海南冬青組培快繁體系的建立

姚紹嫦+譚文明+藍(lán)祖栽

摘要：建立海南冬青（Ilex hainanensis Merr.）的組培快繁技術(shù)體系。以海南冬青成熟種子為材料，以MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)海南冬青種子萌發(fā)、初代誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的影響，篩選出組培快繁各環(huán)節(jié)的最佳培養(yǎng)基配方。研究結(jié)果，海南冬青種子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L，萌發(fā)率達(dá)90%以上；叢生芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，誘導(dǎo)不定芽數(shù)為28.56個(gè)；最佳繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.5 mg/L+KT 0.75 mg/L+NAA 0.1 mg/L，20 d增殖系數(shù)為7.30；最適的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.75 mg/L+NAA 0.5 mg/L，生根率為91.33%，在菜園土-細(xì)河沙（3 ∶1）中移栽成活率為90%。表明本組培快繁技術(shù)體系不但增殖系數(shù)高，而且組培苗質(zhì)量好，可為海南冬青的規(guī)?；a(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)種苗與技術(shù)指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：海南冬青；組培快繁；叢生芽；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S567.1+90.43 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0022-04

海南冬青（Ilex hainanensis Merr.）為冬青科冬青屬常綠小喬木，其干燥葉加工炮制而成的廣西少數(shù)民族民間草藥山綠茶，被收載于《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（1990年版）[1]，具有清熱解毒、消腫止痛、活血通脈的功效，主要用于降血壓、降血脂、降膽固醇以及治療冠心病、腦血管意外所致的偏癱、風(fēng)熱感冒、肺熱咳嗽、咽喉水腫、扁桃體炎、痢疾等病癥[2]。以山綠茶為主要原料制成的制劑作為降壓、降脂的常用中成藥，具有使用量較大、療效確切、毒副作用小、產(chǎn)品獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)，在廣西等地區(qū)市場(chǎng)占有率高，有較好的經(jīng)濟(jì)效益與發(fā)展前景。山綠茶是山綠茶降壓片、決明山綠茶、山綠茶降壓膠囊等產(chǎn)品的主要原料，其中山綠茶降壓片已被收載于中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：WS3-B-2838-98）。目前，山綠茶以采集野生資源為主，隨著近年來(lái)需求量的不斷上升，野生資源已瀕臨滅絕，難以滿足制藥企業(yè)的需求[3]，迫切需要開(kāi)展人工栽培，但目前對(duì)山綠茶的研究主要集中在其制劑的臨床療效[4-5]、含量測(cè)定和炮制方法[6-7]、化學(xué)成分與藥理活性[8-9]等方面，迄今尚未發(fā)現(xiàn)海南冬青有關(guān)組織培養(yǎng)方面的研究報(bào)道。在自然狀態(tài)下，海南冬青主要依靠種子繁殖，由于果實(shí)經(jīng)常在成熟期被鳥(niǎo)類啄食而造成種子大量損失，以及種子具有休眠特性，在自然狀態(tài)下萌發(fā)率低而導(dǎo)致種子繁殖速度緩慢。為了更好地開(kāi)發(fā)和利用海南冬青，本研究通過(guò)組培快繁的技術(shù)手段，建立組培快繁的技術(shù)體系，為開(kāi)展海南冬青的規(guī)?；斯ぴ耘嗵峁﹥?yōu)質(zhì)種苗與技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

海南冬青的成熟漿果于2014年10月采自廣西南寧地區(qū)武鳴縣大明山風(fēng)景區(qū)，標(biāo)本經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院鑒定為海南冬青（Ilex hainanensis Merr.）。

1.2 方法

1.2.1 外植體選擇與滅菌 在海南冬青果實(shí)成熟期（每年10—12月），選取完全成熟的紅色漿果，將果皮搓?duì)€，流水沖洗果皮，挑選沉淀的種子作為外植體進(jìn)行滅菌。在超凈工作臺(tái)上，用紗布袋將種子包好，用75%乙醇（體積分?jǐn)?shù)）浸泡紗布袋5～10 s后，再用0.1% HgCl2水溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別浸泡6、8、10、12 min滅菌種子，用無(wú)菌水搖蕩洗滌4次，用鑷子打開(kāi)紗布袋，再用無(wú)菌吸水紙將種子表面水分吸干后，將種子夾起接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。接種后15 d統(tǒng)計(jì)污染情況。

1.2.2 種子萌發(fā)培養(yǎng) 將種子接種到含不同質(zhì)量濃度6-BA與GA3組合的種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，每處理10瓶，每瓶10粒種子，記錄種子萌發(fā)情況，30 d后統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率，篩選出適合打破休眠促進(jìn)萌發(fā)的培養(yǎng)基。

1.2.3 初代誘導(dǎo)培養(yǎng) 將萌發(fā)的幼苗切取含2片真葉的不定芽進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，采用L9（34）正交試驗(yàn)，在MS基本培養(yǎng)基上以6-BA（A）（1.0、2.0、3.0 mg/L）、KT（B）（0.5、1.0、1.5 mg/L）、NAA（C）（0.1、0.2、0.5 mg/L）3種不同類型的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)海南冬青叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，每種培養(yǎng)基20瓶，每瓶接種3個(gè)芽，30 d 統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)數(shù)量，比較不同組合誘導(dǎo)不定芽的差異，篩選出適合的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.4 繼代增殖培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)獲得的叢生芽切下單個(gè)芽進(jìn)一步轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度6-BA（2.0、2.5、3.0 mg/L）、KT（0.50、0.75、1.00 mg/L）、NAA（0.1 mg/L）組合，每處理10瓶，每瓶3個(gè)芽，觀察記錄芽的生長(zhǎng)情況，20 d統(tǒng)計(jì)增殖情況，計(jì)算芽增殖系數(shù)，篩選出繼代增殖的最佳培養(yǎng)基。

1.2.5 生根培養(yǎng) 切取長(zhǎng)約2 cm的不定芽為生根材料，在1/2MS基本培養(yǎng)基上，添加不同質(zhì)量濃度NAA（0、0.2、0.5 mg/L）與IBA（0、0.50、0.75、1.00 mg/L）組成10個(gè)處理，每處理10瓶，每瓶5個(gè)芽，20 d統(tǒng)計(jì)不同處理的生根率與平均生根數(shù)，考察2種生長(zhǎng)素組合對(duì)生根的影響。

1.2.6 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基均附加3.0%蔗糖和0.5%瓊脂，pH值5.8～6.0，配制分裝后，于121 ℃滅菌20 min。培養(yǎng)條件為26 ℃、光照強(qiáng)度2 000 lx、光照時(shí)間10 h/d。

1.2.7 煉苗移栽 待組培苗生根培養(yǎng)30 d后進(jìn)行煉苗移栽，將瓶蓋打開(kāi)煉苗3～5 d，然后用鑷子將瓶苗取出，用流水洗去粘在根部的瓊脂，移栽到經(jīng)過(guò)消毒的泥炭土、河沙、菜園土、泥炭土-河沙（3 ∶1）、菜園土-河沙（3 ∶1）5種不同基質(zhì)上，移栽后用遮陽(yáng)網(wǎng)遮陰，覆膜保濕，視生長(zhǎng)情況逐漸撤去薄膜，20 d時(shí)統(tǒng)計(jì)不同基質(zhì)的移栽成活率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Excel和SPSS17.0方差分析軟件處理。

萌發(fā)率=30 d后萌發(fā)種子數(shù)/接種種子數(shù)×100%；芽增殖系數(shù)=（20 d后不定芽數(shù)量-接種時(shí)不定芽數(shù)量）/接種時(shí)不定芽數(shù)量；生根率=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%；平均生根數(shù)=總生根數(shù)/接種總數(shù)；成活率=成活苗數(shù)/移栽苗數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌時(shí)間篩選

用0.1% HgCl2溶液對(duì)海南冬青種子進(jìn)行滅菌，從表1可以看出，用0.1% HgCl2溶液滅菌10 min以上，效果較好，成功率顯著高于用0.1% HgCl2溶液滅菌時(shí)間少于10 min的處理，成功率達(dá)95%。HgCl2作為一種滅菌劑，在對(duì)外植體進(jìn)行滅菌的同時(shí)對(duì)其生活力也具有一定的傷害作用，滅菌時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)其傷害的程度越大，在取得相同滅菌效果的情況下，我們認(rèn)為滅菌時(shí)間越短越有利于外植體生活力的保持。當(dāng)滅菌時(shí)間低于10 min時(shí)，污染率較高，滅菌6 min時(shí)外植體全部污染。因此，用0.1% HgCl2溶液滅菌10 min的效果最佳。

2.2 種子萌發(fā)培養(yǎng)

將種子接種到含不同質(zhì)量濃度6-BA與GA3組合的種子萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從表2可以看出，滅菌后的種子接種在不同處理的培養(yǎng)基上均能萌發(fā)，但是萌發(fā)情況差異較大，在添加GA3的培養(yǎng)基上萌發(fā)情況較好，說(shuō)明GA3能有效地打破海南冬青種子的休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)。隨著GA3濃度的增加，種子萌發(fā)率反而出現(xiàn)下降現(xiàn)象，當(dāng)6-BA 0.5 mg/L+GA3 05 mg/L時(shí)，種子初始萌發(fā)時(shí)間最短，且萌發(fā)率最高，達(dá)85%，極顯著高于其他處理，達(dá)到較好的種子萌發(fā)效果。種子在6-BA 0.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L組合的培養(yǎng)基上培養(yǎng) 15 d 后開(kāi)始萌發(fā)，20 d后胚芽出現(xiàn)，并且開(kāi)始迅速生長(zhǎng)（圖1-A），至35 d時(shí)，種子苗高已1～2 cm（具2張以上真葉），此時(shí)，切取含2張真葉的不定芽進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。因此，適合海南冬青種子萌發(fā)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+GA30.5 mg/L。

2.3 初代誘導(dǎo)培養(yǎng)

將種子萌發(fā)后切取的不定芽轉(zhuǎn)接到以MS為基本培養(yǎng)基，不同質(zhì)量濃度6-BA與NAA配比的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中不定芽繼續(xù)生長(zhǎng)，無(wú)愈傷組織產(chǎn)生。培養(yǎng)10 d后，不定芽的腋芽開(kāi)始不斷分化而形成大量叢生芽（圖1-B），培養(yǎng)30 d后，大量叢生芽使得不定芽呈簇狀結(jié)構(gòu)，此時(shí)可進(jìn)行繼代轉(zhuǎn)接（圖1-C）。

從表3可以看出，在初代誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，不同激素組合對(duì)海南冬青叢生芽的誘導(dǎo)效果差別很大。在6-BA 3.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L組合下，不定芽數(shù)量最多，達(dá)到28.56個(gè)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的極差R大小決定各生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽誘導(dǎo)影響程度依次為A>B>C，即6-BA>KT>NAA，最優(yōu)組合為A3B2C1。由方差分析可知，6-BA對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)作用達(dá)到顯著水平，KT、NAA對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)作用均不顯著（表4）。因此，6-BA為主要因素，KT、NAA為次要因素。在6-BA濃度保持在0～3.0 mg/L之間時(shí)，不定芽數(shù)量與濃度成正比，適當(dāng)高濃度的6-BA對(duì)叢生芽的產(chǎn)生起到積極作用。從不定芽生長(zhǎng)狀況來(lái)看，各處理均無(wú)玻璃化現(xiàn)象發(fā)生，6-BA 3.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L處理組合不定芽長(zhǎng)勢(shì)明顯比其他處理強(qiáng)，因此，綜合考慮正交試驗(yàn)結(jié)果與不定芽生長(zhǎng)狀況，采用6-BA 3.0 mg/L、KT 1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L組合，以此組合進(jìn)行海南冬青叢生芽誘導(dǎo)可獲得不定芽更多的數(shù)量與更優(yōu)的品質(zhì)。

2.4 繼代增殖培養(yǎng)

將初代培養(yǎng)獲得的叢生芽切下單個(gè)不定芽轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，在充分考慮初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中各激素影響的情況下，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度6-BA、KT與0.1 mg/L NAA組合，對(duì)繼代增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

從表5可以看出，不同質(zhì)量濃度的6-BA與KT組合獲得的芽增殖系數(shù)差異較大，6-BA是增加芽增殖系數(shù)的主導(dǎo)因素，當(dāng)6-BA濃度為2.5 mg/L時(shí)，與不同濃度的KT組合均獲得較高的芽增殖系數(shù)，其中以6-BA 2.5 mg/L+KT 0.75 mg/L+NAA 0.1 mg/L組合獲得最好的效果，培養(yǎng)20 d后實(shí)現(xiàn)芽增殖系數(shù)7.30倍，極顯著高于其他處理，且不定芽生長(zhǎng)健壯，展葉良好，長(zhǎng)勢(shì)快，有利于下一步生根誘導(dǎo)（圖2-A）。當(dāng)6-BA濃度增加到3.0 mg/L時(shí)，芽增殖系數(shù)反而出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，且不定芽的質(zhì)量也有所下降，叢生芽容易出現(xiàn)簇狀而抑制了芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，不利于下一步生根培養(yǎng)（圖2-B）。當(dāng)6-BA濃度相同時(shí)，KT濃度的增加對(duì)芽增殖系數(shù)的影響差異不大。因此，MS+6-BA 2.5 mg/L+KT 0.75 mg/L+NAA 0.1 mg/L 培養(yǎng)基是最適宜海南冬青叢生芽增殖的培養(yǎng)基。

2.5 生根培養(yǎng)

切取長(zhǎng)約2 cm的不定芽為生根材料，在1/2MS基本培養(yǎng)基上添加不同濃度NAA或IBA進(jìn)行生根培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計(jì)生根率及平均生根數(shù)（表6）。不定芽轉(zhuǎn)接7 d后根原基開(kāi)始形成， 20 d后苗生長(zhǎng)良好，根長(zhǎng)且粗壯，莖基部無(wú)愈傷組織產(chǎn)生。不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)不定芽生根率的影響較明顯，IBA濃度相同時(shí)，NAA濃度增加對(duì)生根率與平均生根數(shù)的增加均有促進(jìn)作用，根較細(xì)長(zhǎng)。2種生長(zhǎng)素同時(shí)添加出現(xiàn)了促進(jìn)生根的疊加效應(yīng)，生根率、平均根數(shù)均比單獨(dú)使用IBA時(shí)高，當(dāng)IBA 0.75 mg/L+NAA 0.5 mg/L組合時(shí)，生根率為91.33%，平均生根數(shù)為5.90條，二者均達(dá)到最大值，極顯著高于其他處理，且根粗壯、發(fā)達(dá)，有利于下一步移栽成活（圖3-A、圖3-B）。因此，1/2MS+IBA 0.75 mg/L+NAA 0.5 mg/L 較適合海南冬青誘導(dǎo)生根。

2.6 試管苗的移栽

待組培苗生根培養(yǎng)30 d后進(jìn)行煉苗移栽。從表7可以看出，試管苗在不同基質(zhì)上的成活率由高到低依次為菜園土-河沙（3 ∶1）>菜園土>泥炭土>泥炭土-河沙（3 ∶1）>河沙，其中，試管苗在菜園土-河沙（3 ∶1）的基質(zhì)中移栽30 d后成活率達(dá)到90%（圖3-C），極顯著高于其他處理。移栽180 d后，植株高超過(guò)15 cm，生長(zhǎng)良好（圖3-D），可進(jìn)行大田移栽。因此，試管苗移栽最適宜的基質(zhì)為菜園土-河沙（3 ∶1）。

3 討論

多數(shù)冬青屬植物的種子具有休眠特性而影響其快速繁育，其休眠期長(zhǎng)短因種而異，如大葉冬青（Ilex latifolia）種子的休眠期長(zhǎng)達(dá)3年[10]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)海南冬青種子具有短暫的休眠期，秋季采集的種子需在4 ℃低溫貯藏3個(gè)月方可有效解除休眠[3]。本試驗(yàn)中，為了解除海南冬青新鮮種子的休眠，我們?cè)诜N子萌發(fā)培養(yǎng)基中添加GA3，結(jié)果表明，GA3能有效地打破海南冬青種子的休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)，當(dāng)6-BA 0.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L時(shí)，種子初始萌發(fā)時(shí)間最短，且萌發(fā)率最高，達(dá)85%，達(dá)到較好的種子萌發(fā)效果，與前人采用GA3在解除大果冬青與狹葉冬青等同屬植物的種子休眠上取得較好的積極作用的研究結(jié)果[11-12]一致。

在植物組織培養(yǎng)中，外植體初代誘導(dǎo)的結(jié)果除了與外植體本身取材有關(guān)，也與培養(yǎng)過(guò)程中使用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑密切相關(guān)[13]。目前尚未發(fā)現(xiàn)海南冬青組織培養(yǎng)方面的研究報(bào)道，同屬植物組織培養(yǎng)方面，研究報(bào)道也較少。王慧瑜等以大葉冬青當(dāng)年生嫩枝為外植體，以BA與NAA或者IBA組合實(shí)現(xiàn)了叢生芽的誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)[14]。楊燦等以紅果冬青的莖段進(jìn)行組培試驗(yàn)，誘導(dǎo)出叢生芽，并在低濃度的BA與KT配合下實(shí)現(xiàn)芽的繼代增殖[15]。同屬植物多數(shù)是以莖段為外植體直接誘導(dǎo)不定芽，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，海南冬青植株內(nèi)含多酚類物質(zhì)較多，選用其嫩芽或者帶芽莖段作為外植體十分容易褐化而不利于不定芽誘導(dǎo)，種子是較理想的外植體材料，具有容易消毒、生長(zhǎng)力旺盛的特點(diǎn)。本試驗(yàn)采用種子萌發(fā)形成的無(wú)菌苗切去根部后作為材料進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)與增殖。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和質(zhì)量濃度對(duì)海南冬青的不定芽誘導(dǎo)與增殖有較大影響。使用6-BA、KT與NAA組合進(jìn)行初代誘導(dǎo)與繼代增殖篩選，6-BA對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)作用達(dá)到顯著水平，是海南冬青叢生芽形成與增殖的關(guān)鍵因素，其中以6-BA 3.0 mg/L 的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，在一定范圍內(nèi)不定芽的誘導(dǎo)數(shù)量與增殖系數(shù)隨著6-BA濃度的增加而增加。KT作為促進(jìn)側(cè)芽發(fā)生發(fā)育的外源性細(xì)胞分裂素，組織培養(yǎng)中主要用于促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，與五指毛桃[16]類似，在培養(yǎng)基中配合使用低濃度的KT對(duì)海南冬青不定芽的誘導(dǎo)與增殖均具有較大的促進(jìn)效應(yīng)。高濃度的細(xì)胞分裂素與低濃度的NAA配合使用，有利于不定芽的分化，NAA 0.1 mg/L與高濃度的6-BA、KT組合時(shí)達(dá)到較好的效果，與楊燦等在紅果冬青的研究結(jié)果相符。在本試驗(yàn)中，以種子萌發(fā)產(chǎn)生的無(wú)菌苗進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，成功誘導(dǎo)出較多的不定芽（不定芽數(shù)量28.56個(gè)），幼小的不定芽繼代培養(yǎng)20 d后又獲得7.30的增殖系數(shù)，而且在培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)愈傷組織產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)了以芽繁芽的技術(shù)特點(diǎn)，在有效減少變異的同時(shí)大大提高了繁殖的速度。

海南冬青不定芽在附加不同質(zhì)量濃度IBA或NAA的 1/2MS培養(yǎng)基上均可生根，且2種生長(zhǎng)素同時(shí)添加出現(xiàn)了促進(jìn)生根的疊加效應(yīng)，其中較適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.75 mg/L+NAA 0.5 mg/L，培養(yǎng)20 d后可以獲得再生植株，生根率達(dá)91.33%。在不添加生長(zhǎng)素類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的空白對(duì)照中，未發(fā)現(xiàn)生根，說(shuō)明生長(zhǎng)素類對(duì)海南冬青生根起到了促進(jìn)作用。基質(zhì)的選擇對(duì)于試管苗的移栽成功與否也十分重要，適宜基質(zhì)可以確保較高的試管苗移栽成活率。菜園土肥力較高，團(tuán)粒結(jié)構(gòu)好，但是干時(shí)表層易板結(jié)，濕時(shí)通氣透水性差；河沙通氣透水性好，但是肥力與保水性較差。本試驗(yàn)把這2種基質(zhì)按3 ∶1的比例混合，可有效彌補(bǔ)這2種基質(zhì)的不足，在海南冬青試管苗移栽上取得了較好的效果，移栽成活率達(dá)到90%。

利用組織培養(yǎng)技術(shù)能生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗，但組培苗能否在生產(chǎn)上迅速應(yīng)用推廣，與其移栽的便捷性、成活率、培養(yǎng)成本等密切相關(guān)[17]。本研究通過(guò)對(duì)海南冬青組培快繁過(guò)程中各技術(shù)環(huán)節(jié)的影響因子進(jìn)行試驗(yàn)與優(yōu)化，篩選出海南冬青種子萌發(fā)、不定芽誘導(dǎo)、增殖、生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，建立了海南冬青組培快繁的技術(shù)體系，研究結(jié)果具有擴(kuò)繁系數(shù)大、栽培管理便捷、成活率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，能短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出大量海南冬青優(yōu)質(zhì)種苗，具有較好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳. 廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)（1990年版）[M]. 南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1992：137-138.

[2]周思祥. 山綠茶的化學(xué)成分和生物活性研究[D]. 北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2007：15.

[3]姚紹嫦，藍(lán)祖栽，譚文明，等. 山綠茶種子萌發(fā)特性研究[J]. 種子，2015，34（3）：47-50.

[4]陳 勇，甄漢深，李耀華，等. 山綠茶不同炮制品的質(zhì)量研究[J]. 中成藥，2005，27（7）：786-790.

[5]陳 勇，李艷荃，李 立. HPLC法測(cè)定山綠茶不同炮制品種中綠原酸和蘆丁的含量[J]. 廣西科學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，22（增刊1）：416-418，421.

[6]藏 吾，馬明彥. 山綠茶降壓片治療原發(fā)性高血壓的療效觀察[J]. 中成藥，1997，19（12）：21-22.

[7]唐耀平，劉 鷹，方顯明. 山綠茶治療老年單純收縮期高血壓80例分析[J]. 中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22（8）：1502-1503.

[8]解軍波，李 萍. 冬青屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2002，33（1）：85-88.

[9]程齊來(lái)，李洪亮，彭金年. 山綠茶化學(xué)成分的研究[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室，2010，27（1）：131-134.

[10]張 蕊，王秀花，章建紅，等. 3種冬青屬種子解休眠過(guò)程中的生理變化[J]. 浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，27（4）：524-528.

[11]徐本美，史曉華，孫運(yùn)濤，等. 大果冬青種子的休眠與萌發(fā)初探[J]. 種子，2002（3）：1-2，5.

[12]何彥峰. 狹葉冬青種子休眠與萌發(fā)的研究[J]. 浙江林業(yè)科技，2008，28（3）：63-65.

[13]朱麗芳，史 俊，朱再標(biāo)，等. 老鴉瓣芽莖組織培養(yǎng)初步研究[J]. 中草藥，2014，45（4）：563-568.

[14]王慧瑜，張曉申，趙海紅，等. 大葉冬青組培快繁技術(shù)研究[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊，2012（10）：69-70.

[15]楊 燦，陳麗潔，黃小輝，等. 紅果冬青組培快繁技術(shù)研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，34（4）：356-359.

[16]李林軒，吳慶華，蔡錦源，等. 五指毛桃組織培養(yǎng)獲得再生植株的研究[J]. 中草藥，2014，45（17）：2547-2551.

[17]葉祖云，阮少江，楊卓飛. 四倍體太子參種苗繁育技術(shù)體系的建立[J]. 中藥材，2011，34（3）：340-342.馮立娟，焦其慶，尹燕雷，等. 石榴果皮DHQ/SDH基因的克隆及序列分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（1）：26-29.