RNA干擾HDACl對人乳腺癌MCF—7細胞生物活性的影響

胡武杰　劉志明　吳斯敏　全軍利　李建林

[摘要]目的：通過RNA干擾乳腺癌MCF-7細胞組蛋白去乙?；?（HDACI）基因，觀察對其細胞周期及細胞生長的影響。方法：將乳腺癌MCF-7細胞分成3個組：空白對照組（不予任何處理）、陰性對照組（予以陰性siRNA+脂質體）、siRNA組（HDACl siRNA+脂質體）。人工合成針對HDACl基因的小分子干擾RNA構建HDACI-siRNA重組質粒，通過脂質體轉入乳腺癌MCF-7細胞。用Real Time-PCR法和Western-b10t法分別檢測HDACl基因的mRNA及蛋白表達情況；MTT法檢測細胞增殖情況；流式細胞術檢測細胞周期變化。結果：轉染24h后人乳腺癌MCF-7細胞中HDAClmRNA表達量在siRNA組為（0.15±0.02）、空白對照組為（1.00±0.03）、陰性對照組（0.83±0.04）。與空白對照組和陰性對照組相比，siRNA組細胞中HDAClmRNA表達量下降明顯（P<0.05）。Western b1ot顯示HDACl蛋白表達量亦明顯顯示：siRNA組表達量比空白和陰性對照組低（P<0.05）。MTT法檢測顯示3組細胞中，siRNA組的細胞生長速度較其他兩組慢（P<0.05）。流式細胞術檢測顯示3組乳腺癌細胞細胞周期分布顯示siRNA組細胞周期s期明顯減少（P<0.05），G1期比例增加（P<0.05）。結論：通過RNA干擾能有效的抑制人乳腺癌MCF-7細胞HDAC1的表達，同時抑制細胞增殖、引起細胞周期停滯。

[關鍵詞]HDAC1；細胞增殖；細胞周期

組蛋白乙?；D移酶（HAT）和組蛋白去乙?；福℉DAC），是一對功能相互拮抗的蛋白酶，共同負責調控組蛋白的乙?；c去乙?；?。正常細胞體一旦出現(xiàn)核內組蛋白乙?；c去乙?；氖Ш猓磿е抡５募毎芷谂c細胞代謝行為的改變而誘發(fā)腫瘤。已有研究表明，由于這對拮抗酶活性的改變，導致組蛋白在轉錄水平異常修飾，導致異常表達。

在組蛋白去乙?；副姸鄟喰椭?，HDAC1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展的關系中是具有代表性的。同時發(fā)現(xiàn)HDAC1的表達水平與患者生存率，腫瘤的大小有關。因此HDAC1可以作為一個獨立的乳腺癌臨床預后指標。其機制可能因為下調HDAC1后，是HDAC1 mRNA和蛋白表達量減少。

本實驗旨在通過RNA干擾的手段，下調乳腺癌MCF-7細胞中HDAC1基因的表達，使HDAC1基因表達減少，從而抑制細胞增長、使細胞周期發(fā)生改變。

1材料與方法

1.1細胞及主要試劑

乳腺癌MCF-7細胞（上海生物工程公司）。DMDM（美國Gibco公司）；小鼠抗人HDAC1單克隆抗體及羊抗小鼠二抗購自（美國SANTA CRUZ）公司；脂質體LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；Real Time-PCR檢測試劑盒購自（上海吉馬技術制藥有限公司）公司；胎牛血清購自（維森特生物技術有限公司）公司；雙抗購自Gibco公司。

1.2主要的設備

CO₂培養(yǎng)箱（3111，美國Thermo）、超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、常溫離心機（3300，德國Eppend～f公司）、流式細胞儀（美國BD公司）、SDS-PAGE蛋白電泳儀（北京六一儀器廠）、PCR儀（美國Applied Biosystems公司）

1.3細胞培養(yǎng)

乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO₂體積分數的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 RNA干擾片段的合成

siRNA序列委托上海吉瑪公司合成，同時合成隨機性陰性對照序列。HDAC1siRNA正義鏈：5'一GCUCCUCUGACAAACGAAUTT-3'，反義鏈5'-AUUCGUUUGUCAGAGGAGCTT-3'。陰性的siRNA正義鏈5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'反義鏈-5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

RNA干擾具體轉染步驟參照上海吉瑪公司轉染操作手冊。轉染6～7h后換成無雙抗的DMEM培養(yǎng)液，之后常規(guī)培養(yǎng)，轉染24小時后做后續(xù)處理。

1.5 Real Time-PCR法檢測乳腺癌HDAC1細胞中HDACl的表達

搜集轉染后各組HDAC1細胞，采用Trizo法提取總RNA，逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，檢測HDAC1、β-actm'的表達。引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。β-actm'為內參照計算相對表達量（RQ）

1.5Western blot法測MCF-7細胞中HDAC1蛋白的表達

提取并分離各組總蛋白，將分離后的蛋白轉移至硝酸纖維膜上，封閉轉移膜，分別加入一抗（兔抗人HDAC1多克隆抗體以及β-actin單克隆抗體）反應過夜，隨后加入二抗反應2小時暗室發(fā)光顯影。以Quantity One v462圖像分析軟件對圖像進行分析，以目的條帶與β-actin灰度值的比值作為蛋白表達相對含量。

1.7細胞增殖檢測

采用MTT法進行細胞增殖檢測。取對數生長期的MCF-7細胞，接種在96孔培養(yǎng)板上，每孔細胞數1×10⁵/孔。實驗各組每組設5個平行孔。分別轉染各組。于轉染后（0h、24h、36h、48h、72h、96h）向每孔加入5mg/μlMTT溶液20μl。避光培養(yǎng)4小時，吸除上清液。每孔加入150μlDMSO，震蕩10分鐘，使形成的晶體充分溶解。測定570nm處吸光度（A）值，根據A值繪制細胞生長曲線。

1.8流式細胞術檢測細胞周期變化

收集各組轉染后的細胞，制備單細胞懸液，調整細胞密度為1×10⁶個/mL；收集各組細胞，隨后用70%冰乙醇溶液分散固定細胞；PBS洗滌后棄上清液，加入1%Triton X-100、0.01%RNase和0.005%PI的混合液，搖勻后靜置25mm，用400目絲網過濾后上機分析，檢測細胞周期。

1.9統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包完成，計算資料組間差異，采用方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用S-N-K檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 Real-Time PCR結果

HDAClsiRNA轉染乳腺癌細胞36小時后，提取三組細胞的總RNA，以Real-TimePCR檢測擴增曲線?？瞻讓φ战M、陰性對照組、siRNA轉染組的表達量分別為（1.0±0.03）、（0.83±0.01）、（0.15±0.002）。與空白對照組和陰性對照組相比，siRN轉染組細胞HDAC表達量明顯降低（P<0.05）。表明細胞轉染HDAClsiRNA后HDAClmRNA表達水平明顯降低。

2.2 Western blotting檢測HDAC1蛋白的表達

Western bloting結果顯示：在空白對照組、陰性對照組、siRNA轉染組的三個組中，siRNA轉染組的HDAC1基因明顯下調，相比另外兩組條帶亮度明顯要弱，參照GADPH，灰度分析顯示下降了59%，而空白對照組和陰性對照組的HDACI基因無明顯變化，表明轉染的反義基因有效的下調了HDAC1，阻斷了其表達，如圖1所示。

2.3細胞增殖檢測

HDAClsiRNA瞬間轉染對乳腺癌MCF-7細胞株增殖的影響。以MTT法檢測乳腺癌MCF-7細胞株瞬間轉染HDAClsiRNA 24h、36h、48h、72h后細胞的生長情況，與空白對照組和陰性對照組比較，siRNA組細胞的生長明顯變慢（P<0.05），但空白對照組與陰性對照組無明顯差異（P>0.05）。提示下調HDAC1的表達后，細胞的生長受到抑制。

2.4細胞周期檢測

轉染乳腺癌細胞36小時后，用流式細胞術檢測3組不同細胞周期的變化。如下表所示，與空白對照組與陰性對照組相比，通過RNA干擾下調HDACl的表達，細胞周期出現(xiàn)了明顯的變化，呈現(xiàn)G1、G2期阻滯、s期減少，表明通過通過RNA干擾下調HDACl的表達，有效的改變了siRNA轉染組的細胞周期（P<0.05）。

3討論

在所有HDACs中，HDAC1與腫瘤的關系具代表性，有研究者在肺腺癌、胃癌、HL-60細胞、胰腺癌、婦科腫瘤證實RNA干擾HDAC1基因，可以下調HDAC1的表達，隨之誘導細胞凋亡，抑制增殖。由于組蛋白乙?；惓е履[瘤的發(fā)生，導致轉錄水平發(fā)生異常，因此以此作為靶點治療是一種全新的治療途徑。

通過實驗將HDAC1基因沉默后，可引起癌細胞有絲分裂減少，細胞凋亡增多，同時細胞的生長受到一定程度的抑制，停滯在G1或G2M期。Silvia等證明人腫瘤細胞缺乏HDACl不能進行有絲分裂，而是通過Caspase-3激活途徑進入凋亡，同時細胞周期停滯在G1期或G2/M過渡期，從而抑制腫瘤細胞的生長，故剔除HDAC1的表達能抑制腫瘤生長。

在乳腺癌的實驗研究中，有人通過正向干預HDAC1，結果顯示組蛋白去乙醌化酶I（HDAC1）的表達可促進三陰性乳腺癌細胞的增殖。同時，構建的反義HDACI質粒導入MCF-7細胞，通過下調HDAC1基因，引起了細胞的增殖抑制及周期阻滯，表明HDAC1在乳腺癌MCF-7細胞中其乙酞化與去乙酸化修飾可能起重要作用。

本實驗旨在通過RNA干擾的手段，下調乳腺癌MCF-7細胞中HDAC1基因的表達，從而抑制細胞增長、使細胞周期發(fā)生改變。轉染后發(fā)現(xiàn)轉染組的HDAC1mRNA表達在干擾后能出現(xiàn)明顯的下降（P<0.05），HDAC基因蛋白的表達亦有明顯的下降（P<0.05），表明通過RNA干擾后能有效的阻斷了HDAC1的表達。MCF-7細胞株轉染后細胞增長比空白對照組和陰性對照組增長速度明顯降低（P<0.05）。提示下調HDAC1的表達，細胞的生長受到抑制。與空白對照組與陰性對照組相比，通過RNA干擾下調HDAC1的表達，細胞周期出現(xiàn)了明顯的變化，呈現(xiàn)G1、G2期比例增高、s期比例減少，表明通過通過RNA干擾下調HDAC1的表達，有效的改變了siRNA轉染組的細胞周期（P<0.05）。

綜上所述，HDAC1siRNA能有效抑制乳腺癌MCF-7細胞株HDAC1mRNA及蛋白的表達；在體外能有效抑制乳腺癌MCF-7細胞的生長增殖，誘導細胞周期發(fā)生阻滯。本研究提供了HDAC1在乳腺癌細胞中的選擇性作用譜，這為選擇性靶基因治療發(fā)展提供了新的有力的途徑。但HDAC1 siRNA抑制乳腺癌細胞增殖、誘導細胞周期阻滯的機制有待進一步研究。