[CX2]NaCl脅迫對萌發(fā)期甜高粱和春小麥生理生化特性的影響

劉海波+魏玉清+周維松++鄒程

摘要：以甜高粱品種M81-E和春小麥品種寧春42號為試驗材料，研究水培條件下5種不同濃度NaCl脅迫（0、50、100、150、200 mmol/L）對萌發(fā)期甜高粱和春小麥抗氧化酶SOD、POD、CAT、MDA、APX活性，研究有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量變化的影響。研究結(jié)果：（1）NaCl脅迫下甜高粱和春小麥脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)含量均隨鹽濃度升高而增加；（2）MDA含量與鹽濃度和處理時間呈正相關(guān)，抗氧化酶活性隨鹽濃度升高呈先增加后降低的趨勢，表現(xiàn)為低鹽濃度促進、高鹽濃度產(chǎn)生抑制作用；（3）萌發(fā)早期甜高粱同工酶P5條帶消失、S3條帶出現(xiàn)，春小麥同工酶P6、S4、S5條帶出現(xiàn)、C1條帶消失；（4）甜高粱與春小麥相比，在低鹽（≤50 mmol/L）脅迫下甜高粱MDA、脯氨酸、可溶性糖含量與對照差異不顯著，抗氧化酶活性顯著高于對照。結(jié)果表明，NaCl脅迫下甜高粱、春小麥均能通過調(diào)整自身有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、保護酶活性來保證細胞膜的完整性，維持細胞正常代謝，其中甜高粱表現(xiàn)出較強的耐鹽性；同時在鹽脅迫早期，甜高粱主要通過調(diào)控POD、SOD基因表達來提高其耐鹽性，而春小麥主要通過POD、SOD、CAT基因表達來調(diào)控。

關(guān)鍵詞：甜高粱；春小麥；丙二醛；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)；抗氧化酶；同工酶

中圖分類號： S514.01；S512.1+20.1文獻標志碼：

土壤鹽漬化嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境，成為阻礙農(nóng)牧業(yè)快速發(fā)展的因素之一。鹽漬化土壤目前廣泛分布于全世界100多個國家和地區(qū)，中國是世界鹽堿地大國，各類鹽漬土面積約3.46×107 hm2，耕地鹽堿化面積7.6×106 hm2，約占總耕地面積的1/5。隨著干旱頻繁發(fā)生、化肥使用和灌溉農(nóng)業(yè)的發(fā)展，次生鹽堿地面積還在逐年擴大[1]。隨著我國工業(yè)化進程不斷發(fā)展，耕地資源日漸匱乏。鹽漬化土地作為潛在土地資源受到各國科學家的重視。甜高粱作為新興的糖料、飼料和綠色能源作物，具有抗旱、耐澇、耐鹽的優(yōu)良特性[2]，因此鹽堿地種植甜高粱得到大力推廣，為此研究甜高粱抗鹽性機制顯的十分重要。鹽脅迫降低土壤溶液水勢，對植物造成滲透脅迫，可引發(fā)膜質(zhì)過氧化作用，其中脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛（MDA）在體外影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性，MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性；植物體為克服吸水困難，可通過調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)如蛋白質(zhì)、可溶性糖、脯氨酸等調(diào)節(jié)細胞的滲透勢，維持細胞膜和細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；同時鹽脅迫對植物有明顯的毒害與脅變作用，使植物體內(nèi)活性氧自由基大量積累，破壞膜結(jié)構(gòu)，引起蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子變性，也能引起DNA結(jié)構(gòu)的定位損傷[3]。在長期進化過程中，為了適應(yīng)逆境脅迫，植物體形成了主要包括過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等重要保護酶的酶促防御體系，它們能有效清除活性氧自由基，對于保護植物免遭逆境傷害有重要作用[4-5]。同工酶是指催化功能相同而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的一組特異性蛋白質(zhì)，其酶譜差異主要由基因決定[6-7]。同工酶是基因表達的直接產(chǎn)物，具有較高的穩(wěn)定性，可以直觀地反映出品種間的基因差異，同工酶酶譜資料可作為物種鑒定以及研究植物分類、進化、遺傳與變異的重要指標[8-9]。同工酶不僅與個體發(fā)育有關(guān)，也與對不同環(huán)境條件的適應(yīng)抵抗能力有關(guān)。相關(guān)研究表明，植物在遭受逆境脅迫時，體內(nèi)一些酶的同工酶會發(fā)生變化[10]。

本試驗以甜高粱、春小麥為材料，對其萌發(fā)期鹽脅迫下丙二醛含量，有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量，抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性，抗氧化酶同工酶進行了比較研究，希望通過與春小麥的比較研究，鹽脅迫下甜高粱植株獨特的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化規(guī)律和抗氧化酶系統(tǒng)的響應(yīng)機制，為探索甜高粱耐鹽的生理生化機制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

選用耐鹽性甜高粱M81-E，遼寧省農(nóng)業(yè)科學院高粱研究中心提供；春小麥寧春42號，北方民族大學生物科學與工程學院提供。

1.2方法

1.2.1種子預(yù)處理選擇籽粒圓潤飽滿、成熟無病害、大小一致的甜高粱和春小麥種子，蒸餾水清洗數(shù)次，用10%的次氯酸鈉溶液消毒20 min，蒸餾水沖洗5次，25 ℃蒸餾水中黑暗浸種吸脹4 h。

1.2.2種子培養(yǎng)用蒸餾水將NaCl分別配制成4種不同鹽濃度溶液，分別為T1（50 mmol/L）、T2（100 mmol/L）、T3（150 mmol/L）、T4（200 mmol/L），以蒸餾水為對照。將吸脹后的種子置于放有2層濾紙直徑為12 cm的玻璃培養(yǎng)皿中。每個培養(yǎng)皿放置30粒種子，分別加入蒸餾水及4種不同濃度NaCl溶液10 mL，重復(fù)3次，置于人工氣候箱中培養(yǎng)催芽，晝—夜溫度為28 ℃—25 ℃，濕度60%，及時補充溶液。

1.3測定方法

1.3.1酶液的制取稱取0.5 g鮮葉，冰浴條件下加 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH值8.0，每100 mL內(nèi)含半胱氨酸0.073 g、維生素C 0.105 g、EDTA-Na2 0.075 g、甘油 10 mL、1 mol/L HCl 5.84 mL）2 mL，研磨至勻漿，然后在低溫冷凍離心機中4 ℃、13 000 r/min 離心20 min，上清液即為酶提取液。

1.3.2生理指標測定分別于萌發(fā)后3、5、7 d取胚芽進行各項指標的測定，重復(fù)3次。丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法；脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法；可溶性糖含量測定采用蒽酮法；超氧化物歧化酶活性測定采用氮藍四唑（NBT）光還原法，以抑制NBT光還原的50%作為一個酶活單位（U）；過氧化物酶活性測定采用愈創(chuàng)木酚顯色法，以每分鐘內(nèi)D470 nm變化為1個過氧化物酶活力單位（U）；過氧化氫酶活性測定采用紫外吸收比色法，以每分鐘內(nèi)D240 nm變化0.01為1個酶活力單位（U）；抗壞血酸過氧化物酶活性測定參考孫云的方法[11]，以每分鐘氧化1 μmol AsA的酶量作為1個酶活性單位（U）；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法。

1.3.3同工酶分析對萌發(fā)后3 d的甜高粱、春小麥胚芽采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進行同工酶分析，分離膠濃度CAT為7.5%，POD、SOD、APX為10%，濃縮膠濃度為3%。 SOD同工酶染色采用四氮哇藍（NBT）法[12]染色；POD同工酶染色采用聯(lián)苯胺法[12]染色；CAT同工酶染色采用淀粉法[13]染色；APX同工酶染色參考邵巍等的方法[14-15]。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計

凝膠板染色后立即照相，根據(jù)膠板計算遷移率，遷移率=固定染色后凝膠中酶蛋白區(qū)帶的遷移距離/固定染色中指示劑的遷移距離，然后根據(jù)記錄進行分析。

數(shù)據(jù)采用3個重復(fù)的“平均值±標準誤差”，采用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)分析，用Photoshop CS 2.0、GraphPad Prism 5.0 和 Microsoft Excel 2003進行數(shù)據(jù)處理與作圖。

2結(jié)果與分析

2.1NaCl脅迫對甜高粱、春小麥萌發(fā)期滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.1.1脯氨酸含量NaCl脅迫下甜高粱脯氨酸含量高于春小麥（圖1-A），說明萌發(fā)期甜高粱的耐鹽性強于春小麥。甜高粱脯氨酸含量隨鹽濃度升高呈增加的趨勢，低鹽濃度（50 mmol/L）脅迫下處理組與對照差異不顯著，中度、重度鹽（≥100 mmol/L）脅迫下處理組與對照間差異顯著；春小麥脯氨酸含量與甜高粱呈現(xiàn)不同的變化趨勢，春小麥在低鹽（50 mmol/L）脅迫下，脯氨酸含量高出對照108.93%～77627%，與對照差異顯著，表明低濃度鹽脅迫下甜高粱未受到傷害。

2.1.2可溶性糖含量NaCl脅迫下甜高粱、春小麥可溶性糖含量隨鹽濃度升高呈增加的趨勢（圖1-B），甜高粱在低鹽（50 mmol/L）脅迫下處理組與對照差異不顯著，中度、重度鹽（≥100 mmol/L）脅迫下，處理組與對照間差異顯著。春小麥低鹽（50 mmol/L）脅迫下，在脅迫前期處理后3 d處理組與對照差異不顯著，隨處理時間延長，脅迫后期處理后5～7 d處理組與對照差異顯著，表明低濃度鹽脅迫下甜高粱未受到傷害。

2.1.3可溶性蛋白質(zhì)含量NaCl脅迫下甜高粱、春小麥可溶性蛋白質(zhì)含量隨著處理時間的延長而逐漸降低（圖1-C），在脅迫后期處理后7 d，蛋白質(zhì)含量迅速下降，說明植株的正常代謝功能失調(diào)。與春小麥相比，甜高粱可溶性蛋白含量下降幅度較低，說明甜高粱可溶性蛋白的鹽敏感性較低。甜高粱和春小麥可溶性蛋白含量隨鹽濃度增加而逐漸升高，表明鹽脅迫顯著增加可溶性蛋白含量。

2.2NaCl脅迫對萌發(fā)期甜高粱、春小麥MDA含量的影響

NaCl脅迫下甜高粱、春小麥MDA含量均隨鹽濃度升高呈增加的趨勢（圖1-D）。低鹽濃度（50 mmol/L）脅迫下處理組與對照差異不顯著，而春小麥MDA含量顯著高于對照，說明輕度鹽脅迫下，甜高粱耐鹽性強于春小麥。在中度、重度鹽鹽濃度（≥100 mmol/L）脅迫下，隨著脅迫時間的延長，甜高粱和春小麥MDA含量與對照均差異顯著，說明隨著鹽濃度增加和脅迫時間的延長，甜高粱和春小麥膜透性受損嚴重，膜質(zhì)過氧化加劇，抗逆性下降。

2.3NaCl脅迫對甜高粱、春小麥萌發(fā)期抗氧化酶活性的影響

2.3.1POD活性NaCl脅迫下甜高粱和春小麥POD活性隨鹽濃度升高呈先增加后降低的趨勢（圖2-A），甜高粱低鹽濃度（50 mmol/L）脅迫下POD活性高出對照39.8%～161.0%，與對照差異顯著；春小麥低鹽濃度（50 mmol/L）脅迫與對照差異不顯著；在中度、重度鹽濃度（≥100 mmol/L）脅迫下，隨著脅迫時間的延長，甜高粱、春小麥處理組顯著低于對照，表明低鹽脅迫能顯著增加POD活性，高鹽濃度脅迫抑制POD活性，且甜高粱比春小麥響應(yīng)快。

2.3.2SOD活性NaCl處理下甜高粱、春小麥SOD活性隨鹽濃度升高而增加（圖2-B），甜高粱低鹽濃度（50 mmol/L）脅迫下CAT活性高出對照73.36%～171.12%，與對照差異顯著；春小麥低鹽濃度（50 mmol/L） 脅迫下與對照差異不顯著，表明鹽脅迫能顯著增加SOD活性，甜高粱比春小麥響應(yīng)較快。

2.3.3CAT活性NaCl處理下甜高粱、春小麥CAT活性隨鹽濃度增加呈先增加后降低的趨勢（圖2-C），甜高粱低鹽濃度（50 mmol/L）脅迫下CAT活性高出對照84.67%～14103%，與對照差異顯著，春小麥低鹽濃度（50 mmol/L）脅迫下高出對照13.72%～80.85%，與對照差異顯著；在中度、重度鹽（≥100 mmol/L）脅迫下，隨著脅迫時間的延長，甜高粱、春小麥處理組顯著低于對照，說明低濃度鹽脅迫顯著增加CAT活性，中度、重度鹽脅迫抑制CAT活性。

2.3.4APX活性NaCl處理下甜高粱、春小麥APX活性隨鹽濃度升高呈先增加后降低的趨勢（圖2-D），甜高粱低鹽濃度[JP3]（50 mmol/L）脅迫下APX活性高出對照27.56%～21305%，

與對照差異顯著；春小麥低鹽濃度（50 mmol/L）脅迫下，在脅迫初期處理后3～5 d高出對照135.76%～14333%，與對照差異顯著，脅迫后期處理7 d與對照差異不顯著；在中度、重度鹽濃度（≥100 mmol/L）脅迫下，隨著脅迫時間的延長，甜高粱、春小麥于脅迫后期處理 7 d 處理組顯著低于對照；表明低濃度鹽脅迫顯著增加APX活性，中度、重度鹽脅迫抑制APX活性。

2.4[JP3]NaCl脅迫對甜高粱、春小麥萌發(fā)期抗氧化酶同工酶的影響

對甜高粱、春小麥萌發(fā)第3天進行抗氧化同工酶測定，測定結(jié)果見圖3。在POD同工酶方面，甜高粱處理組P6、P7、P8、P9條帶與對照組比較色度加深，P5條帶色度隨處理濃度增加而變淺并逐漸消失；春小麥處理組P2、P3、P6條帶色度與對照組比較加深，并出現(xiàn)新條帶P9。在SOD同工酶方面，甜高粱處理組S2、S4條帶與對照組比較色度明顯加深，并出現(xiàn)新條帶S3；春小麥處理組S3條帶色度與對照組比較變深，并出現(xiàn)新的條帶S4、S5。在 CAT同工酶方面，甜高粱C1、C2條帶在（50 mmol/L）處理下色度最深、寬度最大；春小麥C1條帶在200 mmol/L處理下較對照顏色淺，C2條帶隨處理濃度增加逐漸消失。在APX同工酶方面，甜高粱A1條帶在 100 mmol/L 處理下色度最深，其他條帶與對照組比較變化不明顯；春小麥A1、A3條帶顏色隨鹽濃度增加呈先加深后變淺趨勢，在 100 mmol/L 處理下達最深。

3討論與結(jié)論

3.1NaCl脅迫下甜高粱、春小麥有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化特征

脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有維持細胞的滲透勢、防止細胞脫水、穩(wěn)定并保護生物大分子的結(jié)構(gòu)等功能，脯氨酸含量的增加是植物適應(yīng)鹽漬環(huán)境的特征之一[16]。本試驗結(jié)果表明，甜高粱、春小麥在NaCl脅迫下通過增加脯氨酸的含量來保持一定的含水量和膨壓，維持細胞的正常生理功能，且積累量與脅迫時間和脅迫程度有關(guān)，說明甜高粱、春小麥都能有效積累脯氨酸提高抗鹽能力；在低鹽濃度 （≤50 mmol/L） 脅迫下甜高粱脯氨酸含量與對照無顯著變化，表明正常生理未受到顯著影響，而春小麥已受到傷害，表明甜高粱耐鹽性強于春小麥。

可溶性糖是合成其他有機溶質(zhì)的碳架和能量來源，同時對細胞膜、原生質(zhì)膠體起穩(wěn)定作用，對酶類起保護作用[17]。可溶性糖主要在脅迫的中后期才開始積累，與其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)相比表現(xiàn)出一定的滯后性，但糖的物理化學性質(zhì)決定了它的滲透調(diào)節(jié)能力高于其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[18]。本試驗結(jié)果表明，甜高粱、春小麥在NaCl脅迫下可溶性糖含量升高，且在脅迫后期，處理后7 d不同處理組可溶性糖含量大量增加，表明長時間鹽分脅迫狀態(tài)下，可溶性糖在滲透調(diào)節(jié)中起主要作用；同時在低鹽濃度（≤50 mmol/L）脅迫下甜高粱脯氨酸含量與對照無顯著變化，表明甜高粱在低鹽濃度脅迫下正常生理未受到顯著影響。

可溶性蛋白含量的提高可幫助植物細胞保持較低的滲透勢來抵抗水分脅迫導(dǎo)致的傷害，可溶性蛋白含量的多少是衡量植物總代謝水平的重要指標之一[19-20]。本試驗結(jié)果與戴凌燕的研究結(jié)果[3]相一致，甜高粱、春小麥的可溶性蛋白含量隨著鹽脅迫程度的加劇呈增加的趨勢。說明在鹽脅迫初期植物體內(nèi)的可溶性蛋白增加以增強滲透調(diào)節(jié)能力，而在鹽脅迫后期，處理后7 d脅迫已超過其忍耐的閾值，其體內(nèi)蛋白酶活性增加，水解加快，鹽脅迫使RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯受到抑制，因而蛋白質(zhì)含量降低。

3.2NaCl脅迫下甜高粱、春小麥丙二醛含量和保護酶系統(tǒng)變化特征

鹽害不僅破壞植物細胞代謝，而且導(dǎo)致體內(nèi)生理功能發(fā)生改變，自由基增加引發(fā)膜質(zhì)過氧化作用，而膜質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物之一就是MDA，其含量多少可作為細胞膜質(zhì)損傷程度的參數(shù)和篩選植物抗逆品種的一個工具[21-22]。相關(guān)研究表明，鹽脅迫下植物細胞膜透性增加，耐鹽性較強的植物細胞膜穩(wěn)定性強，膜透性增加較少，所受傷害較低，而耐鹽性弱的植物則相反[23]。鹽脅迫下本試驗中甜高粱、春小麥MDA含量變化與姜慧等在甜高粱上的研究結(jié)論[24-26]相一致，表現(xiàn)為隨鹽脅迫程度增加而增加，說明鹽脅迫使細胞膜受到損傷，損傷程度與鹽處理濃度呈正相關(guān)；且在低鹽濃度 （≤50 mmol/L） 脅迫下甜高粱MDA與對照差異不顯著，表明甜高粱細胞膜質(zhì)未受到損傷，耐鹽性強于春小麥。

抗氧化酶是植物在逆境條件下防御自由基氧化損傷最重要的酶促系統(tǒng)[27]。SOD、CAT、POD、APX等是植物內(nèi)源的活性氧清除劑，在逆境脅迫下只有保持較高的酶活性才能有效地清除活性氧，減少其對膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞。當植物受鹽脅迫后，葉片中生成大量活性氧，SOD、CAT、POD、APX等抗氧化酶活性發(fā)生改變，在一定鹽濃度脅迫下POD活性的增加伴隨著CAT、SOD、APX增加或減少，表明抗氧化酶系統(tǒng)是相互協(xié)調(diào)的[28]。本試驗結(jié)果表明，甜高粱、春小麥SOD、CAT、POD、APX活性隨鹽濃度升高呈先增加后降低的趨勢，這與王秀玲等在甜高粱的研究結(jié)果[25]相一致。同時研究發(fā)現(xiàn)，在鹽處理后期，甜高粱、春小麥中SOD、CAT、POD、APX對鹽分脅迫的響應(yīng)不盡相同，在中度、重度鹽濃度（≥100 mmol/L）脅迫下CAT、POD、APX活性低于CK，而SOD活性高于CK，表明中度、重度鹽脅迫下甜高粱、春小麥細胞膜雖然受到一定損傷，但未超過SOD活性的忍耐限度，仍具有較高的活性來清除氧自由基。在低鹽濃度（≤50 mmol/L）脅迫下SOD、CAT、POD、APX活性均高于CK，說明甜高粱、春小麥在鹽脅迫下具有較好的清除活性氧能力，輕度鹽脅迫下主要靠4種抗氧化酶協(xié)同作用來清除自由基，共同抵御鹽害，在中度、高度鹽脅迫下主要靠SOD清除氧自由基。

3.3[JP3]NaCl脅迫下甜高粱、春小麥抗氧化酶基因表達的變化特征

同工酶作為基因表達的直接產(chǎn)物，具有很高的穩(wěn)定性，是植物體內(nèi)最活躍的酶之一，其合成和活性始終受到遺傳基因的控制和調(diào)節(jié)。逆境引起基因變異而使酶活性及其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致同工酶酶譜的變化[29]。本試驗結(jié)果，鹽脅迫下甜高粱、春小麥抗氧化酶同工酶的表達不盡相同，甜高粱同工酶P5條帶消失、S3條帶出現(xiàn)，表明甜高粱抗鹽害主要受POD、SOD基因表達進行調(diào)控；春小麥同工酶P6、S4、S5條帶出現(xiàn)、C1條帶消失，表明其抗鹽害主要受POD、CAT、SOD基因表達進行調(diào)控；說明鹽脅迫使原來的一些同工酶合成被阻抑或降解，同時可能活化了某些基因或增加了某些基因的表達，甚至誘導(dǎo)某些基因產(chǎn)生新的譜帶，預(yù)示著甜高粱、春小麥的抗鹽害受抗氧化酶基因表達調(diào)控，鹽脅迫濃度是抗鹽害基因啟動和增強的誘發(fā)因子。

綜上所述，甜高粱、春小麥萌發(fā)期生理生化特性與鹽脅迫關(guān)系密切，都能通過調(diào)整自身有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來保證植物正常所需水分；提高保護酶活性，從而有效防止活性氧對植株造成的傷害來保證正常細胞代謝；同時甜高粱幼苗在低鹽濃度脅迫下未受到傷害，對鹽脅迫不敏感，其耐鹽性強于春小麥。鹽脅迫早期，甜高粱主要通過調(diào)控POD、SOD基因表達來提高其抗鹽性，而春小麥主要通過調(diào)控POD、SOD、CAT基因表達。

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