不同養(yǎng)殖環(huán)境中的中華絨螯蟹組織抗氧化劑水平和抗氧化酶活力

葉桂煊　王禹　李翔　潘國(guó)峰

摘要：對(duì)不同養(yǎng)殖環(huán)境中的中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）肝胰臟、鰓中進(jìn)行總抗氧化能力（TAC）、丙二醛（MDA）含量、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）活性的測(cè)定。結(jié)果表明不同養(yǎng)殖環(huán)境中，中華絨螯蟹的肝胰臟和鰓中MDA含量呈顯著性差異（P<0.05），分別為：肝胰臟：8.74±3.37（牛山湖），18.28±5.45（牛山池塘）；鰓：2.31±0.41（牛山湖），3.46±0.80（牛山池塘）。在中華絨螯蟹鰓的測(cè)定中CAT活性呈顯著性差異（P<0.05）分別為：453.24±143.97（牛山湖），231.16±49.05（牛山池塘）。但其它生理生化指標(biāo)均無(wú)顯著性差異。說(shuō)明不同養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)中華絨螯蟹體內(nèi)MDA影響較明顯，可通過(guò)測(cè)定MDA的值來(lái)選擇適合的養(yǎng)殖環(huán)境。

關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹；抗氧化劑；抗氧化酶；養(yǎng)殖環(huán)境

活性氧（ROA）的產(chǎn)生是需氧生物生命活動(dòng)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物及其衍生的含氧物質(zhì)[1]。分子如過(guò)氧化氫（H2O2），超氧陰離子（O2-·）和氫氧自由基（HO·） 通過(guò)氧化代謝途徑對(duì)能源的產(chǎn)生形成非常有效的副作用。在哺乳動(dòng)物中，據(jù)估計(jì)，幾乎1%～4%的總耗氧量（OC）轉(zhuǎn)換成O2-·及H2O2[2]。產(chǎn)生的活性氧，必須被阻止或分解，以避免氧化損傷幾種高分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)，脂類(lèi)和DNA），這任務(wù)由抗氧化系統(tǒng)完成[3]。機(jī)體內(nèi)的抗氧化體系包括抗氧化酶體系和抗氧化物質(zhì)體系，通過(guò)清除活性氧及其自由基、分解過(guò)氧化產(chǎn)物，阻斷過(guò)氧化鏈和除去起催化作用的金屬離子這三個(gè)途徑來(lái)保持體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡[4]。

器官組織中的總抗氧化能力是反映機(jī)體抗氧化作用的重要指標(biāo)之一，而超氧化物歧化酶（SOD）作為機(jī)體關(guān)鍵性抗氧化酶，對(duì)生物體體內(nèi)氧化與抗氧化平衡起著重要的作用。此酶可催化超氧陰離子自由基（O2-·）發(fā)生歧化反應(yīng)，從而保護(hù)機(jī)體免受自由基的侵害。丙二醛（MDA）是由自由基與生物膜中的脂類(lèi)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，形成的氧化終產(chǎn)物，是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，可通過(guò)MDA的量了解膜脂過(guò)氧化程度，間接反映膜系統(tǒng)受損程度。過(guò)氧化氫酶（CAT）可分解化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧氫氧自由基（HO·），后者幾乎可以與細(xì)胞內(nèi)的一切有機(jī)物進(jìn)行反應(yīng)，并且反應(yīng)速率快、對(duì)細(xì)胞損害極大，因此對(duì)CAT的測(cè)定就有其重要意義。谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）是一組多功能的同工酶，具有解毒的作用，亦有清除自由基的作用。

總抗氧化能力和上述抗氧化物質(zhì)的研究在人、高等動(dòng)物和植物中已有較多報(bào)道[5-7]，而在甲殼動(dòng)物中研究較少。中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），俗稱河蟹，是一類(lèi)淡水養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在養(yǎng)殖過(guò)程中，由于水體污染、低溫、低鹽和其它環(huán)境因子的變化，會(huì)使其體內(nèi)自由基水平不斷變化，從而需要體內(nèi)抗氧化體系的不斷作用，來(lái)維持體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡。本實(shí)驗(yàn)研究了不同養(yǎng)殖環(huán)境中的中華絨螯蟹組織抗氧化劑水平和抗氧化酶活力，以期為中華絨螯蟹的健康養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用中華絨螯蟹采于湖北牛山湖和牛山池塘兩采樣點(diǎn)，每點(diǎn)10只，選擇體色鮮亮，無(wú)病無(wú)傷，附肢齊全的蟹用于實(shí)驗(yàn)。

在采樣的同時(shí)對(duì)牛山湖和牛山池塘兩處水質(zhì)進(jìn)行了簡(jiǎn)單的測(cè)定，從表1可以看出，牛山湖與牛山池塘水質(zhì)差異并不顯著。

1.2樣品制備

1.2.1 取材 從每個(gè)采樣點(diǎn)隨機(jī)抽取5只河蟹，分別取每只蟹的鰓、肝胰臟，置于-78 ℃冰箱保存。

1.2.2 器官組織勻漿 保存的器官組織用電子天平稱取，加入9倍生理鹽水進(jìn)行冰浴勻漿，在4 ℃，3 500 r/min條件下離心10 min，取上清液備用。

1.3 測(cè)定方法

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定，具體方法參照試劑盒說(shuō)明，單位為g/L。蛋白含量的測(cè)定為其它生理生化指標(biāo)的計(jì)算提供依據(jù)。

總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）、過(guò)氧化氫酶（CAT）的測(cè)定方法按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

組織勻漿中T-AOC單位定義：在37 ℃時(shí)，每毫克組織蛋白每分鐘使反應(yīng)體系吸光度（OD）值增加0.01時(shí)，記為一個(gè)總抗氧化能力單位，單位為U/mg蛋白。SOD活力單位定義：在每毫升反應(yīng)液中，每毫克組織蛋白使SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD值為一個(gè)SOD活力單位，單位為U/mg蛋白。MDA單位為nmol/mg蛋白。GST活力單位定義：在37 ℃時(shí)，每分鐘每毫克組織蛋白扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個(gè)活力單位，單位為U/mg蛋白。CAT單位定義：每克組織蛋白中過(guò)氧化氫酶（CAT）每分鐘分解吸光度為0.50～0.55的底物中的過(guò)氧化氫相對(duì)量為一個(gè)過(guò)氧化氫酶的活力單位，單位為U/g蛋白。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)STATISTCA（Version6.0）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，采用獨(dú)立性t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行差異性分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 中華絨螯蟹肝胰臟中各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定

從表2可以看出不同養(yǎng)殖環(huán)境中，中華絨螯蟹肝胰臟中的各項(xiàng)抗氧化指標(biāo)有一定的差異。統(tǒng)計(jì)分析表明，中華絨螯蟹肝胰臟中的T-AOC、SOD、GST、CAT均無(wú)顯著性差異（P>0.05），而MDA表現(xiàn)出顯著性差異（P<0.05）。

2.2 中華絨螯蟹鰓中各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定

從表3可以看出不同養(yǎng)殖環(huán)境中，中華絨螯蟹鰓中的各項(xiàng)抗氧化指標(biāo)有一定的差異。統(tǒng)計(jì)分析表明，中華絨螯蟹鰓中的T-AOC、SOD、GST均無(wú)顯著性差異（P>0.05），而MDA、CAT表現(xiàn)出顯著性差異（P<0.05）。

3 討論

SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，可催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)從而保護(hù)機(jī)體免受傷害，所以機(jī)體內(nèi)SOD活性反映組織器官的抗氧化能力[4]。自由基對(duì)機(jī)體的攻擊力很強(qiáng)，它最易破壞生物膜中的脂類(lèi)物質(zhì)引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[8-9]，而MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，因此MDA的高低可以間接反應(yīng)出機(jī)體受到自由基攻擊的損傷程度[10]。CAT可催化H2O2分解無(wú)害的氧和水，而H2O2是由SOD清除O2-·所產(chǎn)生的，所以CAT是生物體內(nèi)抗氧化體系的關(guān)鍵酶之一[11]。GST是生物體內(nèi)主要的抗氧化酶，在保護(hù)細(xì)胞膜免受過(guò)氧化損傷中具有特殊而重要的意義，其活力大小可體現(xiàn)出活性氧自由基的積累和對(duì)細(xì)胞膜損傷的程度[12]。T-AOC可反映機(jī)體自由基代謝狀態(tài)和機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的工作能力，由于T-AOC具有很強(qiáng)的代表性，所以是機(jī)體反映體內(nèi)組織抗氧化功能的一個(gè)良好指標(biāo)[13]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同環(huán)境中，所測(cè)定的中華絨螯蟹組織抗氧化水平和抗氧化酶活力不同，其中T-AOC、SOD、GST無(wú)顯著性差異（P>0.05），其原因可能是由于環(huán)境因素差異不大造成的。而且健康的機(jī)體其抗氧化水平維持在一定范圍內(nèi)，也不容易出現(xiàn)顯著性差異。在中華絨螯蟹肝胰臟和鰓中各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定顯示MDA表現(xiàn)出顯著性差異（P<0.05）。牛山池塘中中華絨螯蟹組織中MDA含量高于牛山湖中華絨螯蟹組織中MDA含量，說(shuō)明牛山池塘中中華絨螯蟹組織中脂質(zhì)過(guò)氧化的程度高、機(jī)體細(xì)胞損傷大，這可能是由于其他抗氧化酶活性低造成的，而測(cè)定結(jié)果剛好反映出這點(diǎn)。由于MDA含量受環(huán)境等諸多因素的影響，本實(shí)驗(yàn)無(wú)法確定出哪一種具體的因素造成MDA表現(xiàn)出顯著性差異，尚需更加深入的研究和比較。

許多外國(guó)學(xué)者研究證明自由基是造成衰老的重要因素之一[14]。隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體清除自由基的能力降低，脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）增加[15]。丙二醛（MDA）由氧化物酶分解LPO產(chǎn)生，可與磷脂酰乙醇胺交聯(lián)在細(xì)胞內(nèi)合成脂褐素沉淀，使細(xì)胞老化[16]。而Vc、VE是可以降低LPO脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的天然抗氧化劑[17]。所以MDA表現(xiàn)出的顯著性差異可能和環(huán)境或餌料中的Vc、VE等抗氧化物質(zhì)的差異有關(guān)。

CAT活性測(cè)定在鰓中表現(xiàn)出顯著性差異，而在干胰臟中卻沒(méi)有表現(xiàn)，這可能是與不同組織的組成和功能的不同有關(guān)。鰓呼吸過(guò)程中產(chǎn)生的大量超氧陰離子自由基主要靠SOD清除[18]，而SOD清除過(guò)量的O2-·所帶來(lái)的過(guò)量的H2O2需要CAT消除，出現(xiàn)的顯著性差異也可能是個(gè)體呼吸系統(tǒng)差異或損傷造成的。劉曉玲等研究表明CAT活性在飼料中添加Vc后有所降低，機(jī)體內(nèi)H2O2水平受到Vc的調(diào)節(jié)和影響[19]。說(shuō)明非酶促反應(yīng)體系對(duì)酶促反應(yīng)體系的活性有所影響，所以CAT表現(xiàn)出的顯著性差異可能受到環(huán)境中抗氧化物質(zhì)因素的影響。

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Abstract：This paper studied the effect of the different farming environment on the total antioxidant capacity （TAC）， Malondialdehyde （MDA） content， catalase （CAT）， superoxide dismutase Superoxide dismutase （SOD）， glutathione-S-transferase （GST） activity in hepatopancreas and gill of Chinese mitten crab （Eriocheir sinensis）. The results showed that between two culture sites with the different environment， the Chinese mitten crab stem and gills in the pancreas MDA content was significantly different （P<0.05）， respectively： hepatopancreas： 8.74 ± 3.37 （Niushan Lake）， 18.28 ± 5.45 （Niushan pond）； Gill： 2.31 ± 0.41 （Niushan Lake）， 3.46 ± 0.80 （Niushan pond）. In the determination of the Chinese mitten crab gill CAT activity was significantly different （P<0.05）， respectively： 453.24 ± 143.97 （Niushan Lake）， 231.16 ± 49.05 （Niushan pond）. However， other physiological and biochemical indicators there were no significant difference. Note different culture environment on the Chinese mitten crab in a significant impact on MDA， the MDA can be of value to choose the suitable breeding environment.

Key words：Chinese mitten crab （Eriocheir sinensis）； Antioxidants； Antioxidant enzymes； Rearing environment