牡荊苷對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠抗氧化酶的影響

顏娟　鄭茂東　崔玉環(huán)　趙虹琇　趙秀花　班旭霞

[摘要] 目的 研究牡荊苷對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠抗氧化酶的作用及機(jī)制。 方法 雄性昆明種小鼠70只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、牡荊苷組（10、20、40 mg/kg）、尼莫地平組（0.6 mg/kg），采用線栓法制備腦缺血再灌注模型，牡荊苷組在缺血再灌注前連續(xù)腹腔給予牡荊苷3 d，缺血再灌注后，每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d，檢測小鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分，采用試劑盒法檢測腦組織、血清中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、髓過氧化物酶（MPO）的活性。 結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著升高（P < 0.01）；與模型組比較，牡荊苷組神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著降低（P < 0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組腦組織、血清中MDA含量、MPO活性顯著升高，SOD、GSH-Px、CAT活性顯著降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與模型組比較，尼莫地平組和牡荊苷組腦組織、血清中MDA含量、MPO活性顯著降低，SOD、GSH-Px、CAT活性顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。與尼莫地平組比較，10、20 mg/kg牡荊苷組MDA含量和MPO活性顯著上升，SOD、GSH-Px、CAT活性顯著降低（P < 0.05）；40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 牡荊苷對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能通過抗氧化作用來實(shí)現(xiàn)。

[關(guān)鍵詞] 牡荊苷；腦缺血再灌注；抗氧化酶

[中圖分類號(hào)] R743.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）11（c）-0012-05

Effects of vitexin on antioxidant enzymes in cerebral ischemia-reperfusion injury mice

YAN Juan1 ZHENG Maodong1 CUI Yuhuan2 ZHAO Hongxiu1 ZHAO Xiuhua1 BAN Xuxia1

1.Department of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Hebei North University， Hebei Province， Zhangjiakou 075000， China； 2.Department of Geriatrics， the First Affiliated Hospital of Hebei North University， Hebei Province， Zhangjiakou 075000， China

[Abstract] Objective To study the effects and mechanism of vitexin on antioxidant enzymes in cerebral ischemia-reperfusion injury mice. Methods Seventy Kunming male mice were randomly divided into the normal control group， sham group， model group， vitexin group （10， 20， 40 mg/kg） and Nimodipine group （0.6 mg/kg）. Mice were prepared with cereral ischemia-reperfusion injury by suture method. Vitexin was intraperitoneally injected three days before cerebral ischemia， after ischemia-reperfusion， mice were given drugs once daily for seven consecutive days， then neurological deficits were determined. The contents of malondialdehyde （MDA）， the activities of superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， and myeloperoxidase （MPO） in brain tissue and serum were determined by the kits methods. Results Compared with sham group， the neurological score was remarkably increased in model group （P < 0.01）； compared with model group， the neurological scores in vitexin group were significantly decreased （P < 0.01）. Compared with sham group， the content of MDA and the activity of MPO in model group were increased， the activities of SOD， CAT， GSH-Px in brain tissue and serum were reduced， the differences were all highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with model group， the content of MDA and the activity of MPO of brain tissue and serum in Nimodipine group and vitexin group were decreased， the activities of SOD， CAT， GSH-Px were strengthened， the differences were statistically significant （P < 0.01 or P < 0.05）. Compared with Nimodipine group， the content of MDA and the activity of MPO in 10， 20 mg/kg of vitexin group were increased， the activities of SOD， CAT， GSH-Px were reduced （P < 0.05）， there were no significant differences between 40 mg/kg of vitexin group and Nimodipine group （P > 0.05）. Conclusion Vitexin against cerebral ischemia-reperfusion injury might through its anti-oxidative effect.

[Key words] Vitexin； Cerebral ischemia-reperfusion； Antioxidant enzymes

隨著我國社會(huì)步入老齡化階段，腦血管疾病成為影響老年人生活質(zhì)量的常見疾病，其中缺血性腦血管病最為常見，在其康復(fù)治療中，首要恢復(fù)缺血區(qū)的血流供應(yīng)，但隨之而來的再灌注損傷也不能忽視。有多種發(fā)病機(jī)制參與腦缺血再灌注損傷過程，如氧化應(yīng)激[1]、能量耗竭[2]、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[3]等，其中氧化應(yīng)激是缺血再灌注損傷的重要機(jī)制，再灌注后導(dǎo)致反應(yīng)性氧自由基過多，抗氧化酶不能清除體內(nèi)過量自由基，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及凋亡[4]，損傷腦組織正常功能，如何清除腦內(nèi)自由基成為治療缺血再灌注損傷的方法。牡荊苷是抗氧化活性較強(qiáng)的黃酮類化合物，牡荊苷是金蓮花中主要藥效成分，金蓮花具有消腫明目、清熱解毒的功效，臨床上主要用于扁桃體炎、中耳炎及急性結(jié)膜炎、上呼吸道感染等[5]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，牡荊苷具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性[6]。本研究探討牡荊苷對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織、血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

昆明種小鼠70只，雄性，體重（22±2）g，2月齡，由河北北方學(xué)院（以下簡稱“我?！保﹦?dòng)物中心提供，自由飲水，室溫（22.0±1.0）℃，濕度40%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：XCYK（冀）2010-2014。該方案經(jīng)我校動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。牡荊苷由我校藥物研究室提供，純度>98%；SOD、MDA、CAT、MPO、GSH-Px測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 牡荊苷溶液的配制[7] 用N，N-二甲基甲酰胺溶解牡荊苷，加入吐溫-80助溶，充分振蕩混勻后，加入生理鹽水，其比例為：N，N-二甲基甲酰胺∶吐溫-80∶生理鹽水= 1∶1∶20。

1.2.2 分組及模型制備 將70只小鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、牡荊苷（10、20、40 mg/kg）組、尼莫地平組（0.6 mg/kg），每組10只。小鼠稱重后，采用3.5%水合氯醛（10 mL/kg）進(jìn)行腹腔麻醉，仰臥位固定于小鼠手術(shù)臺(tái)上，按照文獻(xiàn)[8]的方法制備腦缺血再灌注小鼠模型，并于術(shù)后48 h阻斷兩側(cè)頸總動(dòng)脈造成大腦缺血狀態(tài)，5 min后恢復(fù)血液再灌注。假手術(shù)組手術(shù)過程與缺血再灌注組一致，但只暴露頸總動(dòng)脈，血管開口后，線栓僅僅插入開口處，不導(dǎo)致血流阻塞。牡荊苷組在術(shù)前連續(xù)腹腔給予牡荊苷3 d，缺血再灌注后，每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d。實(shí)驗(yàn)過程中小鼠的肛溫維持在（37.0±0.4）℃，均不應(yīng)用抗生素。動(dòng)物如有死亡，及時(shí)補(bǔ)充。

1.2.3 動(dòng)物模型的評(píng)價(jià) 成功標(biāo)準(zhǔn)：①身體明顯不對(duì)稱，步態(tài)不穩(wěn)；②在45℃坡度無力爬行；③小鼠從尾部懸起，前肢不對(duì)稱，肢體不運(yùn)動(dòng)；④前肢著于平面，提尾使后肢懸空，緩慢向一側(cè)轉(zhuǎn)圈，胡須對(duì)側(cè)反應(yīng)降低。

1.2.4 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 小鼠蘇醒后，觀察存活小鼠行為變化，于給藥7 d后采用雙盲法參考Clark評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分[9]（0～28分）。

1.2.5 取材和抗氧化酶指標(biāo)檢測 給藥7 d后，腹主動(dòng)脈取血5 mL，用肝素抗凝，放入離心管中，4℃，11 000 r/min，離心10 min，吸取上清液放入冰箱中待測，再立即處死動(dòng)物，放置于冰上，取出缺血側(cè)腦組織，除去樣本表面凝血等附屬物，再經(jīng)預(yù)冷生理鹽水沖洗后，濾紙吸干表面水分，加9倍冰冷無菌的生理鹽水制成10%的腦勻漿，4000 r/min離心10 min，吸取上清液放入冰箱中待測。上述血清和組織樣本依次按照試劑盒方法測定SOD、CAT、GSH-Px、MPO活性和MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牡荊苷對(duì)腦損傷小鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分的影響

正常對(duì)照組與假手術(shù)組神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與模型組比較，尼莫地平組和牡荊苷組（10、20、40 mg/kg）神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。10、20 mg/kg牡荊苷組神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯高于尼莫地平組（P < 0.05）；40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

與假手術(shù)組比較，**P < 0.01；與模型組比較，##P < 0.01；與尼莫地平組比較，△P < 0.05

圖1 牡荊苷對(duì)腦損傷小鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分的影響（n = 10）

2.2 牡荊苷對(duì)腦損傷小鼠MDA含量和MPO活性的影響

正常對(duì)照組與假手術(shù)組小鼠血清和腦組織中MDA含量和MPO活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清和腦組織中MDA含量和MPO活性顯著增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與模型組比較，尼莫地平組和牡荊苷組血清和腦組織中MDA含量和MPO活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。與尼莫地平組比較，10、20 mg/kg牡荊苷組MDA含量和MPO活性顯著上升（P < 0.05）；40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)果提示，牡荊苷組可降低小鼠血清中MDA含量和MPO活性，以牡荊苷組（40.0 mg/kg）作用最為明顯。見表1～2。

2.3 牡荊苷對(duì)腦損傷小鼠抗氧化酶活性的影響

正常對(duì)照組與假手術(shù)組小鼠血清和腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組血清和腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與模型組比較，尼莫地平組和牡荊苷組血清和腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。與尼莫地平組比較，10、20 mg/kg牡荊苷組SOD、GSH-Px、CAT活性顯著降低（P < 0.05），40 mg/kg牡荊苷組與尼莫地平組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)果提示，牡荊苷組可增強(qiáng)小鼠血清和腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性，以牡荊苷組（40.0 mg/kg）作用最為顯著。見表1～2。

3 討論

腦缺血再灌注損傷過程中氧化應(yīng)激損傷、自由基損傷、氧化劑過剩、解毒系統(tǒng)失活、抗氧化劑不足等多種因素相互作用、相互影響[10]，每一環(huán)節(jié)發(fā)生變化都影響腦組織中抗氧化防御系統(tǒng)的正常功能[11]。因此，在腦缺血再灌注損傷治療中抗氧化應(yīng)激藥物研究非常廣泛[12]。大量的氧自由基進(jìn)攻細(xì)胞內(nèi)各種酶以及細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、RNA、DNA的交聯(lián)，引起生物膜裂解，最終導(dǎo)致酶失活性、蛋白質(zhì)變性以及神經(jīng)元死亡或凋亡[13]。腦缺血再灌注時(shí)，雖然可緩解腦的缺血缺氧狀態(tài)，但與此同時(shí)也產(chǎn)生過量自由基，而體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)清除能力未大幅度提高，使自由基大量聚集，進(jìn)一步加重腦組織損傷[14]。

機(jī)體內(nèi)存在兩類抗氧化系統(tǒng)：一種為酶抗氧化系統(tǒng)，包括SOD、CAT、GSH-Px酶等；另外一種為非酶抗氧化系統(tǒng)，包括維生素、微量元素硒等。在正常生理?xiàng)l件下氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物主要為MDA，其含量可直接反映脂質(zhì)過氧化的程度、氧自由基水平、血管損傷程度[15]。SOD是一類金屬酶，分為Mn-SOD、Cu.Zn-SOD與Fe-SOD可清除自由基，阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，在正常條件下，內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的SOD可特異性清除O2-，使O2-發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2和O2，減少O2-毒性作用[16]。GSH-Px催化H2O2分解，特異性催化還原型谷胱甘肽對(duì)H2O2的還原反應(yīng)，起保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整和功能完整的作用[17]。CAT能夠?qū)⒋罅縃2O2分解成水和分子氧，或催化H2O2被供氫體分子所提供的O2-還原，阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一級(jí)引發(fā)作用，使機(jī)體減少有機(jī)氫過氧化物損傷[18]。因此，SOD、GSH-Px、CAT活力的高低反映了機(jī)體清除自由基的能力。MPO是主要存在于中性粒細(xì)胞，由中性粒細(xì)胞分泌的血紅素蛋白酶，是中性粒細(xì)胞激活與功能的標(biāo)志。MPO中性粒細(xì)胞移動(dòng)到炎癥部位，釋放出MPO、氧自由基、彈性蛋白酶，產(chǎn)生氮自由基[19]。MPO功能包括殺滅、吞噬細(xì)胞內(nèi)微生物，也可被釋放到細(xì)胞外，破壞腫瘤細(xì)胞、毒素、細(xì)胞、血小板等，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)[20]。腦缺血再灌注損傷過程是一個(gè)復(fù)雜的過程，自由基大量增加，攻擊不飽和雙鍵，由于自由基防御功能減弱，進(jìn)而自由基與抗自由基酶之間平衡失調(diào)，將使腦組織更易受到自由基的攻擊，破壞血腦屏障、血管通透性，加重腦水腫和神經(jīng)元損害。

本研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷后小鼠腦組織和血清中SOD、CAT、GSH-Px活性明顯降低，MDA含量和MPO活性增加，牡荊苷能顯著增強(qiáng)模型組小鼠腦組織和血清中SOD、CAT、GSH-Px活性，降低MDA含量和MPO活性，表明腦缺血再灌注損傷后氧化產(chǎn)物顯著增加，清除自由基的主要活性酶活性顯著下降，抗氧化能力降低；牡荊苷可減少自由基的產(chǎn)生，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，表現(xiàn)出良好的抗氧化損傷作用。

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（收稿日期：2016-08-19 本文編輯：張瑜杰）