì)菌同源性、生理生化特征和已知菌種存在一定差異，表明菌株gu6和j65可能是潛在的新種，還需根據(jù)這兩株菌株的細(xì)胞化學(xué)組成和基因組DNA-DNA雜交結(jié)果來(lái)確定[13]。

2.4 抑菌微生物的鹽、pH耐受性

由表3可知，當(dāng)含鹽率在15%及以下時(shí)，除j24在含鹽率15%時(shí)不能生長(zhǎng)外，其余菌株均可以生長(zhǎng)。當(dāng)含鹽率達(dá)到20%時(shí)，只有菌株j65可以生長(zhǎng)。

由表4可知，當(dāng)pH在6～10時(shí)，除菌株gu8在pH為10時(shí)不可以生長(zhǎng)外，所有菌株均可以生長(zhǎng)。當(dāng)pH大于11時(shí)，所有菌株均不能生長(zhǎng)。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)不同培養(yǎng)基對(duì)海泥樣品中的微生物進(jìn)行分離、純化和抑菌試驗(yàn)，篩選出9株具有抑菌活性的微生物。其中8株菌株對(duì)大腸桿菌有一定的抑菌作用，5株菌株對(duì)葡萄球菌表現(xiàn)出一定的抑菌活性，有4株菌株對(duì)二者均有一定的抑制作用，其中菌株gu6和j65活性最優(yōu)。16S rRNA序列分析表明，本研究分離到的兩株高活性菌株gu6和j65分別屬于芽孢桿菌和棲鹽田菌屬，且由于生理生化特征的特殊性，可能為潛在的新種[5]。表明中國(guó)南海地區(qū)微生物具有獨(dú)特性和多樣性，在后續(xù)研究中，可以對(duì)這一特殊環(huán)境的微生物進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究。

通過(guò)對(duì)9株菌株鹽和pH的耐受性研究，發(fā)現(xiàn)菌株對(duì)酸堿變化、高鹽度均具有一定耐受性，對(duì)常見(jiàn)的致病菌具有較好的抑菌作用，易于培養(yǎng)。但菌株的其他生理生化特征和抑菌機(jī)理均有待進(jìn)一步研究。以期在益生菌制劑、畜禽養(yǎng)殖等病害防治領(lǐng)域開(kāi)發(fā)具有應(yīng)用前景的抗菌產(chǎn)品。

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