山荊子葉總黃酮體外抗氧化活性研究

楊秀東++郭永真++張嬪妹++周鴻立

摘要：采用水提醇沉法及溶劑萃取法提取山荊子葉，測(cè)定不同提取物的總黃酮含量。通過(guò)對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基和超氧陰離子清除作用研究了山荊子葉體外抗氧化活性。結(jié)果顯示，山荊子葉水提取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水萃取物中的總黃酮含量分別為0.98%、1.62%、4.23%、1.46%和0.313%。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山荊子葉乙酸乙酯萃取物具有較強(qiáng)的DPPH自由基、ABTS自由基活性以及超氧陰離子清除能力。山荊子葉可以作為天然抗氧化劑，為山荊子的綜合利用與開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：總黃酮；山荊子；抗氧化；DPPH；ABTS

基金項(xiàng)目：吉林化工學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金（批準(zhǔn)號(hào)：2016007）

中圖分類號(hào)： R284.2；R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.22.033

山荊子（Malus baccata （Linn） Borkh），為薔薇科（Rosaceae）蘋(píng)果屬多年生木本植物，主要分布于我國(guó)東北、華北和西南地區(qū)，在蒙古、朝鮮、俄羅斯西伯利亞等地也有分布[1]，吉林省內(nèi)大部分山區(qū)都有分布。隨著綠色食品的快速發(fā)展，其果實(shí)在食品工業(yè)中是釀酒和調(diào)制純綠色飲品的原料，多用于加工果脯、蜜餞和清涼飲料等[2]。其葉在我國(guó)很多地區(qū)可以煮茶用來(lái)減肥[3]。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)山荊子果實(shí)和葉的化學(xué)成分及藥理作用研究還鮮有報(bào)道，其果實(shí)中的主要化學(xué)成分包括萜類、酯類、烯烴類、多酚類以及黃酮類化合物，同時(shí)還含有錳、硒和鋅等微量元素[4， 5]。而葉中的主要成分為多酚類和黃酮類化合物[6]。與此同時(shí)，現(xiàn)代藥理作用研究表明，山荊子果實(shí)中的多酚類成分具有對(duì)輻射誘導(dǎo)的機(jī)體氧化損傷的保護(hù)作用[7]，山荊子不同溶劑提取物具有明顯的抗氧化活性，且其中乙酸乙酯提取物和丙酮提取物分別對(duì)人類子宮癌HeLa細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞增殖具有抑制作用[8]。另外，山荊子葉提取物對(duì)脂肪酸合酶具有抑制作用，顯示其可能應(yīng)用于減肥[3]。葉提取物還能夠明顯的改善糖尿病小鼠血糖和血脂的紊亂[6]，并對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有較好的保護(hù)作用[9]。本研究對(duì)山荊子葉不同溶劑萃取物的總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行比較，并初步探討其黃酮含量與體外抗氧化活性的關(guān)系，為開(kāi)發(fā)和利用山荊子資源提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

山荊子葉于2015年10月采于長(zhǎng)春市郊，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院教授李勇鑒定為薔薇科（Rosaceae）蘋(píng)果屬（Malus）植物山荊子的干燥葉。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品鑒定所；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH），ABTS 購(gòu)自美國(guó)sigma公司；Vitamin C 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、焦性沒(méi)食子酸、過(guò)硫酸鉀、硫酸亞鐵等藥品均為分析純?cè)噭┵?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SpectraMax Plus384型酶標(biāo)儀。美國(guó)Molecular Devices公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；KQ-118型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；FA2004N型分析天平，上海精密科學(xué)股份有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市正基儀器有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1提取階段 精確稱取50克干燥后山荊子陰干葉，剪碎，置于1000 毫升圓底燒瓶中，加入500毫升蒸餾水，浸泡過(guò)夜，加熱回流2次，每次2小時(shí)。提取液減壓濃縮至400毫升。加入95%乙醇至醇濃度為80%，靜置過(guò)夜，抽濾，上清液減壓濃縮至體積為400毫升，然后依次將提取液分次用等體積的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取各萃取2次，不同溶劑萃取液減壓濃縮，干燥后得浸膏，浸膏質(zhì)量分別為：氯仿部分376.24毫克，乙酸乙酯部分34.31毫克，正丁醇437.79毫克，水提液1232.37毫克。

1.3.2 總黃酮含量測(cè)定 總黃酮含量測(cè)定方法參照胡衛(wèi)成等的方法制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密配制0.2 毫克/毫升對(duì)照品蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)液，精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0毫升分別置于10毫升容量瓶中，然后加入5% NaNO2溶液0.3毫升，搖勻，放置6分鐘，加入10 %Al（NO3）3溶液0.3毫升，搖勻，放置6分鐘，加入4 % NaOH溶液4.0 毫升，最后加入80 %乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15分鐘。以80%乙醇溶液為空白對(duì)照，用紫外分光光度法于515納米波長(zhǎng)處測(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算總黃酮含量。山荊子葉提取液和不同溶劑萃取物按上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，與515納米波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

1.3.3抗氧化活性的測(cè)定

1.3.3.1 清除DPPH自由基活性實(shí)驗(yàn) DPPH用甲醇溶解配制成0.16毫摩爾/升DPPH甲醇溶液。取不同濃度的樣品甲醇溶液和Vc甲醇溶液100微升分別加入96孔板并加入100微升的DPPH溶液，空白用甲醇代替樣品溶液。于波長(zhǎng)517納米下測(cè)定其吸光度。每份樣品平行操作3次。

清除率（%）=[A空白-A樣品]/A空白×100

提取物的半數(shù)抑制率用IC50值表示

1.3.3.2清除ABTS自由基活性的測(cè)定ABTS陽(yáng)離子自由基的產(chǎn)生是通過(guò)ABTS原液與過(guò)硫酸鉀在室溫黑暗中反應(yīng)12～16 小時(shí)完成，在供氫抗氧化劑存在的情況下，ABTS+自由基會(huì)減少。將5毫升，7 毫摩爾/升ABTS+和88 微升140 毫摩爾/升的過(guò)硫酸鉀（終濃度）混合，在室溫避光條件下靜止過(guò)夜，將生成的ABTS+工作液用水稀釋20～40倍，使其在734 微升波長(zhǎng)下的吸光度為0.7±0.02，即得到ABTS+工作液。取不同濃度的山荊子樣品溶液和Vc甲醇溶液10 微升放入96孔板，并加入190 微升的ABTS+工作液，空白用甲醇代替樣品溶液。室溫避光放置6分鐘，于波長(zhǎng)734納米下測(cè)定其吸光度。每份樣品平行操作3次。

計(jì)算公式為清除率（%）=[A空白-A樣品]/A空白×100

提取物半數(shù)抑制濃度用IC50值表示

1.3.3.3超氧陰離子清除實(shí)驗(yàn) 稍作超氧陰離子清除實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系包括：200微升的50 毫摩爾/升Tris-HCl緩沖溶液，20 微升不同濃度的山荊子樣品溶液或Vc溶液，20 微升的25 毫摩爾/升鄰苯三酚溶液，混合后立即放入酶標(biāo)儀中，連續(xù)測(cè)定4分鐘，以吸光度變化率計(jì)算樣品對(duì)超氧陰離子的清除率。

2結(jié)果與討論

2.1總黃酮含量

以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁對(duì)照品溶液的濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行直線回歸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A=13.07C-0.0075，R2=0.9993，結(jié)果表明蘆丁在0.0103～0.0824毫克/毫升濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。山荊子的總水提取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物的總黃酮含量分別為生藥材的0.98%、1.62%、4.23%、1.46%和0.31%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山荊子乙酸乙酯萃取物的總黃酮含量最高，其次是氯仿提取物。

2.2山荊子葉的不同提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

由圖1可知，山荊子葉不同提取物在測(cè)試濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基均具有一定的清除作用，且其清除作用與濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，其中乙酸乙酯萃取物對(duì)DPPH自由基清除作用最強(qiáng)，在濃度為0.1毫克/毫升和0.2毫克/毫升時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率分別為76.2%和83.6%。其次為正丁醇萃取物，其DPPH清除作用僅次于乙酸乙酯提取物。而其他提取物也顯示了不同程度的DPPH清除活性。結(jié)果證明，山荊子葉具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除作用。

2.3山荊子葉的不同提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力

山荊子葉不同提取物對(duì)ABTS清除作用如圖2所示，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，山荊子葉不同提取物都顯示了一定的ABTS清除作用，且其清除作用隨著樣品濃度增大而增加。其中以乙酸乙酯萃取物的ABTS自由基清除率最高，當(dāng)其濃度達(dá)到0.200毫克/毫升時(shí)，ABTS自由基清除率達(dá)到最高，最高值為77.1 %，表明ABTS自由基基本被清除。而在此濃度下，正丁醇層的ABTS清除率僅次于乙酸乙酯層，清除率為72.7%。結(jié)果證明，總黃酮含量較高的乙酸乙酯萃取物能夠較好的清除ABTS。

2.4山荊子葉不同提取物對(duì)超氧陰離子自由基清除能力

由圖3可知，山荊子葉不同提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力呈濃度依賴關(guān)系，而其中乙酸乙酯萃取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力明顯高于其他提取物，當(dāng)濃度為2.4 毫克/毫升時(shí)，其清除率達(dá)到40.3%，相同濃度下，其他提取物的清除率均低于25%。

3 結(jié)論

黃酮類化合物是廣泛存在于植物界中的一類天然多酚類成分，具有廣譜的藥理作用，近年來(lái)已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外植物藥的開(kāi)發(fā)熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法提取了山荊子陰干葉，并進(jìn)一步用不同溶劑進(jìn)行萃取，其中各萃取物總黃酮含量測(cè)定結(jié)果顯示乙酸乙酯萃取物的總黃酮含量最高，其次為氯仿提取物和正丁醇萃取物，而水提取物和水萃取物含量最低。

山荊子葉不同提取物抗氧化活性研究表明，乙酸乙酯萃取物對(duì)DPPH、ABTS和超氧陰離子的清除作用明顯高于其他提取物，結(jié)合其含量測(cè)定結(jié)果，其抗氧活作用與黃酮類物質(zhì)含量相關(guān)。與此同時(shí)，正丁醇萃取物的抗氧化活性較氯仿萃取物和水萃取物的作用強(qiáng)，可能由于山荊子葉中還含有其他多酚類物質(zhì)，而多酚類物質(zhì)同樣是具有抗氧化活性，因此正丁醇萃取物的抗氧化活性可能與多酚類物質(zhì)有關(guān)。本研究結(jié)果表明，山荊子葉是一種潛在的天然抗氧化劑，具有廣闊的開(kāi)發(fā)和利用前景。

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作者簡(jiǎn)介：楊秀東，博士，吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，講師，研究方向：天然產(chǎn)物及其生物活性研究。

通訊作者：周鴻立，吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，教授，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)。