麒麟尾總黃酮提取及其抗氧化作用研究

羅澤萍++潘立衛(wèi)

摘要：利用單因素試驗及正交試驗法考察麒麟尾（Epipremnum pinnatum）總黃酮提取的最佳工藝，并通過測定總黃酮對羥基自由基（·OH）和2，2-二（4-叔辛基）-1-苦肼基自由基（DPPH·）的清除作用研究其抗氧化性。結(jié)果表明，麒麟尾總黃酮提取的最佳工藝條件為超聲時間35 min、超聲溫度90 ℃、料液比1∶15（g∶mL）、乙醇體積分數(shù)85%，在此條件下總黃酮得率為3.04%；抗氧化試驗結(jié)果表明，麒麟尾總黃酮具有較強的抗氧化活性，對·OH和DPPH·自由基的IC50分別為2.355和0.143 mg/mL。

關(guān)鍵詞：麒麟尾（Epipremnum pinnatum）；總黃酮；提取工藝；抗氧化活性

中圖分類號：S567.7+9；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）18-4783-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.037

黃酮類化合物廣泛存在天然植物中，其具有多方面的藥理活性，如可以改善糖和脂代謝從而起到降血糖[1]、降血脂[2]的作用，還可以通過改善循環(huán)系統(tǒng)起到保護心肌[3]、降血壓[4]和抗心律失常[5]等作用，其他藥理作用還有保護肝臟[6]、鎮(zhèn)痛抗炎[7]、抗血栓[8]、抗氧化[9]和抗腫瘤[10]等。因此，研究和開發(fā)植物總黃酮成分和藥理活性具有重要意義。麒麟尾（Epipremnum pinnatum）藥性平、味苦、微辛，具有斂瘡排膿、舒筋活血、消腫止痛、清熱解毒等功效，主要用于感冒發(fā)熱、鼻衄、目赤腫痛、百日咳、跌打損傷、骨折、風(fēng)濕痹痛、痰火瘰疬、癰癤、毒蛇咬傷等[11，12]。目前，對麒麟尾的研究主要集中在園林景觀、資源分布和抗癌活性等[13-16]?；邝梓胛灿兄己玫拿耖g藥用基礎(chǔ)，而其藥理活性和化學(xué)成分的研究甚少，對總黃酮提取工藝和抗氧化活性的研究鮮見報道。本試驗以單因素試驗及正交試驗法考察麒麟尾總黃酮的提取工藝，并探討其總黃酮的抗氧化作用。旨在為深入研究和開發(fā)麒麟尾植物資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

麒麟尾采自廣西宜州市郊區(qū)，經(jīng)河池學(xué)院鄧晰朝副教授鑒定為天南星科麒麟葉屬麒麟尾。蘆丁標準品由河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院制藥工程實驗室提供，經(jīng)HPLC檢測，蘆丁含量>99%；DPPH由美國Sigma公司提供，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器設(shè)備：紫外可見分光光度計（美國Agilent公司）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；電子恒溫水浴鍋（北京泰克儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線繪制 配置蘆丁標準品溶液（含蘆丁0.20 mg/mL），精密吸取蘆丁標準品溶液0（空白）、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于10 mL容量瓶中，分別加入6、5、4、3、2、1 mL 70%乙醇，吸取0.3 mL亞硝酸鈉溶液（5%）加入容量瓶，輕輕搖勻，室溫靜置10 min，吸取0.3 mL三氯化鋁溶液（10%）加入容量瓶，輕輕搖勻，室溫靜置10 min，吸取2 mL氫氧化鈉（1 mol/L）溶液加入容量瓶后用70%乙醇定容至刻度，輕輕搖勻，室溫靜置10 min后測定吸光度（圖1），得回歸方程為y=0.402 5x+0.002 2（r2=0.999 1）。

1.2.2 總黃酮含量測定流程 麒麟尾洗凈瀝干→60 ℃下烘干→粉碎，過40目篩→稱取1.00 g→不同超聲時間、超聲溫度、料液比和乙醇體積分數(shù)進行提取→過濾，收集濾液→用無水乙醇定容至50 mL→移取1 mL→按“1.2.1”的方法測定吸光度→從回歸方程算得總黃酮含量→根據(jù)稱取的樣品量、稀釋倍數(shù)計算樣品中總黃酮的得率。

1.2.3 正交試驗 先對麒麟尾總黃酮得率影響較大的超聲時間、超聲溫度、料液比（g∶mL，下同）、乙醇體積分數(shù)進行單因素試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行正交試驗，因素與水平見表1。

1.2.4 總黃酮對·OH清除能力測定 在鄰二氮菲-金屬鐵離子-H2O2為反應(yīng)體系下進行試驗。具體操作如下：取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL 5個不同濃度的麒麟尾總黃酮溶液于刻度試管中，分別加入0.5 mL FeSO4（7.5 mmol/L）、0.75 mL鄰二氮菲（5.0 mmol/L）。再加入0.5 mL雙氧水（0.1%）后，用蒸餾水稀釋至5 mL刻度，把試管放入37 ℃水浴恒溫60 min，用紫外分光光度儀測定吸光度A1（536 nm），并設(shè)立空白組A2（蒸餾水代替樣品）和樣底組A0（蒸餾水代替雙氧水），重復(fù)3次，求平均值，以維生素C作為對照。清除·OH自由基計算公式：

清除率=（1-■）×100%

1.2.5 總黃酮對DPPH·自由基清除能力測定 取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 5個不同濃度的麒麟尾黃酮溶液0.5 mL于刻度試管中，加入2 mL DPPH（0.1 mmol/L）溶液后用蒸餾水稀釋至4 mL，輕輕搖勻，于37 ℃水浴恒溫靜置30 min，用紫外分光光度儀測定吸光度A2（520 nm），并設(shè)立樣底組A1（無水乙醇代替DPPH·溶液）和空白組A0（蒸餾水代替樣品溶液），重復(fù)3次，求平均值。測定結(jié)果以同等條件下的維生素C為對照，清除DPPH·自由基計算公式：

清除率=（1-■）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲時間 選擇超聲溫度為70 ℃、料液比1∶15和65%乙醇，以超聲時間對麒麟尾總黃酮得率做單因素試驗（圖2）。由圖2可知，超聲時間為15 min時麒麟尾總黃酮得率很少，可能是超聲時間短，總黃酮還沒完全被提取出來，當超聲時間過了35 min后，總黃酮得率開始下降，說明有效成分已經(jīng)基本被提取出來，所以總黃酮得率不再增加。

2.1.2 超聲溫度 選擇1∶15的料液比、65%的乙醇，固定超聲35 min，以超聲溫度對麒麟尾總黃酮做單因素試驗（圖3）。由圖3可知，在80 ℃之前，超聲溫度增加，總黃酮得率上升，成正相關(guān)關(guān)系，90 ℃比80 ℃黃酮得率低，說明溫度過高，會對總黃酮的有效成分結(jié)構(gòu)造成破壞，所以總黃酮得率不再增加。

2.1.3 料液比 固定超聲時間35 min、溫度80 ℃，選擇65%乙醇，以料液比對麒麟尾總黃酮做單因素試驗（圖4）。由圖4可知，隨著溶劑增加，總黃酮得率先升后降，料液比1∶20總黃酮得率最理想，說明該料液比有效成分提取已比較充分，不需要繼續(xù)增加提取液從而避免增加濃縮的時間和浪費提取液。

2.1.4 乙醇體積分數(shù) 固定超聲時間35 min、溫度80 ℃和料液比1∶20，以乙醇體積分數(shù)對麒麟尾總黃酮做單因素試驗（圖5）。由圖5可知，55%～95%的乙醇，總黃酮得率最高的是75%，說明75%乙醇溶出總黃酮的含量最高。

2.2 正交試驗結(jié)果

對超聲時間、超聲溫度、料液比和乙醇體積分數(shù)分別取3個水平進行正交試驗。正交試驗結(jié)果（表2）顯示，各因子對麒麟尾總黃酮得率均有影響，其大小順序為A>B>D>C，可見超聲時間是總黃酮得率的關(guān)鍵性因子。根據(jù)正交試驗結(jié)果得出最佳的麒麟尾總黃酮提取工藝組合為A2B3C1D3，取3次驗證試驗得A2B3C1D3總黃酮得率為3.04%。麒麟尾總黃酮提取最佳組合為超聲時間35 min、超聲溫度90 ℃、料液比1∶15、乙醇體積分數(shù)85%。

2.3 麒麟尾總黃酮對·OH的清除能力

結(jié)果顯示麒麟尾總黃酮有一定的清除·OH活性，其IC50為2.355 mg/mL。由圖6可知，麒麟尾總黃酮濃度越大，對·OH清除率越高，可見兩者存在良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，但清除·OH活性比同濃度的維生素C弱。

2.4 麒麟尾總黃酮對DPPH·自由基的清除能力

由圖7可知，麒麟尾總黃酮在低濃度下對DPPH·自由基有清除作用，其IC50為0.143 mg/mL，總黃酮溶液濃度增加，對DPPH·清除率越高，可見兩者成正相關(guān)關(guān)系。根據(jù)IC50可判斷，麒麟尾總黃酮DPPH·自由基清除能力>·OH自由基清除能力，但對兩種自由基的清除作用均弱于維生素C，可能是由于麒麟尾總黃酮中的抗氧化活性物質(zhì)純度比不上維生素C。

3 結(jié)論

總黃酮的提取方法有很多，如乙醇回流提取法、超聲提取法、微波提取法、超臨界提取法和超濾法等[17]，其中超聲提取法提取時間短、節(jié)約溶劑、提取完全，并且超聲提取在低溫下提取效果也很好。本試驗在單因素基礎(chǔ)上，結(jié)合超聲輔助提取，對超聲時間、超聲溫度、料液比和乙醇體積分數(shù)分別取3個水平進行正交試驗，優(yōu)化麒麟尾總黃酮的最佳工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲時間是總黃酮得率的關(guān)鍵性因子，麒麟尾總黃酮提取的最佳工藝條件為：超聲時間35 min、超聲溫度90 ℃、料液比1∶15、乙醇體積分數(shù)85%，在此條件下總黃酮得率為3.04%。該方法穩(wěn)定性好、省時、高效及節(jié)能。陳玉霞等[18]采用DPPH法研究41種中草藥抗氧化活性取得良好效果，認為這種方法評價藥物體外抗氧化作用不需要昂貴的儀器并且原理明確、操作簡便、易標準化。因DPPH法、清除·OH自由基法操作簡單快速，所以在實驗室應(yīng)用得比較廣泛。本試驗通過測定麒麟尾總黃酮對DPPH·、·OH自由基的清除作用，評價其抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)麒麟尾總黃酮清除自由基能力較強，可有效清除DPPH·、·OH自由基并呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，對·OH和DPPH·自由基的IC50分別為2.355和0.143 mg/mL。本研究可為深入研究麒麟尾總黃酮抗氧化作用機制與合理開發(fā)利用麒麟尾植物資源提供一定的理論依據(jù)。

參考文獻：

[1] 俞 浩，毛斌斌，周國梁，等.白背三七總黃酮對糖尿病大鼠的降血糖作用[J].食品科學(xué)，2013，34（15）：295-298.

[2] 雷燕妮.黃芩總黃酮對高血脂大鼠的降血脂作用研究[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2014，35（7）：64-68.

[3] 高蒙蒙.紅車軸草總黃酮對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞和心肌細胞損傷的保護作用及機制研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2013.

[4] 逄秀鳳.四種天然化合物抑制腫瘤血管生成及沙棘總黃酮降血壓作用的研究[D].上海：華東師范大學(xué)，2009.

[5] 何曉山，周寧娜，林 青，等.滇黃芩總黃酮抗心律失常作用的實驗研究[J].中國中藥雜志，2010，35（4）：508-510.

[6] 張?zhí)煳?鴉蔥精制總黃酮的制備及其保肝、抗乙肝病毒藥理活性的研究[D].長春：吉林大學(xué)，2015.

[7] 金 巖，黃 山，趙 磊，等.松生等總黃酮提取工藝及鎮(zhèn)痛抗炎作用研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，33（11）：1411-1415.

[8] 葉 勇，歐賢紅，黃秋潔，等.藤茶總黃酮及黃酮醇類化合物的抗血栓作用研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2013，24（1）：33-36.

[9] 吳曉寧，余陳歡，徐靜紅.烏蕨總黃酮體外抗氧化活性的研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，29（3）：292-294.

[10] 王 敏，賈正平，馬 駿，等.瑞香狼毒總黃酮提取物的抗腫瘤作用[J].中國中藥雜志，2005，30（8）：603-606.

[11] 中國科學(xué)院北京植物研究所.中國高等植物圖鑒（5）[M].北京：科學(xué)出版杜，1976.

[12] 吳征鎰.云南植物志[M].北京：科學(xué)出版社，2004.

[13] 陳紅偉.西雙版納的野生麒麟葉資源[J].中國野生植物資源，2001，20（2）：37.

[14] 許渝花，林利華，宗 樺，等.麒麟葉的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊，2009，45（1）：47-48.

[15] 黃威廉.天南星科植物族屬分類及地理分布[J].貴州科學(xué)，2014， 32（1）：1-9.

[16] 肖正春.麒麟葉治療癌癥[J].中國野生植物資源，1999，18（2）：42.

[17] 趙子龍，薛培鳳，倪佩東，等.天然藥物中總黃酮的提取工藝研究進展[J].內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，34（12）：513-516.

[18] 陳玉霞，劉建華，林 峰，等.DPPH法、FRAP法測定41種中草藥抗氧化活性[J].實驗室研究與探索，2011，30（6）：11-14.