姜黃素干預(yù)耐吉非替尼肺腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及相關(guān)機(jī)制的研究

陳灝　詹建偉　王利民　陳清勇　葉健

[摘要] 目的 探討姜黃素對(duì)耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD細(xì)胞的生物學(xué)特性影響以及干預(yù)其上皮間質(zhì)化過(guò)程（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）的相關(guān)機(jī)制。 方法 采用體外姜黃素作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD細(xì)胞；分別通過(guò)形態(tài)學(xué)、MTT法、transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)姜黃素干預(yù)的耐藥細(xì)胞株的形態(tài)特征、藥物敏感性和侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化；通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波形蛋白、上皮鈣粘附分子在藥物作用后的表達(dá)差異以及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中相關(guān)蛋白 AKT、mTOR的變化情況。 結(jié)果 與人肺腺癌PC9細(xì)胞比較，PC9/ZD耐藥細(xì)胞株呈間質(zhì)樣細(xì)胞表型；與親代PC9/ZD細(xì)胞比較，經(jīng)姜黃素作用后的PC9/ZD細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性明顯增強(qiáng)，轉(zhuǎn)移能力減弱（75.67±8.82 vs 103.67±13.67）；侵襲能力減弱（17.22±3.63 vs 59.89±8.19）；波形蛋白表達(dá)下調(diào)（1.07±0.23 vs 1.28±0.28），上皮鈣粘附分子表達(dá)上調(diào)（0.82±0.27 vs 0.29±0.11）；AKT、mTOR磷酸化減弱（0.20±0.05 vs 0.63±0.17，0.72±0.25 vs 1.10±0.19）。 結(jié)論 姜黃素可以通過(guò)阻斷PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路而明顯干預(yù)耐吉非替尼肺腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程。

[關(guān)鍵詞] 肺腺癌；吉非替尼耐藥；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；生物學(xué)特性；姜黃素

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285.5；R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）32-0001-04

吉非替尼作為一種常規(guī)治療肺癌的化療藥物，在臨床上有著不錯(cuò)的療效，但還有很多肺癌患者會(huì)出現(xiàn)原發(fā)性耐藥或繼發(fā)性耐藥的現(xiàn)象。已有研究表明腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是其獲得耐藥能力的重要因素之一[1，2]。目前，姜黃素公認(rèn)為是姜黃中最有效和最豐富的活性成分之一。一方面，姜黃素的抗炎、抗凝、抗氧化等作用不斷被人們所證實(shí)[3]；另一方面，姜黃素的抗腫瘤機(jī)制也成為熱點(diǎn)[4]。本研究通過(guò)體外姜黃素作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)特性的檢測(cè)，分析其干預(yù)EMT過(guò)程的相關(guān)機(jī)制，旨在為進(jìn)一步研究姜黃素干預(yù)肺腺癌耐藥細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)所涉及的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子或相關(guān)通路打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

①吉非替尼（Gefitinib）（阿斯利康制藥有限公司產(chǎn)品）；②DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Thermo公司產(chǎn)品）；③胰酶、PBS溶液（Hyclone公司產(chǎn)品）；④人結(jié)腸癌PC9細(xì)胞株（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；⑤人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株（同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供）；⑥甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、山羊抗兔IgG二抗、β-actin（biosharp公司產(chǎn)品）；⑦M(jìn)atrigel膠、transwell小室、培養(yǎng)瓶、離心管（美國(guó)CORNING公司）；⑧E-cadherin、Vimentin、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT、GAPDH一抗（Abcam公司）。

1.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

采用倒置相差顯微鏡（OLYMPUS 200×）觀察人肺腺癌PC9細(xì)胞株和人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株。

1.3 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株接種至5 cm×5 cm大小的培養(yǎng)瓶，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶80%左右進(jìn)行傳代?？蓪⒓?xì)胞凍存在-80℃的超低溫冰箱中，解凍后細(xì)胞活力正常。

1.4 吉非替尼對(duì)細(xì)胞抑制率的測(cè)定

消化離心正常生長(zhǎng)的耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株，并調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/mL，在96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）平均分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，均加入用稀鹽酸溶解過(guò)濾后濃度為10 μg/mL的吉非替尼藥物溶液，調(diào)整每孔吉非替尼濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL，并在實(shí)驗(yàn)組的小孔中加入姜黃素（Cur），并調(diào)整每孔Cur含量為60 μmol/L。設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL；置于培養(yǎng)箱4 h后吸去上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩3 min；采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tex）檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm的吸光度（OD值）。計(jì)算抑制率，公式為=（1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組）×100%。

1.5 transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力

①轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：消化離心正常生長(zhǎng)的耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，該組為對(duì)照組；向細(xì)胞懸液加入Cur，使Cur含量為60 μmol/L，細(xì)胞濃度也為5×104個(gè)/mL，該組為實(shí)驗(yàn)組；然后在每個(gè)transwell小室的上室中加入200 μL兩組細(xì)胞懸液，同時(shí)下室中加入含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基500 μL；放置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后小心吸去上下小室中的液體，并倒扣于濾紙上2 min；除去上室中未穿出的細(xì)胞；室溫固定15 min（4%多聚甲醛）；染色20 min（0.1%結(jié)晶紫染色液）；風(fēng)干后觀察、200倍鏡下拍照和計(jì)數(shù)（每個(gè)小室隨機(jī)選取5個(gè)視野）。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。②侵襲實(shí)驗(yàn)：先在每個(gè)transwell小室的上室加入事先4℃過(guò)夜解凍并用DEME培養(yǎng)基稀釋6倍的Matrigel膠60 μL。細(xì)胞懸液密度變?yōu)?×104，其余步驟同轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)

常規(guī)培養(yǎng)的PC9/ZD細(xì)胞為對(duì)照組。預(yù)用含Cur含量為60 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h的PC9/ZD細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。采用裂解液（PMSF∶RIPA=1∶100）提取細(xì)胞總蛋白。蛋白濃度是由RIPA裂解液調(diào)整為5 μg/μL，然后使蛋白高溫下變性。配制分離和濃縮膠濃度為5%和10%，然后用恒壓100 V進(jìn)行電泳1 h，待電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為冰浴、恒流2 h。封閉將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜在4℃過(guò)夜條件下進(jìn)行一抗處理。次日洗膜3次，進(jìn)行二抗處理，37℃、1 h。再次洗膜3次用ECL顯色后采用Quantity One軟件（Bio-Rad）進(jìn)行半定量比較分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并進(jìn)行兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞株形態(tài)

倒置相差顯微鏡（OLYMPUS 200×）直接觀察人肺腺癌PC9細(xì)胞株和人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株。在200倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，PC9細(xì)胞表現(xiàn)為上皮樣形態(tài)，細(xì)胞大小均勻，為立方形或圓形；而PC9/ZD細(xì)胞株表現(xiàn)為間質(zhì)樣形態(tài)，細(xì)胞大小不一，甚至為多邊形，細(xì)胞間距增大，并且有明顯的偽足（封三圖1）。

2.2 吉非替尼對(duì)兩組細(xì)胞的抑制率比較

吉非替尼對(duì)兩組細(xì)胞抑制效果見(jiàn)表1，并以吉非替尼濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，繪制圖表（封三圖2）。結(jié)果顯示隨著吉非替尼濃度增加，吉非替尼對(duì)兩組細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)；并且在同樣藥物濃度作用下，實(shí)驗(yàn)組抑制率明顯高于對(duì)照組（除1.0 μg/mL）（P<0.05）。

2.3 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力比較

轉(zhuǎn)移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)分別為（103.67±13.67）和（59.89±8.19）。實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)分別為（75.67±8.82）和（17.22±3.63），表明姜黃素可以明顯干擾人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD細(xì)胞株轉(zhuǎn)移（t=2.77，P=0.011）和侵襲能力（t=2.41，P=0.016），見(jiàn)封三圖3。

2.4 兩組EMT相關(guān)蛋白表達(dá)及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路p-AKT、p-mTOR比較

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較[蛋白相對(duì)含量E-cadherin和Vimentin分別為（0.29±0.11）和（1.28±0.28）]，實(shí)驗(yàn)組的E-cadherin表達(dá)上調(diào)[蛋白相對(duì)含量為（0.82±0.27）]，Vimentin表達(dá)下調(diào)[蛋白相對(duì)含量為（1.07±0.23）]（圖1），表明姜黃素干預(yù)上皮間質(zhì)化的過(guò)程，使得上皮標(biāo)志蛋白表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志蛋白表達(dá)下調(diào)。另一方面，相比于對(duì)照組[蛋白相對(duì)含量p-AKT和p-mTOR分別為（0.63±0.17）和（1.10±0.19）]，實(shí)驗(yàn)組的p-AKT[蛋白相對(duì)含量為（0.20±0.05）]、p-mTOR[蛋白相對(duì)含量為（0.72±0.25）]也呈現(xiàn)低表達(dá)的狀態(tài)（圖2），說(shuō)明姜黃素阻斷PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路，進(jìn)而改變上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程。

3討論

肺腺癌的治療是一個(gè)多學(xué)科綜合治療的過(guò)程，包括手術(shù)、化療和靶向治療等。吉非替尼作為治療肺腺癌的臨床一線化療藥物應(yīng)用十分廣泛，主要從三個(gè)方面發(fā)揮藥理作用：①競(jìng)爭(zhēng)EGFR-TK催化區(qū)域上Mg-ATP結(jié)合位點(diǎn)，阻斷其信號(hào)傳遞；②抑制有絲分裂原活化蛋白激酶的活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；③抑制腫瘤血管[5]。但臨床上常發(fā)生腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象從而導(dǎo)致化療失敗和預(yù)后不良[6]。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥（MDR）可分為原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥兩種類(lèi)型[7]。

目前，普遍認(rèn)為肺腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程以及獲得耐藥能力的過(guò)程中均可能與EMT有關(guān)。李優(yōu)等[8]研究表明，通過(guò)干預(yù)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可以使EMT相關(guān)的E-鈣粘蛋白、波形蛋白表達(dá)發(fā)生改變，從而減弱經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)，一些經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)通路已經(jīng)被證實(shí)，如HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、轉(zhuǎn)錄因子Snail家族、β-連環(huán)蛋白通路、β-連環(huán)蛋白與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B途徑等[9-11]。此外還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移侵襲與其發(fā)生EMT時(shí)腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)上調(diào)、改變細(xì)胞微環(huán)境有關(guān)[12]。由此可見(jiàn)，通過(guò)干預(yù)腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生能夠成為治療癌癥的新方向。

姜黃素可以通過(guò)多種途徑干預(yù)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，如 Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)通路、PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路、細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB） 和STAT-3 信號(hào)通路等[8，13，14]。龐慧芳等[15]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的胰腺癌 PANC-1 細(xì)胞的EMT過(guò)程，降低胰腺癌的惡性程度從而達(dá)到治療的目的。姜黃素的抗腫瘤作用越來(lái)越被重視。美國(guó)國(guó)立癌癥研究所已經(jīng)將其列為第三代抗癌預(yù)防藥，因?yàn)槠渲委熜Ч@著、不良反應(yīng)少、安全性高等特點(diǎn)，在日本廣泛應(yīng)用[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于親代耐藥細(xì)胞，經(jīng)姜黃素處理的耐吉非替尼肺腺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性明顯改善；轉(zhuǎn)移和侵襲能力也相應(yīng)地減弱；上皮間質(zhì)化標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)下調(diào)，E-cadherin表達(dá)上調(diào)。上述結(jié)果均說(shuō)明姜黃素對(duì)耐吉非替尼肺腺癌生物學(xué)行為的改變甚至逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)化的過(guò)程。

在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路扮演著重要角色[17]。在多種惡性腫瘤細(xì)胞中均能發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路處于異常激活狀態(tài)，與惡性腫瘤的各種生物學(xué)行為密切相關(guān)[18]。因此，針對(duì)該信號(hào)通路的研究和靶向藥物的應(yīng)用成為熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)使PI3K/AKT/ARK5信號(hào)通路處于活化狀態(tài)促進(jìn)Snail蛋白進(jìn)細(xì)胞核從而使細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化[19，20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于親代耐藥細(xì)胞，姜黃素改變耐吉非替尼肺腺癌細(xì)胞的AKT、mTOR蛋白磷酸化。上述結(jié)果同時(shí)與Vimentin表達(dá)下調(diào)、E-cadherin表達(dá)上調(diào)相吻合，共同說(shuō)明經(jīng)姜黃素處理后，耐吉非替尼肺腺癌上皮間質(zhì)化的過(guò)程被阻斷甚至逆轉(zhuǎn)。

結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示姜黃素對(duì)耐吉非替尼肺腺癌上皮間質(zhì)化有明顯作用，為下一步實(shí)驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步研究分子機(jī)制，通過(guò)基因檢測(cè)等其他手段明確姜黃素藥理作用與EMT的內(nèi)在聯(lián)系，為逆轉(zhuǎn)EMT以及抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展提供新的證據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Goel A，Kunnumakkara AB，Aggarwal BB. Curcumin as "Curecumin"：From kitchen to clinic[J]. Biochemical Pharmacology，2008，75（4）：787-809.

[2] Ha GH，Park JS，Breuer EK. TACC3 promotes epithelial-mesenchymal transition（EMT） through the activation of PI3K/Akt and ERK signaling pathways[J]. Cancer Letters，2013，332（1）：63-73.

[3] Wungki Park，ARM Ruhul Amin，Zhuo Georgia Chen，et al.New perspectives of curcumin in cancer prevention[J]. Cancer Prevention Research，2013，6（5）：387-400.

[4] 高艷，崔廣智，李慧穎，等. 姜黃素、小檗堿及其配伍對(duì)db/db小鼠糖脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響[J]. 天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（1）：33-35.

[5] 劉園園，張學(xué)飛，馮剛玲，等. 吉非替尼聯(lián)合放療治療非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移臨床療效Meta分析[J]. 中華腫瘤防治雜志，2016，23（2）：121-127.

[6] 李海英，王慶苓，包海軍，等. TRIM24介導(dǎo)肺癌細(xì)胞吉非替尼耐藥機(jī)制探討[J]. 中國(guó)肺癌雜志，2016，19（1）：24-29.

[7] Batista TP，Santos CA，Almeida GF. Perioperative chemo-therapy in locally advanced gastric cancer[J]. Arquivos De Gastroenterologia，2013，50（3）：236-242.

[8] 李優(yōu)，王劍，牟好，等. 姜黃素通過(guò)PI3K/AKT/mTOR通路抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[J]. 腫瘤學(xué)雜志，2016，22（8）：607-614.

[9] Zha L，Zhang J，Tang W，et al. HMGA2 elicits EMT by activating the Wnt/β-catenin pathway in gastric cancer[J].Dig Dis Sci，2013，58（3）：724-733.

[10] Cong N，Du P，Zhang A，et al. Downregulated microRNA-200a promotes EMT and tumor growth through the wnt/β-catenin pathway by targeting the E-cadherin repressors ZEB1/ZEB2 in gastric adenocarcinoma[J]. Oncol Rep，2013，29（4）：1579-1587.

[11] Vivanco I，Sawyers CL.The phosphatidylinositol 3-Kinase[ndash]AKT pathway in human cancer[J]. Nature Reviews Cancer，2002，2（7）：489-501.

[12] Yoo YA，Kang MH，Lee HJ，et al. Sonic hedgehog pathway promotes metastasis and lymphangiogenesis via activation of Akt，EMT，and MMP-9 pathway in gastric cancer[J]. Cancer Research，2011，71（22）：7061-7070.

[13] 楊正生，李力，王亞斐. 姜黃素對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥物與臨床， 2013，13（3）：341-343.

[14] 趙軼峰，魏玉磊，王萍，等. 姜黃素抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，25（29）：3202-3204.

[15] 龐慧芳，覃華，趙秋，等. 姜黃素對(duì)胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響[J]. 世界華人消化雜志，2014，18（1）：2565-2571.

[16] 楊春梅，張林西. 姜黃素逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2011，17（5）：704-706.

[17] Lim M，Chuong CM，Roy-Burman P. PI3K，erk signaling in BMP7-induced epithelial-mesenchymal transition （EMT） of PC-3 prostate cancer cells in 2-and 3-Dimensional cultures[J]. Hormones and Cancer，2011，2（5）：298-309.

[18] Bitting RL，Armstrong AJ. Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway in castration-resistant prostate cancer[J]. Endocrine Related Cancer，2013，20（3）：83-99.

[19] 楊海平. TGF-β經(jīng)典信號(hào)通路及相關(guān)基因調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制研究[D].蘇州大學(xué)，2015.

[20] 任志濤. 小檗堿對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和MRC-5細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響[D]. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)部，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2015.

（收稿日期：2016-07-09）