G—RH2誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

張悅萌　張大力　安昌善

【摘要】 目的 探討人參皂甙RH2（G-RH2）對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的影響。方法 分析G-RH2對(duì)A549細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響， 并檢測(cè)G-RH2對(duì)A549細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果 0～60 μmol的G-RH2作用A549細(xì)胞72 h后， 實(shí)驗(yàn)組G1期細(xì)胞比率隨藥物濃度的增加而增加， S期細(xì)胞比率隨藥物濃度的增加而遞減， G2期細(xì)胞無明顯變化。Bax、Bid及Cyto-C表達(dá)量隨藥物濃度增加而增加， Bcl-2、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）及P-ERK表達(dá)量隨藥物濃度的增加而降低。結(jié)論 G-RH2可以誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡， G-RH2抗腫瘤藥物值得臨床開發(fā)和應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 人參皂甙RH2；肺腺癌；A549細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.11.215

G-RH2， 即四環(huán)三萜類寡低糖鏈人參二醇型皂甙單體， G-RH2可以通過誘導(dǎo)分化或者誘導(dǎo)調(diào)亡， 抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長、增殖， 而且其具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性[1]， 本實(shí)驗(yàn)以人源肺腺癌細(xì)胞A549為研究對(duì)象， 主要運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)G-RH2處理的A549細(xì)胞周期改變情況， 最后從蛋白水平用Westen blotting方法驗(yàn)證特定蛋白表達(dá)水平的變化， 探討其發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵蛋白及分子信號(hào)傳導(dǎo)通路， 希望通過研究能促進(jìn)G-RH2抗腫瘤藥物的進(jìn)一步開發(fā)和更廣泛的臨床應(yīng)用?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 延邊大學(xué)藥學(xué)院藥物分析實(shí)驗(yàn)室提供的人肺腺癌A549細(xì)胞系。

1. 2 方法 從-80℃冰箱中取出A549細(xì)胞凍存管先進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞傳代， 用G-RH2處理A549細(xì)胞， 采用流式細(xì)胞技術(shù)分析G-RH2對(duì)A549細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響；對(duì)G-RH2處理A549細(xì)胞提取蛋白質(zhì)并測(cè)定蛋白質(zhì)濃度， 電泳， 并用Westren blotting化學(xué)發(fā)光顯影定影檢測(cè)G-RH2對(duì)A549細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響。

2 結(jié)果

2. 1 G-RH2對(duì)A549細(xì)胞周期及凋亡的影響 分別以 0、10、20、40、60 μmol的G-RH2作用A549細(xì)胞72 h后， G1期細(xì)胞比率分別為（61.3±2.1）%、（65.4±1.8）%、（68.9±2.4）%、（78.8±1.7）%、（85.3±1.5）%； S期細(xì)胞比率分別為（26.3±2.1）%、（22.3±2.4）%、（16.3±1.5）%、（11.3±1.5）%、（9.3±2.3）%；G2期細(xì)胞比率分別為（12.4±1.3）%、（12.3±1.4）%、（14.8±2.0）%、（9.1±1.7）%、（6.4±1.3）%， 經(jīng)比較可見G-RH2作用于A549細(xì)胞后， A549細(xì)胞的凋亡比率呈濃度依賴性遞增， G1期細(xì)胞比率隨藥物濃度的增加而增加， S期細(xì)胞比率隨藥物濃度的增加而遞減， 波峰前移， G2期細(xì)胞無明顯變化。

2. 2 G-RH2對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 分別以0、10、20、40、60 μmol的G-RH2作用A549細(xì)胞72 h后， Western bolt法檢測(cè)Bcl-2家族系列蛋白的表達(dá)變化， 以β-actin為內(nèi)參對(duì)照。Bax的表達(dá)量分別為（112.56±0.65）%、（123.77±2.17）%、（136.74±1.17）%、（147.61±0.77）%、（159.38±0.53）%；Bcl-2的表達(dá)量分別為（183.28±0.79）%、（178.31±1.35）%、（177.90±1.24）%、（166.96±0.47）%、（147.15±1.41）%；Bid的表達(dá)量分別為（97.18±0.60）%、（99.94±0.06）%、（105.02±0.99）%、（104.95±0.53）%、（126.98±0.43）%；Cyto-C的表達(dá)量分別為（108.38±0.51）%、（114.44±0.30）%、（122.68±0.46）%、（126.26±0.59）%、（133.04±0.44）%；EPK的表達(dá)量分別為（46.28±0.10）%、（58.74±0.53）%、（89.31±0.69）%、（49.53±0.50）%、（38.90±2.11）%；P-ERK的表達(dá)量分別為（160.26±0.59）%、（169.32±0.37）%、（173.62±0.44）%、（174.03±0.64）%、（181.71±0.51）%；經(jīng)比較可見G-RH2作用A549細(xì)胞后， Bax、Bid及Cyto-C表達(dá)量隨藥物濃度增加而增加， Bcl-2、ERK及P-ERK表達(dá)量隨藥物濃度的增加而降低。

3 討論

流式細(xì)胞儀檢測(cè)肯定了G-RH2誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用。阻滯細(xì)胞周期是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式之一， 其中最易受到影響的是分子變化最為活躍的G1-S期以及G2-M期， 藥物作用于這兩個(gè)時(shí)期就可以干擾細(xì)胞周期的運(yùn)行， DNA合成受阻， 從而抑制細(xì)胞的增殖和生長[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：G-RH2作用于A549細(xì)胞后， A549細(xì)胞G1期細(xì)胞依次增高， S期細(xì)胞則依次減少， G2期細(xì)胞無明顯變化， 提示G-RH2對(duì)于A549的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)作用， 主要發(fā)生在G1期， 可將細(xì)胞周期阻滯在G1期， 阻止其向S期的發(fā)展。

在細(xì)胞凋亡過程中， Bcl-2家族起著非常重要的作用， 其誘導(dǎo)細(xì)胞的線粒體凋亡途徑。本研究中對(duì)Bcl-2家族主要研究Bax、Bcl-2、Bid的影響。Bcl-2是細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控因子， Bax起著促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用， Bid可以接受細(xì)胞內(nèi)的死亡信號(hào)[3]。Cyto-C是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白， 可反映Bcl-2家族蛋白對(duì)線粒體的調(diào)控作用[4]。本實(shí)驗(yàn)分別以0～60 μmol的G-RH2作用A549細(xì)胞72 h后， 發(fā)現(xiàn)Bax、Bid及Cyto-C表達(dá)量隨藥物濃度增加而增加， Bcl-2表達(dá)量隨藥物濃度的增加而降低。

ERK是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的一員， 參與細(xì)胞生長、繁殖、分裂、分化等各個(gè)方面， P-ERK即磷酸化的ERK可影響細(xì)胞增殖和調(diào)控[5]。本實(shí)驗(yàn)中分別用0～60 μmol的G-RH2作用A549細(xì)胞72 h后， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERK及P-ERK表達(dá)量隨藥物濃度的增加而降低。

綜上所述， G-RH2通過引發(fā)A549細(xì)胞G1期細(xì)胞周期阻滯， 抑制細(xì)胞增殖， 并通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)， 上調(diào)Bax及Bid的表達(dá)， 增加Cyto-C的釋放， 誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡；也可能是通過下調(diào)P-ERK及ERK的表達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖。

參考文獻(xiàn)

[1] 樸麗花， 金政， 蔡英蘭， 等.人參皂甙Rh2抗乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.中國臨床藥理學(xué)雜志， 2011， 27（11）： 867-870.

[2] Yi PF， Bi WY， Shen HQ， et al. Inhibitory effects of sulfated 20（S）-ginsenoside Rh2 on the release of pro-inflammatory mediators in LPS-induced RAW 264.7 cells. European Journal of Pharmacology， 2013， 712（1-3）：60-66.

[3] 史婷婷， 白建平， 梁月琴， 等.芹菜素對(duì)大鼠缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響.中國藥理學(xué)通報(bào)， 2011， 27（5）：666-670.

[4] Chang Z， Xing J， Yu X， et al. Curcumin induces osteosarcoma MG63 cells apoptosis via ROS/Cyto-C/Caspase-3 pathway. Tumour biology， 2014， 35（1）：753-758.

[5] 趙明哲， 劉靖華， 李玉花， 等.ERK信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制.國際病理科學(xué)與臨床雜志， 2009， 29（1）：15-19.

[收稿日期：2015-12-04]