提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向編輯效率方法的研究進(jìn)展

趙盼盼+王麗+袁園園

摘要：近年來(lái)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)經(jīng)過(guò)一系列改造后已成為繼鋅指核酸酶ZFNs和TALENs后的新型高效定點(diǎn)編輯的新技術(shù)，目前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于人類(lèi)細(xì)胞、斑馬魚(yú)、小鼠以及細(xì)菌的基因組精確編輯，但是該技術(shù)在農(nóng)作物等植物中的應(yīng)用還比較受限，且其脫靶效應(yīng)等問(wèn)題還有待解決。本文首先簡(jiǎn)要綜述了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展歷程、結(jié)構(gòu)組成和作用機(jī)制及其在農(nóng)作物中的應(yīng)用，進(jìn)而綜述了近年來(lái)探索出的提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向編輯效率的方法。最后，對(duì)基因組編輯技術(shù)在農(nóng)作物和作物育種上的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9系統(tǒng)；向?qū)NA；脫靶效應(yīng)；農(nóng)作物

中圖分類(lèi)號(hào)：S188 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0012-04

基因組編輯技術(shù)產(chǎn)生于20世紀(jì)80年代，在CRISPR/Cas出現(xiàn)之前，科學(xué)家們只能通過(guò)對(duì)龐大的突變體庫(kù)進(jìn)行篩選，或通過(guò)同源重組途徑來(lái)對(duì)DNA進(jìn)行編輯。由于細(xì)胞發(fā)生隨機(jī)同源重組的效率只有百萬(wàn)分之一，用同源重組方法進(jìn)行基因編輯耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，因此限制了基因組編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用[1-2]。21世紀(jì)初，科研人員相繼開(kāi)發(fā)出鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，簡(jiǎn)稱(chēng)ZFNs）技術(shù)和類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-likeeffector nucleases，簡(jiǎn)稱(chēng)TALENs）技術(shù)，基因組編輯技術(shù)得到迅速發(fā)展[3]。2013年初，《Science》《Nature》《Biotechnology》《Cell》等雜志幾乎同時(shí)報(bào)道了1種不依賴(lài)于FokⅠ核酸酶的基因組編輯技術(shù)——clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated nuclease 9（CRISPR/Cas9），CRISPR/Cas9技術(shù)具有多個(gè)選擇的靶向基因的位點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)多基因編輯，編輯的類(lèi)型包括基因的定點(diǎn)插入、小片段的缺失、多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變、基因定點(diǎn)的插入/缺失indel突變等。與其他靶向編輯技術(shù)相比，還具有精確可靠、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、容易操作、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。CRISPR/Cas9技術(shù)突破了基因編輯的瓶頸，為基因編輯提供了一把精確的“手術(shù)刀”。該技術(shù)從發(fā)現(xiàn)至今發(fā)展迅速，正在成為基因改造的重要方法。

1 發(fā)展簡(jiǎn)史

1987年日本大阪大學(xué)（Osakua University）學(xué)者Ishino在研究大腸桿菌堿性磷酸酶基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)該基因附近有1段由簡(jiǎn)單重復(fù)序列組成的特異序列[3]。隨后，研究者們?cè)谄渌锓N也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似序列，并給予了各種不同的命名：直接可變重復(fù)（direct variable repeat，簡(jiǎn)稱(chēng)DVR），串聯(lián)重復(fù)（tandem repeat，簡(jiǎn)稱(chēng)TREP），長(zhǎng)串聯(lián)重復(fù)的重復(fù)（long tandemly repeated repetitive，簡(jiǎn)稱(chēng)LTRR），長(zhǎng)串串聯(lián)重復(fù)（long clusters of tandem repeats，簡(jiǎn)稱(chēng)LCTR），間隔穿插直接重復(fù)（spacers interspersed direct repeats，簡(jiǎn)稱(chēng)SPIDR）[4]。Mojica等在2000年提出把類(lèi)似序列作為重復(fù)序列家族的一類(lèi)成員，并將其命名為規(guī)律的短間隔序列（short regularly spaced repeats，簡(jiǎn)稱(chēng)SRSRs）。2002年，荷蘭學(xué)者Jansen分析該序列發(fā)現(xiàn)：它由長(zhǎng)度不一（21～37 bp）的正向重復(fù)序列（repeats）與長(zhǎng)度類(lèi)似的間隔序列（spacers）間隔排列而成，并將其命名為成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，簡(jiǎn)稱(chēng)CRISPRs），并在其附近發(fā)現(xiàn)CRISPR相關(guān)（CRISPR-associated，簡(jiǎn)稱(chēng)Cas）基因，分析發(fā)現(xiàn)Cas基因表達(dá)產(chǎn)物與DNA解螺旋酶及核酸酶具有高度同源性，提示Cas蛋白具有DNA內(nèi)切酶功能。到了2005年，有3個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)CRISPR可能與微生物的免疫作用有關(guān)。2007年，Barrangou等首次利用試驗(yàn)證明了嗜熱鏈球菌的CRISPR系統(tǒng)直接參與細(xì)菌對(duì)噬菌體的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。2012年，Jinek等對(duì)細(xì)菌的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)進(jìn)行改造和優(yōu)化，成功地在體外定點(diǎn)切割了環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性寡聚核苷酸片段，并證明將分開(kāi)作用的crRNA、tracrRNA通過(guò)1段linker連接成1條單一向?qū)NA（single-guide RNA，簡(jiǎn)稱(chēng)sgRNA），仍然能高效地介導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)DNA的定點(diǎn)切割。近年來(lái)CRISPR/Cas9系統(tǒng)被應(yīng)用到真核生物中，引起了一場(chǎng)遺傳操作的革命性改變。2013年，麻省理工學(xué)院張鋒團(tuán)隊(duì)和哈佛大學(xué)Church團(tuán)隊(duì)在《Science》雜志上同時(shí)發(fā)表了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用，多個(gè)靶向sgRNAs可以同時(shí)對(duì)基因組的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別，并通過(guò)Cas9作用產(chǎn)生斷裂，通過(guò)DNA修復(fù)系統(tǒng)的不精確修復(fù)在多個(gè)斷裂點(diǎn)周?chē)瑫r(shí)引發(fā)突變，從而使之作為一種基因編輯方法投入應(yīng)用。2014年，Nishimasu等解析了Cas9、sgRNA和DNA復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)，為CRISPR/Cas9技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)提供了研究條件[3]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯，是繼ZFNs、TALENs后的第3代基因組編輯技術(shù)。該技術(shù)已在擬南芥、煙草、高粱和水稻等多個(gè)物種中實(shí)現(xiàn)了基因組編輯[5]。鑒于此，CRISPR/Cas9技術(shù)展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景，并受到眾多分子生物學(xué)家的青睞，但該技術(shù)的脫靶效應(yīng)是基因靶向過(guò)程中受到廣泛關(guān)注的一個(gè)重要問(wèn)題，因此如何改善和提高基因組編輯效率，同時(shí)最大限度降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)成為了亟待解決的問(wèn)題。

2 CRISPR/Cas9的組成、結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制

CRISPR基因座結(jié)構(gòu)包括5′端的tracrRNA（trans-activating crRNA）基因，中間是一系列Cas蛋白編碼基因（包括Cas1、Cas2、Csn2和Cas9等），3′端由啟動(dòng)子區(qū)域、大量spacers、repeats順序構(gòu)成。CRISPR上游的前導(dǎo)序列啟動(dòng)CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為precrRNA，接下來(lái)precrRNA在Cas9和核酸酶的作用下被剪切為成熟的crRNA，crRNA以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與tracrRNA結(jié)合為tracrRNA：crRNA復(fù)合體，tracrRNA：crRNA復(fù)合體與Cas9核酸酶形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，由crRNA中的特異性序列引導(dǎo)至臨近前體間隔序列毗鄰基序（protospacer adjacent motif，簡(jiǎn)稱(chēng)PAM）的靶位點(diǎn)，crRNA中的引導(dǎo)序列與靶位點(diǎn)DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合并啟動(dòng)Cas9核酸酶切割DNA雙鏈，Cas9蛋白的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域剪切互補(bǔ)鏈，而Cas9的RuvCI結(jié)構(gòu)域剪切非互補(bǔ)鏈，進(jìn)而在靶位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DNA double strand break，簡(jiǎn)稱(chēng)DSB），然后利用細(xì)胞的非同源性末端連接（non-homologous endjoining，簡(jiǎn)稱(chēng)NHEJ）或同源重組（homologous recombination，簡(jiǎn)稱(chēng)HR）修復(fù)機(jī)制對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行插入、缺失（Indel）、修復(fù)（Repair）或替換（Replacement）。與ZFNs、TALENs相比，CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是可針對(duì)多個(gè)基因設(shè)計(jì)sgRNA并在1次打靶中同時(shí)完成多基因編輯。根據(jù)Cas9可多位點(diǎn)同時(shí)打靶的特點(diǎn)，在待刪除片段兩端設(shè)計(jì)sgRNA，1次打靶便可實(shí)現(xiàn)片段的定向刪除，這一特點(diǎn)可滿(mǎn)足基因簇刪除、多基因刪除、調(diào)控區(qū)域刪除、外源標(biāo)記基因的大片段刪除等的需求[6]。

3 提高CRISPR/Cas9靶向效率的方法

自CRISPR/Cas9編輯技術(shù)投入使用至今，研究者們一直在探索提高該技術(shù)靶向效率的方法。有研究者指出，通過(guò)調(diào)節(jié)Cas9核酸酶和sgRNA濃度可降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)，但濃度降低后，相應(yīng)基因組編輯能力會(huì)減弱[7]。Zhang等分別通過(guò)定性、定量的方法系統(tǒng)地比較了PAM對(duì)基因組編輯效率的影響，并發(fā)現(xiàn)編輯效率依次是NGG>NGA>NAG（N=A、T、C或G）[8]。考慮到細(xì)胞在DNA修復(fù)過(guò)程中NHEJ、HDR是2個(gè)相互拮抗的過(guò)程，多個(gè)研究組通過(guò)體外篩選找到小分子化合物對(duì)NHEJ過(guò)程進(jìn)行抑制，從而達(dá)到了增強(qiáng)HDR過(guò)程提高定點(diǎn)敲入效率的目的。Maruyama等通過(guò)小分子抑制劑Scr7抑制NHEJ修復(fù)途徑中的連接酶Ⅳ，大大提高了HR效率，為HR介導(dǎo)的基因組編輯更廣泛地應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[9-10]。CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)在研究中造成的諸多不確定性，無(wú)疑制約了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。脫靶率的高低不僅取決于不同的基因編輯平臺(tái)（目前對(duì)于各種基因組編輯平臺(tái)脫靶率的比較還沒(méi)有確切的結(jié)論），也同樣受靶向序列、細(xì)胞類(lèi)型、基因編輯工具在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)時(shí)間和強(qiáng)度、載體的選擇以及脫靶率的檢測(cè)方法等影響。筆者主要從提高sgRNA的特異性、改造Cas9蛋白結(jié)構(gòu)以及載體的選擇與構(gòu)建3個(gè)方面介紹了提高CRISPR/Cas9技術(shù)靶向效率的方法。

3.1 提高sgRNA的特異性

靶向sgRNA的設(shè)計(jì)對(duì)于DNA片段的編輯效率尤為重要。由于sgRNA載體設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)易性，研究者可針對(duì)1個(gè)基因設(shè)計(jì)多個(gè)sgRNA，并可結(jié)合陣列試驗(yàn)構(gòu)建sgRNA文庫(kù)用于功能基因篩選。有關(guān)sgRNA文庫(kù)設(shè)計(jì)的相關(guān)綜述詳見(jiàn)謝勝松等的報(bào)道[11]。2012年，Jinek等將CRISPR/Cas9系統(tǒng)中crRNA、tracrRNA 2個(gè)非編碼RNA改造成1個(gè)RNA，即sgRNA，它能夠指導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)特定的DNA序列進(jìn)行靶向斷裂，為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[3]。靶向sgRNA序列可以選擇GC含量高一些的序列，盡量使堿基分布均勻，靶點(diǎn)盡量選擇在DNA超敏位點(diǎn)，這樣可以更好地實(shí)現(xiàn)Cas9對(duì)DNA片段的切割[12]。Doench等系統(tǒng)性研究了CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯效率，并對(duì)1 841條sgRNA進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)若sgRNA的3′末端第20位堿基為G和第16位堿基為C時(shí)，基因組編輯效率較高，若第20位堿基為C、第16位堿基為G時(shí)，則基因組編輯效率低；若sgRNA第3位堿基為A，其基因組編輯效率比該位置為C時(shí)高；若第18、19位堿基為T(mén)，其基因組編輯效率則相對(duì)較低[13]。這一研究為設(shè)計(jì)高效的sgRNA提供了強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。還有的研究者發(fā)現(xiàn)在sgRNA的5′端額外增加2個(gè)G后能夠顯著提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性[14]。此外，也有研究者嘗試縮短sgRNA的長(zhǎng)度來(lái)提高其特異性，F(xiàn)u等使用17～18 nt的“truncated sgRNA”進(jìn)行基因打靶發(fā)現(xiàn)不會(huì)影響其活性，但可顯著降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)[15]。

3.2 通過(guò)改造Cas9蛋白結(jié)構(gòu)降低脫靶效應(yīng)

為降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，有的研究者對(duì)野生型的Cas9進(jìn)行了改造，使其中1個(gè)結(jié)構(gòu)域失活，并得到突變型D10A Cas9切口酶和H840A Cas9切口酶。野生型的Cas9蛋白有2個(gè)內(nèi)切酶活性結(jié)構(gòu)域，而Cas9的其中1個(gè)結(jié)構(gòu)域失活只能切割DNA單鏈，產(chǎn)生1個(gè)單鏈切口，Cas9蛋白經(jīng)過(guò)這一改造，CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用時(shí)就需要設(shè)計(jì)2條sgRNA，2條sgRNA分別結(jié)合不同的DNA鏈，突變體切口酶D10A Cas9或H840A Cas9會(huì)在每個(gè)sgRNA結(jié)合的地方造成單鏈缺口，2個(gè)相鄰的單鏈切口會(huì)形成1個(gè)DSB。這種單鏈切口酶的優(yōu)點(diǎn)在于，如果1條sgRNA發(fā)生錯(cuò)配，只會(huì)形成1個(gè)切口，不會(huì)形成DSB，這種情況下細(xì)胞會(huì)自動(dòng)將其修復(fù)正常；如果2條sgRNA同時(shí)錯(cuò)配，那么形成雙鏈斷裂的脫靶幾率會(huì)很小，這就極大地提高了靶點(diǎn)的專(zhuān)一性。張鋒課題組用這一方法對(duì)靶向DNA進(jìn)行切割，發(fā)現(xiàn)該策略可使脫靶效應(yīng)降至1/1 000[3]。另有研究指出，將該方法和適當(dāng)縮短sgRNA的靶標(biāo)序列相結(jié)合，能夠進(jìn)一步降低脫靶效應(yīng)[15]。隨后，研究者將Cas9蛋白的核酸酶結(jié)構(gòu)域突變，產(chǎn)生失活的dCas9，然后將dCas9與FokⅠ核酸酶結(jié)合形成融合蛋白（FokⅠ-dCas9），發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)2個(gè)融合蛋白單體彼此靠近并形成二聚體時(shí)才能行使切割功能，簡(jiǎn)單過(guò)程是2個(gè)sgRNA分別引導(dǎo)dCas9-FokⅠ結(jié)合到相距15～20 bp的靶DNA區(qū)域，F(xiàn)okⅠ實(shí)現(xiàn)二聚化而被激活，對(duì)中間的DNA序列進(jìn)行切割，產(chǎn)生雙鏈末端斷裂。Tsai等報(bào)道了dCas9-FokⅠ融合蛋白可有效降低CRISPR的脫靶效應(yīng)至1/5 000[16]。此外，研究者還對(duì)Cas9蛋白進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎棧ㄈ缂由闲盘?hào)肽，或標(biāo)簽蛋白）[17-19]，用來(lái)提高基因組編輯效率。

3.3 選擇構(gòu)建合適的載體

如何有效地將CRISPR/Cas9基因組編輯質(zhì)粒準(zhǔn)確地靶向運(yùn)輸?shù)教囟ǖ募?xì)胞、組織和器官中，實(shí)現(xiàn)精確導(dǎo)向的基因編輯，也是提高CRISPR/Cas9靶向效率應(yīng)考慮的重要因素，尤其在基因治療領(lǐng)域成為了當(dāng)今一大難題。在體外對(duì)一些細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯，可以用電穿孔或病毒載體將CRISPR/Cas9基因組編輯質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞之中。電穿孔的方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的損傷較大，這些細(xì)胞在體外經(jīng)過(guò)電穿孔處理后，細(xì)胞的活力可能會(huì)降低，回輸?shù)襟w內(nèi)后達(dá)不到理想的效果。病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體等在體外應(yīng)用比較廣泛[20-21]。將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)與腺病毒（adeno-associated virus，簡(jiǎn)稱(chēng)AAV）系統(tǒng)相結(jié)合，成功地對(duì)小鼠腦細(xì)胞進(jìn)行了基因編輯，還構(gòu)建了肺腺癌小鼠模型。也有報(bào)道利用AAV遞送CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，成功地對(duì)小鼠腦部神經(jīng)細(xì)胞的多個(gè)基因進(jìn)行編輯，并觀察到了小鼠行為上的變化[22]。此外，納米顆粒和脂質(zhì)體也是一種頗具前景的遞送工具[23-24]。在農(nóng)作物等植物中，則載體的選擇比較單一，一般會(huì)構(gòu)建含有分別驅(qū)動(dòng)Cas9（如35S）、sgRNA（如：U6或U3）表達(dá)的啟動(dòng)子序列、密碼子優(yōu)化的Cas9以及設(shè)計(jì)好的sgRNA的表達(dá)載體，可以將Cas9、sgRNA構(gòu)建到同一表達(dá)載體，也可以構(gòu)建為不同的表達(dá)載體。Upadhyay等在煙草細(xì)胞中比較了sgRNA、Cas9核酸酶構(gòu)建到同一個(gè)載體或分別構(gòu)建到不同的2個(gè)載體表達(dá)對(duì)突變效率的影響，結(jié)果表明，在構(gòu)建到同一載體中表達(dá)的突變效率顯著高于分別構(gòu)建到不同載體中表達(dá)的突變效率[19]。

4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在農(nóng)作物中的應(yīng)用

為了檢測(cè)CRISPR/Cas9系統(tǒng)能否應(yīng)用于植物細(xì)胞，Orel等設(shè)計(jì)Gateway雙元T-DNA表達(dá)載體來(lái)共表達(dá)Cas9、sgRNA，利用外源報(bào)告基因DGU.US研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻的愈傷組織中能否產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)、DGU.US報(bào)告基因共轉(zhuǎn)化到水稻的愈傷組織時(shí)，在愈傷組織上發(fā)現(xiàn)GUS的著色點(diǎn)，而只有報(bào)告基因轉(zhuǎn)入的愈傷組織上則無(wú)GUS著色點(diǎn)[25]。由此可知，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在植物細(xì)胞中產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂，這是該系統(tǒng)在動(dòng)物、人之后成功應(yīng)用于植物中進(jìn)行外源基因編輯，并且明顯簡(jiǎn)化了試驗(yàn)過(guò)程。我國(guó)學(xué)者利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功剔除了1個(gè)基因，使小麥獲得白粉病抗性，進(jìn)而在小麥抗病關(guān)鍵生物技術(shù)領(lǐng)域取得重要進(jìn)展，并第1次在1個(gè)多倍體物種中證明了可以對(duì)多個(gè)部分同源的基因同時(shí)并準(zhǔn)確進(jìn)行編輯，而在水稻上使4個(gè)基因功能失活的試驗(yàn)，則意味著該技術(shù)可以用于水稻這種重要農(nóng)作物的改良[17，26]。此外，該技術(shù)在玉米、高粱、甜橙、大豆、馬鈴薯、番茄等農(nóng)作物中均實(shí)現(xiàn)了基因的定點(diǎn)編輯甚至多位點(diǎn)的精確編輯[27-28]。但在這些農(nóng)作物中只有水稻得到了穩(wěn)定的突變體植株，其余物種均是通過(guò)原生質(zhì)體或者葉片注射等瞬時(shí)驗(yàn)證系統(tǒng)證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物細(xì)胞中的可行性[29]。

5 展望

CRISPR/Cas9作為一種新型的基因靶向修飾技術(shù)，雖然其應(yīng)用尚處起步階段，但相比于ZFNs、TALENs技術(shù)的耗時(shí)、耗力以及設(shè)計(jì)繁瑣等缺點(diǎn)而言，CRISPR/Cas9以其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、試驗(yàn)操作性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)而備受科研人員青睞。2014年初，《Nature Methods》將TALENs和CRISPR/Cas9技術(shù)評(píng)為2014年值得關(guān)注技術(shù)，但同時(shí)也明確指出了CRISPR/Cas9的脫靶現(xiàn)象，我們相信隨著科研人員對(duì)改善脫靶效應(yīng)方法的不斷探索研究，不久的將來(lái)CRISPR/Cas9系統(tǒng)將更好地幫助研究者們了解基因的功能，探索基因組的奧秘。除了應(yīng)用于植物功能基因組研究，基因組編輯技術(shù)還可以應(yīng)用于農(nóng)作物品種改良[30]，便于育種工作者加快培育更優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗性的農(nóng)作物優(yōu)良品種。例如：通過(guò)基因組編輯技術(shù)將花粉或花藥發(fā)育相關(guān)的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，可以人工創(chuàng)制隱性核雄性不育材料，進(jìn)一步用于農(nóng)作物雜種優(yōu)勢(shì)的利用。如何改造該技術(shù)及供體基因載體的設(shè)計(jì)，利用HDR在基因組特定位點(diǎn)引入功能基因，這將是今后CRISPR/Cas9技術(shù)重點(diǎn)發(fā)展的方向，一旦獲得突破必將使該技術(shù)在農(nóng)作物改良方面起到更大的作用。除了技術(shù)方面仍存在的問(wèn)題（例如如何更完善地提高靶向效率，更精確地脫靶效應(yīng)評(píng)估體系的研發(fā)等），作物育種方面面臨的最大問(wèn)題在于通過(guò)該技術(shù)產(chǎn)生的植物和相關(guān)產(chǎn)物是否受轉(zhuǎn)基因相關(guān)法律約束，這更引發(fā)了知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)和法律、社會(huì)倫理等諸多領(lǐng)域問(wèn)題的思考?？傊?，CRISPR/Cas9技術(shù)在農(nóng)作物中的應(yīng)用，既是機(jī)遇又充滿(mǎn)了挑戰(zhàn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Szostak J W，Orr-Weaver T L，Rothstein R J，et al. The double-strand-break repair model for recombination[J]. Cell，1983，33（1）：25-35.

[2]Keeney S，Giroux C N，Kleckner N. Meiosis-specific DNA double-strand breaks are catalyzed by Spo11，a member of a widely conserved protein family[J]. Cell，1997，88（3）：375-384.

[3]Hsu P D，Lander E S，Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering[J]. Cell，2014，157（6）：1262-1278.

[4]崔玉軍，李艷君，顏焱鋒，等. 規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)：結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2008，48（11）：1549-1555.

[5]Jiang W Z，Zhou H B，Bi H H，et al. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis，tobacco，sorghum and rice[J]. Nucleic Acids Research，2013，41（20）：e188.

[6]Schaeffer S M，Nakata P A. CRISPR/Cas9-mediated genome editing and gene replacement in plants：transitioning from lab to field[J]. Plant Science，2015，240：130-142.

[7]Hsu P D，Scott D A，Weinstein J A，et al. DNA targeting speci-ficity of RNA-guided Cas9 nucleases[J]. Nature Biotechnology，2013，31（9）：827-832.

[8]Zhang Y L，Ge X L，Yang F Y，et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells[J]. Scientific Reports，2014，4：5405.

[9]Maruyama T，Dougan S K，Truttmann M C，et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR/Cas9 by inhibition of non-homologous end joining[J]. Nature Biotechnology，2015，33（5）：538-542.

[10]Chu V T，Weber T，Wefers B，et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells[J]. Nature Biotechnology，2015，33（5）：543-U160.

[11]謝勝松，張 懿，張利生，等. CRISPR/Cas9系統(tǒng)中sgRNA設(shè)計(jì)與脫靶效應(yīng)評(píng)估[J]. 遺傳，2015，37（11）：1125-1136.

[12]Li J H，Shou J，Guo Y，et al. Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9[J]. Journal of Molecular Cell Biology，2015，7（4）：284-298.

[13]Doench J G，Hartenian E，Graham D B，et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation[J]. Nature Biotechnology，2014，32（12）：U130-1262.

[14]Cho S W，Kim S，Kim Y，et al. Analysis of off-targeteffects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases[J]. Genome Research，2014，24（1）：132-141.

[15]Fu Y F，Sander J D，Reyon D，et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs[J]. Nature Biotechnology，2014，32（3）：279-284.

[16]Belhaj K，Chaparro-Garcia A，Kamoun S A，et al. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9[J]. Current Opinion in Biotechnology，2015，32：76-84.

[17]Shan Q W，Wang Y P，Li J，et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system[J]. Nature Biotechnology，2013，31（8）：686-688.

[18]Xu R F，Li H，Qin R Y，et al. Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice[J]. Rice，2014，7（1）：5.

[19]Upadhyay S K，Kumar J，Alok A，et al. RNA-Guided genome editing for target gene mutations in wheat[J]. G3-Genes Genomes Genetics，2013，3（12）：2233-2238.

[20]Liu Y J，Chen C Y，He H X，et al. Lentiviral-mediated gene transfer into human adipose-derived stem cells：role of NELL1 versus BMP2 in osteogenesis and adipogenesis in vitro[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2012，44（10）：856-865.

[21]Voit R A，Mcmahon M A，Sawyer S L，et al. Generation of an HIV resistant t-cell line by targeted “stacking” of restriction factors[J]. Molecular Therapy，2013，21（4）：786-795.

[22]Swiech L，Heidenreich M，Banerjee A A，et al. In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9[J]. Nature Biotechnology，2015，33（1）：102-U286.

[23]Kormann M S，Hasenpusch G，Aneja M K，et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice[J]. Nature Biotechnology，2011，29（2）：U96-154.