超聲波輔助的乙醇—硫酸銨雙水相聯(lián)合提取魚腥草總黃酮工藝

郝紅英+周芳+王改利

摘要：為了優(yōu)化超聲波輔助的乙醇-硫酸銨雙水相聯(lián)合提取魚腥草總黃酮的工藝，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化影響總黃酮提取率的各因素水平，通過正交試驗(yàn)確定各因素組合的影響程度。結(jié)果表明，各因素的影響排序?yàn)橐掖紳舛?提取溫度>提取時間>料液比；最佳提取條件為脫脂魚腥草粉末2.0 g、乙醇用量32.50%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、硫酸銨用量16.00%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、料液比1 g ∶20 mL、超聲波頻率300 W、超聲波處理溫度70 ℃、超聲波處理時間50 min，在此條件下，魚腥草總黃酮提取率為2.97%。由結(jié)果可知，超聲波-乙醇/硫酸銨雙水相聯(lián)合提取法提取效率高，操作簡便，是一種很有發(fā)展前途的提取方法。

關(guān)鍵詞：雙水相；魚腥草；總黃酮；提取工藝；正交設(shè)計(jì)；超聲波輔助提取

中圖分類號： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0183-03

魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）是三白草科蕺菜屬多年生草本植物，營養(yǎng)豐富，具有多種藥理作用：抗菌、抗病毒、抗炎、抗過敏、抗腫瘤，此外，魚腥草還可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[1-2]。魚腥草含有多種成分[3-4]，如揮發(fā)油、阿福豆苷、金絲桃苷及蕺菜堿等，其中黃酮類成分有斛皮素、斛皮苷、綠原酸、金絲桃苷等。目前關(guān)于魚腥草活性成分的提取尚無統(tǒng)一的方法，主要運(yùn)用的提取方法有水煎煮法、醇提取法、索式抽提取法、超聲波提取法等[5]。超聲波能使植物組織細(xì)胞破裂，利于細(xì)胞中的成分進(jìn)入溶劑中，加速細(xì)胞成分與溶劑的相互滲透和溶解，從而提高黃酮類化合物在溶劑中的溶解度[6]。超聲波提取法具有操作簡單、能耗低、可以縮短提取時間、可提高有效成分的提取率、減少溶劑的使用量、提取成本低等特點(diǎn)，因此，目前超聲波技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物有效成分的提取[7]。雙水相提取技術(shù)因設(shè)備投資少、操作簡單，引起了人們極大的重視，并且被廣泛用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域[8]，但是目前未見采用超聲波-雙水相聯(lián)合提取魚腥草總黃酮的報(bào)道。因此，本研究結(jié)合超聲波輔助提取法、雙水相萃取法2種方法的優(yōu)點(diǎn)，采用超聲波-乙醇/硫酸銨雙水相體系提取魚腥草中主要成分黃酮，以總黃酮得率為指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)法，確定提取總黃酮有效成分的較佳工藝，旨在為魚腥草總黃酮提取工藝的產(chǎn)業(yè)化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚腥草，購自當(dāng)?shù)厮幍?。蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)樣品，由中國藥品生物制品檢定所提供，為生化試劑；其他試劑均為分析純。

超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水溫箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；7230G型可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 魚腥草中黃酮類化合物含量的測定參照文獻(xiàn)[9-10]的方法，以蕓香苷為標(biāo)樣測定魚腥草總黃酮類化合物含量，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.093 8x+0.000 1。式中：y為蕓香苷質(zhì)量濃度，g/mL；x為吸光度；r2=0.999 8。

1.2.2 魚腥草總黃酮的提取與測定 魚腥草總黃酮的提?。悍Q取魚腥草干細(xì)粉（過60目篩）于索氏提取器中，經(jīng)石油醚脫脂，并除去部分色素。稱取2.0 g處理樣品于250 mL碘量瓶中，按一定的料液比加入乙醇-硫酸銨雙水相溶液，置于超聲波清洗器中，提取一段時間后，過濾，靜置分層，將濾液用分液漏斗將兩相分開，將醇相提取液高速離心25 min，即得魚腥草總黃酮類化合物提取液，后經(jīng)微孔濾膜過濾，精確稱取一定量用甲醇定容至250 mL，以供分析測試用。

魚腥草總黃酮的測定：取2.5 mL樣品溶液至25 mL容量瓶中，加1 mL 5% NaNO2（質(zhì)量體積比，下同），搖勻，放置 5 min 后加入1 mL 10% Al（NO3）3（質(zhì)量體積比，下同），5 min后再加入10 mL 4% NaOH（質(zhì)量體積比，下同），搖勻，用蒸餾水稀釋至刻度，10 min后于7230G型可見分光光度計(jì)上在510 nm處測定吸光度D510 nm，根據(jù)蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，得到提取液濃度，總黃酮提取率按照下式計(jì)算：

Et=（C×V×D）/m×100%。

式中：Et為總黃酮提取率，%；C為測得的提取液濃度，g/mL；V為提取液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；m為原料的質(zhì)量，g。

1.2.3 超聲波處理時間對魚腥草總黃酮提取率的影響 采用超聲波功率300 W、恒定的乙醇用量32.50%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、超聲波處理溫度50 ℃、硫酸銨用量16.00%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的條件，稱取2.0 g處理樣品，選擇料液比 1 g ∶20 mL，研究不同超聲波處理時間（10、20、30、40 min）對魚腥草總黃酮提取率的影響。

1.2.4 料液比對魚腥草總黃酮提取率的影響 采用超聲波功率300 W、超聲波處理時間20 min、恒定的乙醇用量32.50%、超聲波處理溫度50 ℃、硫酸銨用量16.00%的條件，稱取 2.0 g 處理樣品，研究不同料液比（1 g ∶15 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL）對魚腥草總黃酮提取率的影響。

1.2.5 超聲波處理溫度對魚腥草總黃酮提取率的影響 采用超聲波功率300 W、超聲波處理時間20 min、硫酸銨用量 16.00%、乙醇用量32.50%的條件，稱取2.0 g處理樣品，料液比選擇1 g ∶20 mL，研究不同超聲波處理溫度（30、40、50、60 ℃）對魚腥草總黃酮提取率的影響

1.2.6 正交試驗(yàn) 在硫酸銨質(zhì)量濃度、超聲波功率確定的情況下，以乙醇用量（體積分?jǐn)?shù)）、超聲波提取溫度、料液比（m魚腥草 ∶V雙水相溶劑）、超聲提取時間為考察因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交表（表1），并按照此正交表安排試驗(yàn)，重復(fù)上述操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理時間對魚腥草總黃酮提取率的影響

從圖1可以看出，總黃酮提取率在超聲波處理10～20 min 時逐漸增高，而后隨著處理時間的延長逐漸降低。其原因可能是超聲波處理時間越長，超聲波對魚腥草細(xì)胞壁組織的破壞程度就越大，更有利于黃酮類物質(zhì)的釋放和進(jìn)入溶液，但過長的超聲處理時間，可能會引起黃酮類化合物的破壞和氧化。因此綜合分析可知，乙醇-硫酸銨雙水相體系超聲提取魚腥草總黃酮的處理時間以20 min為宜。

2.2 料液比對魚腥草總黃酮提取率的影響

從圖2可以看出，總黃酮提取率隨料液比的增大而提高，當(dāng)料液比為1 g ∶20 mL時，提取率最高；隨著料液比的進(jìn)一步增大，溶劑用量過大，會造成雙水相鹽用量增加，不僅耗費(fèi)大量的溶劑和銨鹽，也會給后續(xù)處理帶來不必要的麻煩。

2.3 超聲提取溫度對魚腥草總黃酮提取率的影響

從圖3可以看出，隨著超聲提取溫度的升高，總黃酮提取率提高；當(dāng)超聲溫度超過50 ℃時，提取率降低。超聲溫度低，導(dǎo)致黃酮不能完全溶出；而溫度過高，使超聲波破壞魚腥草細(xì)胞組織的能力增強(qiáng)，黃酮類物質(zhì)更易浸出，但是在超聲波的作用下，過高的處理溫度會導(dǎo)致魚腥草黃酮類物質(zhì)因氧化或被超聲波破壞等原因，使變質(zhì)的量增加，同時溫度升高也會增加乙醇揮發(fā)量。因此由結(jié)果可以確定，50 ℃為魚腥草總黃酮提取的最佳溫度條件。

2.4 多因素正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素考察的基礎(chǔ)上，為了得到更好的條件，進(jìn)行正交試驗(yàn)。選取3因素4水平，使用L9（34）正交設(shè)計(jì)（表1）來安排試驗(yàn)，結(jié)果見表2、表3。

從表2、表3可知，各因素對提取率影響排序?yàn)橐掖加昧?gt;超聲提取溫度>超聲處理時間>料液比，其中乙醇濃度對魚腥草中總黃酮提取率的影響最大。由分析結(jié)果初步認(rèn)為，超聲波-乙醇/硫酸銨雙水相體系提取魚腥草總黃酮的最佳條件：在魚腥草質(zhì)量為2.00 g的情況下，硫酸銨用量為 16.00%，乙醇用量32.50%，料液比1 g ∶20 mL，提取溫度 70 ℃，處理時間50 min。

2.5 平行試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證此正交試驗(yàn)結(jié)果的可考性和重現(xiàn)性，按照所得最佳條件做了3次平行試驗(yàn)，總黃酮提取率分別為 3.00%、2.97%、2.94%，均值為2.97%，RSD為0.03%。結(jié)果表明，使用正交試驗(yàn)得出的方法，優(yōu)化出了最佳提取工藝，提取率均值為2.97%，不但提取率較高，而且試驗(yàn)的重現(xiàn)性好。

3 討論

通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)法，優(yōu)選出魚腥草總黃酮的雙水相最佳提取工藝：脫脂魚腥草粉末2.0 g，乙醇用量32.50%，硫酸銨用量16.00%，料液比1 g ∶20 mL，超聲波功率300 W，提取溫度70 ℃，處理時間50 min。在此條件下，魚腥草總黃酮提取率為2.97%。

超聲波-乙醇/硫酸銨雙水相聯(lián)合提取法是一種新型的液-液萃取技術(shù)，反應(yīng)條件溫和，提取時間短，提取效率高，操作簡便，不存在有機(jī)殘留問題，是一種很有發(fā)展前景的聯(lián)合提取方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]王利勤，趙友興，周 露，等. 魚腥草的化學(xué)成分研究[J]. 中草藥，2007，38（12）：1788-1790.

[2]高璐琰，楊 鐘，武瑞兵，等. 細(xì)菌耐藥性研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（7）：162-166.

[3]伍賢進(jìn)，李勝華，李愛明，等. 魚腥草化學(xué)成分研究[J]. 中藥材，2008，32（8）：1168-1170.

[4]楊小孟. 中藥魚腥草化學(xué)成分和臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 天津藥學(xué)，2013，25（2）：58-60.

[5]李勝華，伍賢進(jìn). 魚腥草總黃酮的提取及其方法對比[J]. 吉首大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，28（3）：117-118.

[6]許 暉，孫蘭萍，張 斌，等. 花生殼黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2008（3）：11-15.

[7]袁英髦，曹雁平. 超聲波輔助提取杜仲皮中的杜仲膠和杜仲黃酮[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2014，32（2）：67-71.

[8]汪建紅，廖立敏，王 碧. 乙醇-硫酸銨雙水相體系提取檸檬渣中總黃酮研究[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，47（1）：78-81.

[9]趙晨晨，承 偉，王立冬. 微波輔助提取絡(luò)石藤總黃酮的工藝研究[J]. 中草藥，2012，43（4）：718-720.

[10]王仲英，李香蘭. 馬齒莧中黃酮類化合物含量的測定[J]. 太原理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35（1）：95-96.張水花，畢春麗，付延英. 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化濁點(diǎn)萃取-光度法測定野生食用菌中的銅[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（1）：186-188.