星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)化姜黃素提取工藝

謝順嵐　吳方建

[摘要] 目的 優(yōu)選姜黃素提取工藝。 方法 以超聲波法提取，在乙腈∶0.5%冰醋酸=50∶50，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，檢測波長422 nm的高效液相色譜條件下測量姜黃素含量，再應(yīng)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對工藝進(jìn)行考察。結(jié)果 最優(yōu)提取工藝：乙醇濃度70.89%、提取時(shí)間49.87 min、液固比15.07∶1，此條件下姜黃素最高得率為3.732%，實(shí)際值與理論值RSD為0.53%。 結(jié)論 該優(yōu)選工藝預(yù)測性良好，能夠?yàn)榻S素進(jìn)一步的開發(fā)利用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素；星點(diǎn)設(shè)計(jì)；高效液相色譜法；提取工藝

[中圖分類號] R284.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（c）-0125-04

Optimization of extraction progress for curcumin by Central Composite Design-Response Surface Methodology

XIE Shunlan WU Fangjian▲

Department of Pharmacy， Yangtze River Shipping General Hospital， Hubei Province， Wuhan 430010， China

[Abstract] Objective To optimize extraction process for curcumin. Methods After exteracted by ultrasound-assisted extraction， the content of curcumin was measured by HPLC with acetonitrile： 0.5% glacial acetic acid = 50∶50， the flow rate was 1.0 mL/min， the column temperature was 35℃ and the detection wavelength was 422 nm. The process was then investigated by Central Composite Design-Response Surface Methodology. Results On the condition of 70.89% ethanol concentration， 15.07：01 fold solvent， 49.87 min each time， the highest yield was 3.732%，the RSD between observed and predicted values was 0.53%. Conclusion The curcumin optimum model can be basis for the further development and utilization with it high predictability.

[Key words] Curcumin ； Central composition design ； HPLC； Extraction progress

姜科植物姜黃（Curcuma longa L.），為多年生宿根草本植物，其根莖發(fā)達(dá)，成叢，多分支；根粗壯，末端膨大呈塊根。姜黃有特異氣香，性燥溫，味苦、辛，具有破血行氣、通經(jīng)止痛、祛風(fēng)痹痛的作用[1]。其主要有效成分姜黃素是國際公認(rèn)的天然色素和香料[2]。研究表明，姜黃素具有廣譜藥理學(xué)活性，如神經(jīng)保護(hù)、抗癌[3]、抗氧化[4-6]、抗菌、抗炎[7]、抗病毒，對心腦血管疾病、自身免疫病[8]、呼吸系統(tǒng)疾病、糖尿病、風(fēng)濕[9]、肝臟疾病[10]都有治療作用，且安全性好。臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使連續(xù)3個(gè)月每日口服姜黃素12 g，個(gè)體耐受性依然良好[11]。

純凈的姜黃色素為橙黃色結(jié)晶粉末，不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，對光敏感[12]，不耐熱，易降解，堿性條件下易分解[13]。本文基于姜黃素的理化特性采用超聲波輔助提取法進(jìn)行提取。超聲波是一種彈性機(jī)械振動波，它破壞藥材細(xì)胞，使溶劑更易擴(kuò)散到細(xì)胞中，從而加速了藥材活性成分的溶解[14]，提高了活性成分浸出率。星點(diǎn)設(shè)計(jì)是效應(yīng)曲面中最常見的二階設(shè)計(jì)[15]，由二水平析因設(shè)計(jì)加軸點(diǎn)和中心點(diǎn)構(gòu)成，是一種新型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用已比較成熟，具有精度高、預(yù)測性好等特點(diǎn)[16]。本文應(yīng)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝，旨在為姜黃素成分的提取優(yōu)化提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

SK5200H型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），CPA225D型分析天平（Sartorius公司），TYS-100型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司），臺式離心機(jī)（武漢赤城生物技術(shù)有限公司），SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），島津SPD-20A液相色譜儀（日本島津公司），Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（美國Agilent公司），L6C-1025M柱溫箱（荊州市津?；た萍加邢薰荆?/p>

1.2 試劑

姜黃飲片（湖北金貴中藥飲片有限公司，產(chǎn)地廣東，生產(chǎn)批號：130202），姜黃素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110823-201004），甲醇、乙腈（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜黃素含量的測定

2.1.1 色譜條件

Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相組分A：乙腈；B：0.5%冰醋酸；A∶B=50∶50；柱溫為35℃；流速為1.0 mL/min，檢測波長為422 nm，進(jìn)樣量20 μL。在此條件下，姜黃素對照品以及姜黃素供試品的色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取姜黃素對照品5.0 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到姜黃素對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取姜黃飲片，50℃烘箱干燥，粉碎機(jī)粉碎后過40目篩（直徑≤0.45 mm）。準(zhǔn)確稱取姜黃粉末200 mg，加入70%乙醇3 mL，超聲50 min，重復(fù)提取3次，合并提取液，離心分離取上清液。吸取0.5 mL濾液，用甲醇定容至5 mL棕色容量瓶混勻，得到供試品溶液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取姜黃素對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度混勻。取20 μL溶液過0.22 μm濾膜后按“2.1.1”中色譜條件進(jìn)樣3次，記錄峰面積。以姜黃素對照品溶液濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)x，平均峰面積（A）為縱坐標(biāo)y標(biāo)繪制姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=186 347x-41 625，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，在0.56～7.28 μg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液20 μL連續(xù)進(jìn)樣10次，姜黃素峰面積RSD為1.18%，表明試驗(yàn)儀器精密度良好。

2.1.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，置于室溫環(huán)境中，分別于0、1、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定，計(jì)算得到姜黃素峰面積RSD為0.72%，說明該供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液6份，按照“2.1.1”中的色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果姜黃素峰面積RSD為1.25%，說明該試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.1.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知姜黃素含量的提取液6份，分別加入姜黃素對照品溶液，混勻后按照“2.1.1”中色譜條件進(jìn)樣測定，加樣回收率=（測得量-樣品含量）/加入量，具體結(jié)果見表1。

2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定考察因素為乙醇濃度（A）、時(shí)間（B）、液固比（C），采用Design-Expert軟件的星點(diǎn)設(shè)計(jì)模塊設(shè)計(jì)出三因素五水平的實(shí)驗(yàn)方案，因素設(shè)計(jì)見表2。精密稱取姜黃粉末200 mg，按照表1的條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，提取率%=（A為吸光度，a、b為標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)，V為濾液總體積、F為稀釋倍數(shù)、M為姜黃粉末質(zhì)量），姜黃素的提取率見表3。

2.2.2 模型建立及方差分析

采用Design-Expert 8.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合得到回歸方程：Y=3.64-0.079A+0.063B+0.022C+2.204A×10-3-0.02AC-0.035BC-0.05A2-3.64B2×10-3-0.072C2，對該方程進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表4。

方差分析中，回歸模型的P < 0.01，R2=0.9769，表明該模型有較高的可信度；失擬項(xiàng)F=0.96，P=0.5173，失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型能夠較好且誤差較小地反映響應(yīng)值的變化。顯著性檢驗(yàn)中，三種因素A、B、C對姜黃素的得率都有極顯著影響（P < 0.01）；各因素交互作用中B、C項(xiàng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有極顯著影響（P < 0.01），A、C項(xiàng)有顯著影響（P < 0.05），A、B項(xiàng)對試驗(yàn)結(jié)果無顯著性影響。

2.2.3響應(yīng)曲面分析及參數(shù)優(yōu)化驗(yàn)證

采用Design-Expert 8.0繪制提取液中姜黃素含量的響應(yīng)曲面圖，如圖2～4。響應(yīng)曲面圖可以分析提取條件的交互作用、確定最佳工藝，通過軟件中優(yōu)化（optimizion）模塊對參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化得到最優(yōu)值?；貧w模型預(yù)測姜黃素最高的得率為3.732%，這時(shí)的乙醇濃度為70.89%，提取時(shí)間為49.87 min，液固比為15.07∶1。按照最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為方便操作令乙醇濃度為70%，超聲時(shí)間為50 min，液固比為15∶1。5次平行實(shí)驗(yàn)總姜黃素得率實(shí)測平均值為3.715%，標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.53%，表明實(shí)際值與理論預(yù)測值基本吻合，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法得到的提取參數(shù)準(zhǔn)確可靠，該模型具有良好的預(yù)測性。

3討論

姜黃素的提取易受多種因素的影響，例如提取時(shí)間、提取溫度和溶液組成等，如何達(dá)到最佳提取條件，盡可能提高得率，是研究者們關(guān)心的問題。目前對姜黃素的工藝優(yōu)選主要為正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)[17-18]，然而當(dāng)因素水平較多時(shí)會產(chǎn)生極大工作量，且存在精確度不高、預(yù)測性不好等缺點(diǎn)。星點(diǎn)設(shè)計(jì)是效應(yīng)面優(yōu)化法的一種，它集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)為一體，是多因素五水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，具有試驗(yàn)次數(shù)少，試驗(yàn)精度高等特點(diǎn)，在藥學(xué)應(yīng)用上成果顯著[19]。需要注意的是，為避免由考察區(qū)域距離最優(yōu)區(qū)域過遠(yuǎn)而造成最佳工藝的偏差[20]，星點(diǎn)設(shè)計(jì)各因素水平的選取范圍及最優(yōu)中心點(diǎn)的確定應(yīng)建立在前期的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上。

經(jīng)過最初的單因素考察，優(yōu)選出姜黃素提取中的影響因素及范圍，本試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)在于能夠充分考慮各因素之間的交互作用。數(shù)據(jù)模型采取二次多項(xiàng)式進(jìn)行擬合，二項(xiàng)式模型的擬合相關(guān)系數(shù)高，5次平行試驗(yàn)平均值與最優(yōu)條件下理論值基本吻合，說明該模型的可信度和預(yù)測性良好，能夠?qū)S素的提取進(jìn)行較為準(zhǔn)確的分析和預(yù)測，從而為提取工藝的優(yōu)選和進(jìn)一步實(shí)際應(yīng)用提供參考依據(jù)。

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（收稿日期：2016-08-05 本文編輯：王紅雙）