姜黃素對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC—1體外侵襲轉(zhuǎn)移的影響

陳龍佩等

[摘 要] 目的：探討姜黃素對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法：以10μmol/mL、 20μmol/mL、30μmol/mL和60 μmol/mL姜黃素處理胰腺癌PANC-1細(xì)胞，MTT 法檢測(cè)其對(duì)PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)和抑制作用。應(yīng)用Transwell小室進(jìn)行人工重組基底膜（Matrigel）侵襲和運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，觀察姜黃素對(duì)PANC-1細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果：應(yīng)用姜黃素處理后胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制且作用呈時(shí)效、量效依賴關(guān)系；非致死濃度姜黃素處理后胰腺癌PANC-1細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移明顯降低。結(jié)論：姜黃素能夠減弱胰腺癌細(xì)胞PANC-1的侵襲和轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞] 胰腺癌；姜黃素；侵襲；轉(zhuǎn)移

中圖分類號(hào)：R 735.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)：2095-5200（2015）04-001-03

[Abstract] Objective： To explore the effects of curcumin on invasion and metastasis of the human pancreatic cancer cells PANC-1. Method： PANC-1 were treated with 10， 20，30 and 60μmol/ml curcumin，respectively. Proliferation of PANC-1 cells was measured with MTT assay. Invasion and metastasis of PANC-1 cells were evaluated with Transwell chamber. Result： After being treated with curcumin， the proliferation of Pancreatic cells was inhibited in a time and dose-depending manner. The invasion and metastasis of Pancreatic cells were also inhibited. Conclusion： Curcumin could restrain the invasion and metastasis of the human pancreatic cancer cells PANC-1.

[Key words] pancreatic cancer；curcumin；invasion；metastasis

胰腺癌是較常見的消化系惡性腫瘤，該疾病的早期診斷十分困難，多數(shù)新發(fā)病例已存在周圍器官侵犯和/或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 [1]。因此，探索有效的抗胰腺癌藥物對(duì)降低胰腺癌死亡率極其重要。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素（curcumin）具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化和抗腫瘤特性[2-6]。但姜黃素對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響尚未明確。本研究擬探討姜黃素對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞體外侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，為姜黃素的進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)試劑人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1購(gòu)自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）的DMEM（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）高糖培養(yǎng)基（ 內(nèi)含1%的青霉素和鏈霉素） 。姜黃素、四甲基偶氮唑藍(lán)（ MTT） 購(gòu)于Sigma 公司。Transwell小室及聚碳酸酯購(gòu)自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 胰腺癌PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃，5% CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 每48 h換液傳代1次，倍增時(shí)間約24 h。取2代生長(zhǎng)良好，細(xì)胞活性大于98%的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用不同濃度的姜黃素（10μmol/mL、 20μmol/mL、30μmol/mL和60 μmol/mL）作用后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.2 MTT法（比色實(shí)驗(yàn)）測(cè)定細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL。取3塊96孔培養(yǎng)板每孔接種細(xì)胞懸液200μL，設(shè)未加藥細(xì)胞組、姜黃素組（設(shè)10 μmol/mL、20 μmol/mL、30 μmol/mL、60 μmol/mL 4個(gè)濃度于細(xì)胞80%處于融合狀態(tài)后加藥），每組設(shè)5個(gè)平行孔。置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24h、48h和72 h后棄上清，每孔加入MTT 20μL（5 mg/mL）及無(wú)血清DMEM 200 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h， 取出后2 000 r/min（r =15 cm）離心10 min，棄上清，每孔加200 μL DMSO 震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm 的吸光值（A）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。計(jì)算藥物在不同濃度、不同作用時(shí)間對(duì)PANC-1細(xì)胞的抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=1-（ A實(shí)驗(yàn)組-A空白） /（ A對(duì)照組-A空白） ×100%。

1.2.3 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲能力 在Transwell小室上下室之間置8μm聚碳酸醋濾膜，上室底部涂上Matrigel 50μg/孔（Matrigel：serum-free DMEM=1：3）后，置于37 ℃，5% CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中24h，取出制膠完成的Transwell侵襲小室。因20μmol/mL姜黃素處理后細(xì)胞活力與10μmol/mL沒(méi)有顯著的差別，為證明姜黃素對(duì)胰腺癌PANC-1具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，故選用10μmol/mL的姜黃素濃度與30μmol/mL的姜黃素濃度處理后進(jìn)行比較；而60μmol/mL的姜黃素濃度處理后胰腺癌PANC-1本身的抑制率已經(jīng)超過(guò)50%。Transwll實(shí)驗(yàn)結(jié)果是累計(jì)數(shù)目的結(jié)果，24h后一般細(xì)胞還有可以穿透膠的活力，而超過(guò)48h后PANC-1細(xì)胞活力大部分喪失。侵襲實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞本身活力有關(guān)，故一般超過(guò)20%致死率濃度不采用，超過(guò)48h的時(shí)間點(diǎn)不采用。因此取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組10μmol/mL、30μmol/mL濃度姜黃素處理48h細(xì)胞，消化離心后調(diào)整細(xì)胞密度為3× 105個(gè)/mL，分別取200 μL接種至上室，置于24孔板內(nèi)，同時(shí)在下室中加入含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基600 μL，培養(yǎng)48 h后，取出小室，用棉簽頭擦掉 Matrigel膠，PBS液洗3次，800 μL的冰凍甲醇中固定。常規(guī)甲紫染色，完整取下小室膜反面貼在載玻片上。結(jié)果判定：200 倍光鏡下，計(jì)數(shù)每膜5個(gè)隨機(jī)不同視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值，每組平行設(shè)3個(gè)小室。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)處理 計(jì)量數(shù)據(jù)資料用x±s 表示，用t檢驗(yàn)和方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖能力的影響

分別采用10μmol/mL、 20μmol/mL、30μmol/mL和60 μmol/mL的姜黃素濃度處理胰腺癌PANC-1細(xì)胞。結(jié)果顯示姜黃素對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖有抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。并隨時(shí)間延長(zhǎng)和藥物濃度加大而增強(qiáng)，即呈時(shí)效、量效依賴關(guān)系（P<0.05），見圖1。

2.2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

如下圖所示， 10μmol/mL姜黃素處理組（B組）、30μmol/mL姜黃素處理組（C組），PANC-1細(xì)胞穿過(guò)侵襲小室的侵襲細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組（A組）侵襲細(xì)胞數(shù)相比較，較高濃度的姜黃素處理后的胰腺癌PANC-1細(xì)胞穿過(guò)的數(shù)目明顯減少（A組穿透細(xì)胞數(shù)約：300；B組穿透細(xì)胞數(shù)約：237；C組穿透細(xì)胞數(shù)約：132），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

胰腺癌具有惡性程度高、進(jìn)展快、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差等特點(diǎn)，號(hào)稱“癌中之王”。雖然近年來(lái)胰腺癌的發(fā)病率和死亡率在緩慢下降，但胰腺癌仍是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因。目前胰腺癌的5年生存率僅為4%，而1年生存率也只有21%[7]，主要原因?yàn)榇蠖鄶?shù)患者就診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，抑制胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的治療策略一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，癌癥的多學(xué)科綜合治療得到了極大發(fā)展。我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥在腫瘤治療中地位愈發(fā)受到重視。姜黃素已被證實(shí)對(duì)包括乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用 [8-10]。但姜黃素對(duì)PANC-1細(xì)胞侵襲的影響至今尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用Transwell方法探討姜黃素在體外對(duì)PANC-1細(xì)胞侵襲能力的影響。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、生存，并證實(shí)了姜黃素對(duì)抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖具有時(shí)效、量效的關(guān)系，這與既往研究結(jié)果相一致[11-12]。為排除藥物對(duì)細(xì)胞活性的影響，本次實(shí)驗(yàn)采用了低于20%的非致死濃度姜黃素處理PANC-1細(xì)胞，觀察藥物處理前后細(xì)胞侵襲能力的變化。腫瘤細(xì)胞分泌蛋白降解酶等降解細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要步驟，侵襲小室實(shí)驗(yàn)即模擬了細(xì)胞外基質(zhì)的環(huán)境，降解基質(zhì)的腫瘤細(xì)胞要得以從低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基遷移至高營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，通過(guò)檢測(cè)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)可間接反映腫瘤細(xì)胞侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素可顯著抑制PANC-1細(xì)胞侵襲能力，有望用于抗PANC-1治療，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。在本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，可考慮在后續(xù)研究中探討姜黃素在胰腺癌的動(dòng)物模型中作用，觀測(cè)其對(duì)轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)基因或信號(hào)通路影響，進(jìn)一步揭示姜黃素抑制PANC-1細(xì)胞的機(jī)制，為胰腺癌綜合治療提供新思路。

參 考 文 獻(xiàn)

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