復方健腎片的水提工藝研究

阿依古麗·穆太力普++++++祖里皮亞·塔來提++++++斯拉甫·艾白

[摘要] 目的 通過高效液相色譜法和紫外分光光度法對毛蕊花糖苷和總多糖進行含量測定，優(yōu)化復方健腎片的水提工藝條件，為復方健腎片的進一步研究奠定基礎(chǔ)。 方法 采用Waters C18 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相：甲醇-0.1%甲酸溶液（35∶65）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：330 nm處測定毛蕊花糖苷含量和以苯酚-硫酸法，在490 nm波長處測定總多糖含量。 結(jié)果 毛蕊花糖苷和總多糖分別10.4～104 μg/mL（r=0.9993，n=6），20～100 μg/mL（r=0.9995）范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。影響水提工藝各因素的作用主次為： A（提取次數(shù)）>B（提取時間）>C（溶劑用量），最佳提取工藝條件是A3B1C1，即用10倍量水，提取3次，每次1.5 h。 結(jié)論 本研究的含量測定方法符合要求，通過正交試驗設(shè)計優(yōu)選得到的復方健腎片的水提工藝條件穩(wěn)定可行。

[關(guān)鍵詞] 復方健腎片；毛蕊花糖苷；總多糖；正交設(shè)計；提取工藝

[中圖分類號] R917 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）09（a）-0030-05

[Abstract] Objective To optimize an HPLC and UV Spectrophotometry method for the determination of ascoside and total polysaccharides for water extraction method in Fufang Jianshen Tablets and lay a foundation for its further study. Methods Waters C18 column （4.6 mm×150 mm， 5 μm） was used with the mobile phase of methanol-0.1% formic acid （35∶65） at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 330 nm. The column temperature was maintained at 30℃. The extracting method of Fufang Jianshen Tablets was optimized by orthogonal design， taking the extraction rate of ascoside， total polysaccharides and extract yield as indexes. Results The results showed that the linear ranges of acteoside and total polysaccharides were in the range of 10.4-104 μg/mL （r=0.9993， n=6）， 20-100 μg/mL （r=0.9995）. The factors that influence water extraction： A（extraction times）>B （extraction time）> C （solvent consumption）. The optimum extracting condition was A3B1C1： with the volume of 10 folds， extracting for 3 times， 1.5 hours one time. Conclusion The determination method of this study accords with the requirements， the optimum technology is stable and feasible for the extraction of Fufang Jianshen Tablets by orthogonal experiment.

[Key words] Fufang Jianshen Tablets； Verbascoside； Total polysaccharides； Orthogonal design；Extraction process

復方健腎片由肉蓯蓉、白術(shù)、生地黃、枸杞子、杜仲、紅參、鹿茸等藥物組成，具有健脾益氣、溫腎助陽、調(diào)和腸胃，主要用于疲乏無力、畏寒肢冷、腰痛腿酸、性欲減退等癥。復方健腎片為在自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院臨床使用20 余年的院內(nèi)制劑，現(xiàn)擬將其開發(fā)成新藥。本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以毛蕊花糖苷和總多糖含量及出膏率為評價指標，采用L9 （34）正交實驗設(shè)計對水提工藝進行優(yōu)化，為復方健腎片的進一步研究提供參考依據(jù)。

1 一般材料

Waters alliance e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Waters 2489紫外檢測器，Empower 3數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)；UPT-1-5T超純水器（25 MΩ，四川優(yōu)普超純科技有限公司）；SQP電子天平（1/10萬，德國Sartorius 公司）、超聲清洗器（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。GZX-9070MBE電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），DZT-6020型真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；手提式高速粉碎機（DFT-100）；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；DZTW電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

毛蕊花糖苷對照品 （批號111530-201411），D-無水葡萄糖對照品（批號110833-201205）均購自中國食品藥品檢定研究院。所有藥材均購自亳州金藥堂中藥飲片有限公司，經(jīng)新疆維吾爾醫(yī)藥研究所希爾艾力主任藥師鑒定，符合《中國藥典》2015年版項下標準；甲醇（色譜純，SIGMA公司）；水為超純水； 其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗設(shè)計

根據(jù)前期單因素試驗結(jié)果，選取對提取工藝影響較大的提取次數(shù)（A）、提取時間（B）和加水量（C）為考察因素，以毛蕊花糖苷、總多糖提取量和出膏率為評價指標，按L9（34）正交表進行試驗[1]。因素與水平設(shè)為：A 1、2、3次，B 1.5、2.0、2.5 h，C 10、12、14倍，本實驗評價指標的權(quán)重系數(shù)為0.4、0.4、0.2。

綜合評分=（毛蕊花糖苷含量/最大毛蕊花糖苷含量）×40+（總多糖含量/最大總多糖含量）×40+（出膏率/最大出膏率）×20。

2.2 毛蕊花糖苷含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%甲酸水溶液（35∶65）為流動相；檢測波長為330 nm；流速為1 mL/min；柱溫為30℃；進樣量10 μL[2]。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷對照品適量，置25 mL量瓶中，加50%甲醇制成每毫升含0.416 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣液經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 標準曲線的制備 分別精密吸取毛蕊花糖苷對照品溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL至10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以毛蕊花糖苷濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，回歸方程：Y=12 318X-33 456，r=0.9993，毛蕊花糖苷對照品濃度在10.4～104 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.5 樣品測定 精密吸取供試品溶液與對照品溶液各10 μL，依據(jù)“2.2.1”項下色譜條件進行測定。

2.2.6 精密度試驗 取濃度為0.416 mg/mL的毛蕊花糖苷對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，連續(xù)進樣6次，每次10 μL，6次進樣峰面積的RSD=0.93%（n=6），表明操作過程中儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 在優(yōu)化的水提取工藝基礎(chǔ)上進行提取的同一批提取液，按照上述“2.2.3”項下方法制成供試液，連續(xù)進樣6次，每次10 μL，6次進樣峰面積的RSD=1.1%（n=6），說明該方法的重復性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 同一批供試品，別在同一天的不同時間0、2、4、6、8、12 h進樣10 μL（每隔2 h），用含量測定方法重復測定，計算毛蕊花糖苷含量的RSD為2.3%；結(jié)果供試品溶液穩(wěn)定。

2.2.9 回收率測定 采用標準添加法測定回收率。取已知含量的樣品供試液7份，每份1 mL，置于10 mL容量瓶中，第一份作為空白回收，其余6份分別準確加入濃度為41.6 μg/mL的毛蕊花糖苷對照品溶液1 mL，制備供試液，搖勻，用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，按“2.2.1”項下色譜條件測定，進樣10 μL，提取液中毛蕊花糖苷平均回收率為100.9%，RSD為1.13%（n=6），表明本方法的回收率良好，準確度高。見表1。

2.3 總多糖含量測定（硫酸苯酚法）

2.3.1 D-無水葡萄糖對照品溶液的制備 精密稱取無水葡萄糖對照品適量，置50 mL量瓶中，加適量水溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得（每毫升中含無水葡萄糖0.504 mg）。精密移取上述無水葡 萄糖對照品溶液10 mL，置50 mL量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，即得（每毫升中含無水葡萄糖0.1008 mg）。

2.3.2 標準曲線的制備 分別精密吸取上述對照品溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于10 mL的量瓶內(nèi)，加水稀釋至刻度，搖勻。分別吸取上述溶液1.0 mL于10 mL具塞刻度試管中，加入新鮮配制的5%苯酚試劑（精密稱取苯酚試劑5 g，置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻制備）1 mL，并迅速加入濃硫酸5 ml，靜置10 min，搖勻，放置30 min，以第一份為空白對照液，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，得最大吸收波長為490 nm。照分光光度法試驗，在最大波長處測定各樣品吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=9.883X+0.0075，r=0.9995，在20～100 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3.3 供試品溶液制備 精密吸取提取液3 mL于25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密吸取稀釋液1.0 mL于25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，精密吸取稀釋液1.0 mL于10 mL具塞刻度試管中，照標準曲線項下自“加入新鮮配制的5%苯酚試劑”起，依法測定吸收度，隨行空白，照分光光度法（《中國藥典》2015年版一部，附錄通則0401）在波長490 nm處測定吸收度，依標準曲線計算總多糖含量。

2.3.4 精密度試驗 取0.1008 mg/mL無水葡萄糖對照品溶液4.0 mL，置于10 mL的量瓶內(nèi)，加水稀釋至刻度，搖勻。吸取上述溶液1.0 mL于10 mL具塞刻度試管中，加入新鮮配制的5%苯酚試劑1 mL，并迅速加入濃硫酸5 mL，靜置10 min，搖勻，放置30 min，以相應的溶劑為空白，于490 nm處連續(xù)測定吸光度值6次，計算RSD=0.38%（n=6），表明操作過程中儀器精密度良好。

2.3.5 重復性試驗 在優(yōu)化的水提取工藝基礎(chǔ)上進行提取的同一批提取液，按照上述“2.3.3”項下方法制成供試液，連續(xù)測定吸光度值6次，計算RSD=1.23%（n=6），說明該方法的重復性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 同一批供試品分別在同一天的不同時間0、2、4、6、8、12 h（每隔2 h），按照上述“2.3.3”項下方法制成供試液測定，計算總多糖含量的RSD為1.78%；結(jié)果供試品溶液穩(wěn)定。

2.3.7 回收率測定 采用標準添加法測定回收率。取已知含量的樣品供試液7份，每份1 mL，置于10 mL具塞試管中，第一份作為空白回收，其余6份分別準確加入濃度為60.048 μg/mL的無水葡萄糖苷對照品溶液1 mL，制備供試液，搖勻，按照標準曲線項下自“加入新鮮配制的5%苯酚試劑”起，依法測定吸收度。提取液中總多糖平均回收率為99.03%，RSD值為1.01%（n=6），表明本方法的回收率良好，準確度高。見表2。

2.4 出膏率的測定

精密吸取各提取液100 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃烘內(nèi)干燥至恒重，至干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算出膏率。

2.5 正交試驗優(yōu)選最佳水提工藝

在前期單因素試驗的基礎(chǔ)上，按處方比例稱取復方建腎片水提藥材。按2.1中因素水平的設(shè)置進行L9（34）正交試驗，提取液合并，濾過，濾液定容至2000 mL，分別測定毛蕊花糖苷、總多糖含量和出膏率。結(jié)果見表3～4。

由表3直觀分析結(jié)果可知：各因素對試驗結(jié)果的影響程度為提取次數(shù)>提取時間>加水倍量，各因素的最佳水平為A3B3C3。由表4方差分析結(jié)果表明，各因素對試驗結(jié)果的影響程度依次為：提取次數(shù)>提取時間>加水倍量，提取次數(shù)對試驗結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），A3優(yōu)于A2和A1。而提取時間和加水倍量對試驗結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。結(jié)合單因素和生產(chǎn)成本綜合考慮，確定最佳提取工藝為A3B1C1，即加水量為10倍，提取時間為1.5 h，提取次數(shù)為3次。以上結(jié)果說明，L9（34）正交表的9次試驗中并沒有優(yōu)選工藝，因此還需要對優(yōu)選工藝進行驗證試驗。稱取3份1/4處方比例，結(jié)合優(yōu)選的提出參數(shù)A3B1C1進行驗證試驗，毛蕊花糖苷、總多糖及出膏率含量數(shù)據(jù)較穩(wěn)定，且出膏率和含量均較高。因此，我們認為該工藝合理、穩(wěn)定。故確定A3B1C1為最佳工藝，即藥材加水煎煮3次，每次10倍量，煎煮1.5 h。見表6。

3 討論

肉蓯蓉為復方健腎片的君藥，大量研究表明，肉蓯蓉有雌激素作用，肉蓯蓉提取物能通過降低雌二醇量，升高促性腺激素和睪酮水平，從而發(fā)揮補腎助陽作用[3]。肉蓯蓉由苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)性成分和多糖等多種化學成分組成的，而苯乙醇總苷是肉蓯蓉中的主要活性成分[4]，而毛蕊花糖苷是肉蓯蓉苯乙醇總苷類代表性化合物，研究報道毛蕊花糖苷能增加包皮腺和提肛肌的重量，為肉蓯蓉雄性激素樣作用的主要活性成分之一[5]。有研究報道，肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷都能結(jié)合雌激素受體 ERα和ERβ，可增強雌激素應答元件（ERE） 的熒光素酶活性、從而發(fā)揮雌激素作用[6]。毛蕊花糖苷還能顯著縮短“腎陽虛”模型小鼠陰莖勃起潛伏期，可增加精子數(shù)量，提高性器官臟器系數(shù)，從而改善睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)[7]。綜上所述，毛蕊花糖苷文獻報道的藥理作用與本方功能主治相一致?，F(xiàn)代研究表明，白術(shù)[8-9]、生地黃[10-11]、枸杞子[12-13]、杜仲[14-15]、肉蓯蓉[4]等藥材均含有多糖類成分組成學成分。研究報道，肉蓯蓉多糖能顯著提高東莨菪堿導致學習記憶障礙模型小鼠突觸素（SYP）、促進相關(guān)蛋白43（GAP-43）的表達，可增多海馬區(qū)突觸數(shù)量，增強突觸的可塑性，可以達到緩解學習障礙表現(xiàn)的目的[16]。白術(shù)水溶性多糖能刺激小鼠產(chǎn)生特異性IgG類抗體和非特異性交叉抗體，推測白術(shù)多糖可能是一種特異性免疫調(diào)節(jié)劑[17]。現(xiàn)代研究表明枸杞子以枸杞多糖（LBP）為主[18]，枸杞多糖把血清TC、TG、LDL、FBG、FINS 、血清Cr 等明顯降低，可明顯減少腎臟LDL與OX-LDL[19]，對肥胖大鼠腎臟有一定的保護作用。從已有研究報道得知，杜仲樹皮中分離的多糖eucomman A（97）和eucomman B（98），都能明顯增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的活性，從而增強機體非特異性免疫功能[14，20]。

綜上所述，肉蓯蓉、白術(shù)、生地黃、枸杞子、杜仲等藥材的多糖類成分，都具有與本方功能主治相關(guān)的藥理作用。因此，在這個復方中以有效成分毛蕊花糖苷和總多糖含量及出膏率作為評價指標。

本制劑的水煎部分由肉蓯蓉、白術(shù)、生地黃、枸杞子、杜仲等八種藥材組成，此煎煮工藝研究是保障復方健腎片安全有效和質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)，故本研究以有效成分毛蕊花糖苷和總多糖含量及出膏率作為評價指標，通過正交設(shè)計法對復方健腎片的水提取工藝進行了優(yōu)選。通過實驗結(jié)果，本著節(jié)約能源、降低成本的原則，即將藥材加水煎煮3次，每次1.5 h，每次加水量為藥材量的10倍。

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