• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    三氧化二砷對人大細胞肺癌NCI—H460細胞凋亡影響的研究

    2017-02-23 14:00王崇張程張湘燕姚紅方張小潤
    醫(yī)學(xué)信息 2016年36期
    關(guān)鍵詞:三氧化二砷細胞增殖細胞凋亡

    王崇 張程 張湘燕 姚紅方 張小潤

    摘要:目的 研究在臨床上,三氧化二砷(As2O3)對人大細胞肺癌(NCI-H460細胞)細胞增殖、凋亡的影響,以探討新的肺癌治療方法。方法 配制NCI-H460細胞的細胞懸液(濃度為5×104個/mL),給予不同濃度的As2O3干預(yù),并將其分為4組濃度分別為:10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L ,各組干預(yù)時間分別為24、48、72 h。細胞增殖抑制率通過MTT法檢測,各組細胞形態(tài)學(xué)的改變通過鏡下觀察;細胞凋亡的形態(tài)學(xué)的變化通過原位末端標記法(TUNEL)檢測,并與陰性對照組進行比較;按上述干預(yù)濃度及干預(yù)時間,使用流式細胞儀檢測細胞凋亡指數(shù)。結(jié)果 As2O3對NCI-H460細胞增殖的抑制率隨時間延長和濃度增加而增加(P<0.05), 凋亡指數(shù)隨時間延長和濃度增加而增加 (P<0.05)。結(jié)論 As2O3可抑制NCI-H460細胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡,且呈時間、劑量依賴性。

    關(guān)鍵詞:三氧化二砷;大細胞肺癌;NCI-H460細胞;細胞增殖;細胞凋亡

    三氧化二砷,分子式為As2O3,別名:砒霜,是具有代表性的砷化合物,主要用于治療胃癌,胰腺癌、梅毒、結(jié)核等[1],并在治療急性早幼粒細胞白血?。ˋPL)過程中有著顯著的療效[2]。因其緩解率高, 和其他抗癌藥物無交叉反應(yīng)性,無骨髓抑制和嚴重毒副作用而獲得了廣泛重視,并被美國FDA批準用于APL的治療。臨床研究表明,As2O3對實體腫瘤如肺癌(A549細胞)、胰腺癌、胃癌等具有良好的抗癌作用。國內(nèi)外報道多見應(yīng)用As2O3作用于多種肺癌細胞方面,如Anip973細胞、NCI-H69細胞、A549細胞的凋亡,但是很少見到有關(guān)As2O3誘導(dǎo)NCI-H460細胞凋亡的報道,繼而本實驗選擇NCI-H460細胞,觀察As2O3對該細胞增殖及凋亡方面的影響,為臨床上尋找對該類腫瘤新的治療方法,提供理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 細胞 NCI-H460細胞 (由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室提供)。

    1.2試劑 As2O3(哈爾濱伊都藥業(yè))細胞凋亡檢測試劑盒(瑞士Roche 公司);RPMI-1640培養(yǎng)液、 胎牛血清(美國HyClone公司)。

    1.3儀器 Bio-Rad 550 酶標儀(美國 Bio-Rad公司);TS100倒置微鏡 (日本Nikon公司); JNOECXS-212-202生物顯微鏡 (南京江南光電集團股份有限公司);流式細胞儀(BDFACSAria)。

    1.2方法

    1.2.1細胞培養(yǎng) 參見張小潤、王曉宇等研究類似[3]。

    1.2.2 MTT法測定As2O3對NCI-H460細胞的生長抑制率 顯微鏡下觀察細胞,呈現(xiàn)對數(shù)生長期,0.25%胰酶消化成細胞懸液,離心1000 rpm/min、10 min,用含10%胎牛血清及青鏈霉素混合液的RPMI-1640全培養(yǎng)液稀釋細胞濃度約5×104個/ml。將100 μl/孔的細胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中,共設(shè)4個平行組,每組設(shè)3個復(fù)孔,同時設(shè)1組陰性對照組(100 μl無藥物干預(yù)的上述細胞懸液),5%CO2,37℃條件下培養(yǎng)24 h使細胞貼壁,然后每孔加入以生理鹽水溶解的不同濃度的As2O3(10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L)50 μl,并向?qū)φ战M加入細胞培養(yǎng)液50μl,設(shè)定24 h、48 h、72 h為上述5組的反應(yīng)時間,帶反應(yīng)時間到達后,吸去原培養(yǎng)液并用生理鹽水沖洗各孔,然后向各孔加入20 μl MTT,并于4 h后加二甲亞砜(DMSO)200 ul于每孔中,使用酶標儀測量吸光度OD(490 nm波長),對應(yīng)3個復(fù)孔,反復(fù)3次實驗每組濃度。細胞抑制率%=(1-給藥組OD值/對照組OD值)×100%。

    1.2.3細胞凋亡的形態(tài)通過原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法(TUNEL)法檢測 同2.2操作得到細胞懸浮液5×104個/ml,將細胞懸液轉(zhuǎn)到24孔板中培養(yǎng),400 μl/孔,共設(shè)4個平行組,每組設(shè)3個復(fù)孔,同時設(shè)置1正常對照組孔(不加藥),37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)24 h使之貼壁,然后加入200 μl不同濃度的As2O3(生理鹽水溶解),藥物終濃度分別為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L,分別作用24 h、48 h、72 h,到實驗時間后,進行凋亡檢測,具體步驟參見張小潤、王曉宇等研究[3]。

    1.2.4流式細胞儀檢測細胞的凋亡指數(shù) 使用上述同樣的方法將細胞濃度稀釋至5×105/ml,將細胞懸液轉(zhuǎn)到6孔板中培養(yǎng),2 ml/孔,共設(shè)4個平行組,每組設(shè)3個復(fù)孔,同時設(shè)置1正常對照組孔(不加藥),37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)24 h使之貼壁,然后加入1000 μl不同濃度的As2O3(生理鹽水溶解),藥物終濃度分別為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L,分別作用24 h、48 h、72 h,到實驗時間后,進行凋亡檢測,具體步驟見試劑說明書,凋亡指數(shù)=(Q1+Q2)×100%。

    1.3統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析、處理,數(shù)據(jù)以(x±s)差表示,組間多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,檢驗水準為α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 NCI-H460細胞形態(tài)變化 在不同濃度As2O3作用后,NCI-H460細胞隨著藥物濃度的增加、干預(yù)時間延長, 部分NCI-H460細胞胞漿內(nèi)開始有空泡形成,細胞輪廓明顯,少部分細胞脫落,漂浮于培養(yǎng)液中;亦有少數(shù)細胞體積增大,胞體腫脹、破裂,呈壞死狀。

    2.2 As2O3對NCI-H460細胞增殖抑制率的影響As2O3能抑制NCI-H460細胞增殖,并呈時間、劑量依賴性。不同濃度As2O3作用不同時間后NCI-H460細胞增殖的抑制率比較,濃度10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L作用24 h后NCI-H460細胞形態(tài),見圖1,表1。

    圖1 濃度10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L As2O3

    作用24 h后NCI-H460細胞形態(tài)(×200)

    2.3 As2O3對NCI-H460細胞凋亡的形態(tài)學(xué)的影響 TUNEL染色,陰性組見藍色的凋亡陰性染色;陽性組凋亡細胞核呈棕黃色,細胞呈小片或散在分布,細胞核碎裂、溶解,形狀不一,易于觀察,伴隨不斷增大的藥物濃度,可見棕黃色的凋亡細胞的分布不斷擴大,見圖2。

    圖2 TUNEL法檢測不同濃度As2O3作用于

    NCI-H460細胞24 h后的凋亡圖形

    注:A:0 μmol/L;B:10 μmol/L;C:80 μmol/L。

    2.4 NCI-H460細胞的凋亡指數(shù)通過流式細胞儀檢測 在不同時間、不同濃度下As2O3對NCI-H460細胞凋亡作用的影響可通過流式細胞儀觀察;隨著劑量的增加,時間的延長,細胞的的凋亡指數(shù)在不同時間下呈進行性升高。數(shù)據(jù)表明,NCI-H460細胞的凋亡與As2O3的誘導(dǎo)有明顯關(guān)系,并與劑量和時間呈現(xiàn)依賴相關(guān)性。(通過圖3能夠發(fā)現(xiàn),隨著藥物濃度的增加,Q1+Q2的比例不斷擴大),見表2,圖3。

    圖3 流式細胞儀檢測10 μmol/L As2O3作用于

    NCI-H460細胞不同時間的凋亡指數(shù)的比較

    注:A:24 h,B:48 h,C:72 h。

    3 討論

    肺癌,為最常見的肺部惡性腫瘤,分為小細胞肺癌及非小細胞肺癌,后者中又以大細胞肺癌惡性程度最高,雖傳統(tǒng)治療以手術(shù)為主,但是因其轉(zhuǎn)移快,手術(shù)后預(yù)后亦欠佳,故化療在其治療過程中起著極其重要的的作用。目前,很多研究顯示,絕大多數(shù)藥物是通過抑制細胞的生長、增殖,誘導(dǎo)細胞凋亡而發(fā)揮其抗腫瘤作用的。

    三氧化二砷,俗稱砒霜,近年來許多報道發(fā)現(xiàn),As2O3在血液系統(tǒng)腫瘤的治療中發(fā)揮著明顯的抗癌作用,受到全世界的矚目如急性早幼粒細胞白血病[4]。大量實驗證實,As2O3可以抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡,且As2O3在抑制腫瘤細胞增殖方面與其他藥物相比具有多途徑的優(yōu)勢;其次,As2O3在毒副作用和抗癌廣譜性方面與其他抗癌藥物相比也具有明顯的優(yōu)勢[5-8]。研究發(fā)現(xiàn),As2O3治療各種實體瘤如胃癌、胰腺癌和肺癌的主要機制是通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而實現(xiàn)的。

    劉琳[9]等國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)對于人的大腸癌細胞,給予As2O3 3 d的劑量,并作用24 h、48 h、72 h,能誘導(dǎo)癌細胞凋亡,并可見凋亡形態(tài)學(xué)變化。借鑒該項研究經(jīng)驗,制定本次試驗的藥物As2O3濃度分別10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L,干預(yù)時間為24 h、48 h、72 h?,F(xiàn)代的檢測凋亡的方法有流式細胞儀檢測法、MTT法、TUNEL法,其中流式細胞儀檢測法具有準確性好、精度高、速度快等優(yōu)點。在本次試驗中,分別使用這三種檢測方法以探討As2O3對NCI-H460細胞凋亡及細胞增殖指數(shù)的影響。其中MTT法,采用不同時間及濃度的As2O3作用于NCI-H460細胞,并通過顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示,陰性對照組細胞折光性好,貼壁良好,無脫落,呈梭行或者不規(guī)則形。對于藥物干預(yù)組,細胞逐漸變圓,細胞輪廓更加明顯,部分NCI-H460細胞胞漿內(nèi)有空泡形成,且折光性差,甚至在細胞培養(yǎng)液中出現(xiàn)脫落漂浮現(xiàn)象,隨著藥物濃度和作用時間的的增加,細胞的具有更明顯的形態(tài)變化。

    本次實驗中,在不同時間及不同濃度下,As2O3作用于NCI-H460細胞,排除部分因檢測誤差和標本例數(shù)少等原因造成濃度抑制率、作用時間和凋亡指數(shù)無明顯差異性變化。從總趨勢上來說,As2O3不同時間及不同濃度下對NCI-H460細胞的增殖具有抑制作用,并且和時間以及劑量呈現(xiàn)相關(guān)依賴關(guān)系,這與韋國楨,曹琦[10]和Chow等[11]的研究結(jié)果類似,從而可作出推斷,As2O3可抑制NCI-H460的增殖,并與時間和劑量呈現(xiàn)可能的相關(guān)依賴關(guān)系;另外,姚和瑞[12]等的研究表明,As2O3可以誘導(dǎo)肺癌細胞(NCI-H69)凋亡,并且凋亡指數(shù)與濃度的增大呈進行性上升關(guān)系,同樣揭示了As2O3能夠誘導(dǎo)NCI-H460細胞凋亡,并具有與時間及劑量的相關(guān)依賴性。本次研究中檢測NCI-H460細胞的凋亡指數(shù)采用的是流式細胞儀,也發(fā)現(xiàn)As2O3能誘導(dǎo)NCI-H460細胞凋亡,并且凋亡指數(shù)與劑量及時間相關(guān)依賴關(guān)系,同樣可推斷出,As2O3能夠誘導(dǎo)NCI-H460細胞凋亡,并具有與時間及劑量的相關(guān)依賴性。與其他相關(guān)報道結(jié)合,可以看出化療抗腫瘤的機制可能與多種化療藥物干涉多種癌基因的表達有關(guān),如基因bcl-2,P53等,還有報道更詳細的指出,三氧化二砷可以通過下調(diào)表達bcl-2基因與上調(diào)表達P53基因有關(guān)[13],更進一步明確三氧化二砷抗腫瘤的機制,有待于更深層次的完善相關(guān)實驗。

    參考文獻:

    [1]Zhu J,Che Z,Lallemand-Breitenbach V,er al.How acute promyelovytic leukemia revived srsenic[J].Nat Rev Cancer,2002,2(9):705-713.

    [2]Lengfelder E,Schultheis B,Buchner T,et al.Arsenic trioxide:"a successful poison"in patients with acute promyelocytic leukemia[J]. Dtsch Med Wachenschr,2007,132(7):330-336.

    [3]張小潤,張程,王曉宇,等.L氨基酸氧化酶對人肺腺癌A549細胞增殖、凋亡的影響研究[J].中國藥房,2011,25(2):2325-2327.

    [4]張鵬,王樹葉,胡龍虎,等.三氧化二砷注射液治療72例急性早幼粒細胞白血病[J].中華血液學(xué)雜志,1997,17(2):58-60.

    [5]Antm an KH. In troduction : the history of arsenic trioxide in cancer therapy [J].On cologist , 2001, 6 (l2):1-2.

    [6]Bornstein J,SagiS, Haj A,etal . A rsenic Trioxide inhibits the growth of human ovari an carcinoma cell line[J]. Gynecologic Oncology, 2005 ,99(3):726-729 .

    [7]Cheng B,Yang X, Han Z,etal .A rsenic trioxide induced the apoptosis of laryngeal can cer via down -regulation of survivin mRNA [J] . Auris Nas us Larynx , 2008 , 35(1):95-101.

    [8]Dilda PJ,Hogg PJ.Arsenical based cancer drugs[J].Cancer TreatRev,2007,33(6):542-564.

    [9]劉琳,邱少敏,趙偉,等.三氧化二砷誘導(dǎo)人類大腸癌細胞凋亡的分子機制[J].世界華人消化雜志,2004,12(7):1548-1554.

    [10]魏繼福,楊偉海,喬麗雅,等.金環(huán)蛇L-氨基酸氧化酶誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的研究[J].中國病理生理學(xué)雜志,2006,22(2):251-256.

    [11]Chow SK, Chan JY, Fun g KP . Inhibit ion of cell prolif erati on and the act ion mechanisms of arsen ic t rioxide ( As2O3) on human breast cancer cells [J].Journal of Cellular Bioch emistry, 2004, 93(1):173-187.

    [12]姚和瑞,向燕群,謝德榮,等.三氧化二砷對NCI- H69肺癌細胞增殖和凋亡的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2000,10(6):3-6.

    [13]石玉枝,柳蘭英,霍建民,等.三氧化二砷誘導(dǎo)小細胞肺癌細胞凋亡及p53、bcl-2基因表達的研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2002,25(11):665-667.

    編輯/翟辰萬

    猜你喜歡
    三氧化二砷細胞增殖細胞凋亡
    miRAN—9對腫瘤調(diào)控機制的研究進展
    ERK通路參與的未分化甲狀腺癌FRO細胞凋亡過程及三氧化二砷的調(diào)控作用研究
    G—RH2誘導(dǎo)人肺腺癌A549細胞凋亡的實驗研究
    RNA干擾HDACl對人乳腺癌MCF—7細胞生物活性的影響
    山東體育學(xué)院學(xué)報(2015年3期)2015-08-14
    三氧化二砷聯(lián)合中藥治療晚期炎性乳腺癌1例
    三氧化二砷治療急性早幼粒細胞白血病的療效觀察
    三氧化二砷對淋巴瘤Raji細胞的抑制效應(yīng)研究
    精品免费久久久久久久清纯 | 99国产精品免费福利视频| www日本在线高清视频| 真人做人爱边吃奶动态| 老司机福利观看| 首页视频小说图片口味搜索| 久久久久国产一级毛片高清牌| 青草久久国产| 超色免费av| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久久久国内视频| 老鸭窝网址在线观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 99久久99久久久精品蜜桃| 两个人看的免费小视频| 搡老乐熟女国产| 一级毛片电影观看| 国产精品免费大片| 欧美另类亚洲清纯唯美| av片东京热男人的天堂| 国产一区二区在线观看av| 一区在线观看完整版| 国产欧美日韩一区二区精品| 在线观看免费日韩欧美大片| 99国产精品一区二区蜜桃av | 丝袜脚勾引网站| 手机成人av网站| 黄色视频在线播放观看不卡| av不卡在线播放| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲精品国产av成人精品| 老司机亚洲免费影院| www日本在线高清视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产视频一区二区在线看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 超碰97精品在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲中文字幕日韩| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 午夜视频精品福利| 午夜视频精品福利| 日本五十路高清| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 天天影视国产精品| 天天影视国产精品| 久久天堂一区二区三区四区| 久久av网站| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲久久久国产精品| 黄色视频不卡| 性高湖久久久久久久久免费观看| 女性生殖器流出的白浆| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产亚洲精品久久久久5区| 永久免费av网站大全| 免费人妻精品一区二区三区视频| 波多野结衣一区麻豆| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产一区二区三区av在线| 国产免费福利视频在线观看| 91精品三级在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲国产日韩一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 后天国语完整版免费观看| av片东京热男人的天堂| 人妻久久中文字幕网| 9色porny在线观看| 美女福利国产在线| 日韩免费高清中文字幕av| a 毛片基地| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 男人舔女人的私密视频| 涩涩av久久男人的天堂| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产一区二区三区综合在线观看| 大陆偷拍与自拍| 亚洲av欧美aⅴ国产| 麻豆国产av国片精品| 桃花免费在线播放| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 男女高潮啪啪啪动态图| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 岛国在线观看网站| 少妇粗大呻吟视频| 欧美在线黄色| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 中文欧美无线码| 777米奇影视久久| 久久青草综合色| av电影中文网址| 天堂俺去俺来也www色官网| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久女婷五月综合色啪小说| 两人在一起打扑克的视频| 美国免费a级毛片| 在线观看一区二区三区激情| 欧美精品一区二区免费开放| 久久 成人 亚洲| 国产精品影院久久| 麻豆av在线久日| 制服人妻中文乱码| 啦啦啦啦在线视频资源| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产免费现黄频在线看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 日韩视频在线欧美| 国产精品成人在线| 久久精品国产综合久久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 大型av网站在线播放| 精品一区在线观看国产| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 最近最新免费中文字幕在线| 男男h啪啪无遮挡| av在线app专区| 久久99一区二区三区| 男女高潮啪啪啪动态图| 韩国精品一区二区三区| 国产精品 国内视频| 久久久久久久久免费视频了| av天堂在线播放| 国产成人精品无人区| 正在播放国产对白刺激| 国产高清视频在线播放一区 | 精品福利观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲欧洲日产国产| 91字幕亚洲| 成年美女黄网站色视频大全免费| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费少妇av软件| 国产成人影院久久av| av在线播放精品| 脱女人内裤的视频| 日本91视频免费播放| 精品福利永久在线观看| 国产99久久九九免费精品| av在线app专区| 伊人亚洲综合成人网| 欧美久久黑人一区二区| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产免费视频播放在线视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久久久网色| videosex国产| 国产精品一区二区在线不卡| 国产在线一区二区三区精| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日日爽夜夜爽网站| 一个人免费看片子| 十八禁人妻一区二区| 男男h啪啪无遮挡| 精品一区二区三卡| 国产成人av教育| 丰满少妇做爰视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 一区二区av电影网| 国产精品免费视频内射| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲avbb在线观看| 黄色 视频免费看| 久久中文字幕一级| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 精品国产一区二区三区四区第35| 最黄视频免费看| 免费日韩欧美在线观看| 岛国毛片在线播放| 爱豆传媒免费全集在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲色图综合在线观看| 国产精品国产av在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 热99国产精品久久久久久7| 国产伦理片在线播放av一区| 久久久国产一区二区| 超碰97精品在线观看| 国产精品av久久久久免费| svipshipincom国产片| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产av精品麻豆| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 蜜桃在线观看..| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 窝窝影院91人妻| 啦啦啦免费观看视频1| tocl精华| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 母亲3免费完整高清在线观看| 免费在线观看日本一区| 在线观看免费视频网站a站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 欧美日韩视频精品一区| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 久久午夜综合久久蜜桃| 99国产极品粉嫩在线观看| a级毛片在线看网站| 精品国内亚洲2022精品成人 | 欧美日韩av久久| 亚洲国产日韩一区二区| 中国国产av一级| 97在线人人人人妻| 精品熟女少妇八av免费久了| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 免费观看av网站的网址| 大片免费播放器 马上看| videosex国产| 男女国产视频网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 性少妇av在线| 12—13女人毛片做爰片一| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久青草综合色| av欧美777| 99热国产这里只有精品6| 黄色视频在线播放观看不卡| 免费观看av网站的网址| 一级毛片精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久中文字幕一级| 一级毛片精品| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 飞空精品影院首页| 久久性视频一级片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 久久99热这里只频精品6学生| 精品一区二区三卡| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 天堂俺去俺来也www色官网| 黄频高清免费视频| 脱女人内裤的视频| 高清视频免费观看一区二区| 正在播放国产对白刺激| 欧美av亚洲av综合av国产av| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲成人免费电影在线观看| 美女大奶头黄色视频| 99九九在线精品视频| 在线精品无人区一区二区三| 老司机福利观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久性视频一级片| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品人妻在线不人妻| 日本vs欧美在线观看视频| 国产精品久久久久久精品古装| 啪啪无遮挡十八禁网站| 99国产精品一区二区三区| 亚洲中文av在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 他把我摸到了高潮在线观看 | 色老头精品视频在线观看| 午夜福利免费观看在线| 国产av国产精品国产| kizo精华| 一级毛片电影观看| 精品人妻在线不人妻| 首页视频小说图片口味搜索| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 丝袜人妻中文字幕| 狂野欧美激情性bbbbbb| 一级片免费观看大全| 国产亚洲精品一区二区www | 国产精品九九99| 91大片在线观看| 欧美97在线视频| e午夜精品久久久久久久| 丝袜在线中文字幕| 香蕉国产在线看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 母亲3免费完整高清在线观看| 无限看片的www在线观看| 成人免费观看视频高清| 国精品久久久久久国模美| a级片在线免费高清观看视频| 国产亚洲欧美精品永久| 午夜影院在线不卡| 老司机午夜福利在线观看视频 | 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 首页视频小说图片口味搜索| 免费黄频网站在线观看国产| 十分钟在线观看高清视频www| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 操出白浆在线播放| 欧美日韩亚洲高清精品| 久9热在线精品视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 美女大奶头黄色视频| 热99国产精品久久久久久7| 黄色视频,在线免费观看| 日日夜夜操网爽| 午夜福利,免费看| av一本久久久久| 国产淫语在线视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 制服诱惑二区| 999精品在线视频| 亚洲五月婷婷丁香| 啦啦啦啦在线视频资源| tocl精华| 亚洲国产成人一精品久久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 不卡一级毛片| 男人操女人黄网站| 悠悠久久av| 国产一区二区三区av在线| 麻豆乱淫一区二区| 超色免费av| 久热爱精品视频在线9| 欧美在线一区亚洲| 99国产精品一区二区三区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美人与性动交α欧美软件| 在线看a的网站| 不卡av一区二区三区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 91精品国产国语对白视频| 99国产精品免费福利视频| 中国国产av一级| 亚洲精品一二三| 精品一区在线观看国产| 亚洲第一青青草原| 黑人欧美特级aaaaaa片| 捣出白浆h1v1| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 青春草亚洲视频在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产精品九九99| 脱女人内裤的视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 丁香六月欧美| 久久国产精品大桥未久av| 国产成人精品久久二区二区免费| 99国产综合亚洲精品| 久久精品国产综合久久久| 老司机影院毛片| 精品高清国产在线一区| 叶爱在线成人免费视频播放| 老司机深夜福利视频在线观看 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 天堂俺去俺来也www色官网| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲欧美激情在线| 国产欧美日韩一区二区精品| 好男人电影高清在线观看| 国产成人av教育| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲av男天堂| 亚洲第一av免费看| 国产男女内射视频| 另类亚洲欧美激情| 久久热在线av| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国精品久久久久久国模美| 国产精品九九99| 99国产精品99久久久久| 久久中文字幕一级| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 男女下面插进去视频免费观看| 老司机影院成人| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 97精品久久久久久久久久精品| 又大又爽又粗| 999久久久精品免费观看国产| 成年人黄色毛片网站| 丝袜在线中文字幕| 精品久久久久久电影网| 在线观看人妻少妇| 人妻久久中文字幕网| 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品一区二区在线不卡| 国产一区二区三区综合在线观看| 午夜日韩欧美国产| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 免费高清在线观看视频在线观看| 国产成人欧美| 久久这里只有精品19| 国产在线一区二区三区精| 国产区一区二久久| av欧美777| 国产片内射在线| 国产91精品成人一区二区三区 | 亚洲国产欧美日韩在线播放| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 丁香六月天网| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲国产看品久久| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲国产日韩一区二区| 咕卡用的链子| 满18在线观看网站| 国产亚洲av高清不卡| 香蕉国产在线看| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产97色在线日韩免费| 午夜福利乱码中文字幕| 91老司机精品| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 91精品三级在线观看| 久久 成人 亚洲| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 欧美人与性动交α欧美软件| 男女边摸边吃奶| 亚洲欧美激情在线| 一进一出抽搐动态| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产精品免费大片| 在线精品无人区一区二区三| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 韩国高清视频一区二区三区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲少妇的诱惑av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 高清视频免费观看一区二区| 99久久99久久久精品蜜桃| 精品免费久久久久久久清纯 | 老司机深夜福利视频在线观看 | 久久久欧美国产精品| av天堂久久9| 日本黄色日本黄色录像| 一本综合久久免费| 一级片免费观看大全| 麻豆乱淫一区二区| 99久久国产精品久久久| 欧美97在线视频| 中文字幕最新亚洲高清| 国产在线免费精品| 热99国产精品久久久久久7| 一级,二级,三级黄色视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产极品粉嫩免费观看在线| 日本欧美视频一区| 中国国产av一级| www.av在线官网国产| 一本久久精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 免费在线观看影片大全网站| 首页视频小说图片口味搜索| 国产欧美日韩一区二区三 | kizo精华| 丝袜美足系列| 国产免费福利视频在线观看| 一区二区三区激情视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 欧美精品一区二区大全| 老司机靠b影院| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 黄色a级毛片大全视频| 成在线人永久免费视频| 午夜激情av网站| 国产av又大| 国产亚洲精品第一综合不卡| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲国产日韩一区二区| 热99国产精品久久久久久7| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 91字幕亚洲| av网站在线播放免费| 久久av网站| 99九九在线精品视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 成人av一区二区三区在线看 | 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 老司机福利观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 午夜日韩欧美国产| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 精品久久蜜臀av无| 国产又色又爽无遮挡免| 精品卡一卡二卡四卡免费| 美女大奶头黄色视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 人妻一区二区av| 久久精品国产综合久久久| 一级,二级,三级黄色视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美中文综合在线视频| 五月开心婷婷网| 曰老女人黄片| 精品国产乱码久久久久久小说| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频 | 午夜福利视频精品| av网站免费在线观看视频| 久久久久久人人人人人| 精品欧美一区二区三区在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美性长视频在线观看| 免费观看a级毛片全部| 在线观看一区二区三区激情| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产成人欧美| 高清av免费在线| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲美女黄色视频免费看| av在线老鸭窝| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产成人精品久久二区二区91| 飞空精品影院首页| 国产男女内射视频| videosex国产| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 免费不卡黄色视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美精品高潮呻吟av久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲av日韩在线播放| 国产高清视频在线播放一区 | 啦啦啦 在线观看视频| 美女国产高潮福利片在线看| 操出白浆在线播放| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久精品国产综合久久久| 超色免费av| 欧美av亚洲av综合av国产av| 精品国内亚洲2022精品成人 | 考比视频在线观看| 午夜91福利影院| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美精品高潮呻吟av久久| xxxhd国产人妻xxx| 美女大奶头黄色视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 成人影院久久| 国产亚洲精品久久久久5区| 丝袜在线中文字幕| www.精华液| 亚洲av电影在线进入| 亚洲成人免费电影在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 一本综合久久免费| 久久久国产成人免费| 精品人妻在线不人妻| 99九九在线精品视频| 中文欧美无线码| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 99国产精品99久久久久| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 少妇精品久久久久久久| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| av在线app专区| xxxhd国产人妻xxx| 久久免费观看电影| 亚洲成人免费av在线播放| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久免费观看电影| 免费黄频网站在线观看国产| 精品国内亚洲2022精品成人 | 黄片小视频在线播放| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久中文看片网| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 免费在线观看黄色视频的| kizo精华| 欧美激情久久久久久爽电影 | 午夜免费成人在线视频| 精品一区二区三区av网在线观看 | 99香蕉大伊视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美激情 高清一区二区三区| 在线 av 中文字幕| 老司机午夜十八禁免费视频| 十八禁网站免费在线| 少妇 在线观看| 精品欧美一区二区三区在线| 午夜福利免费观看在线|