中東呼吸綜合征冠狀病毒的實驗室檢測技術(shù)

王蔚，田棣，胡蕓文,2

1. 上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心病原體檢測與生物安全部，上海 201508；2. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室，上海 200032

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中東呼吸綜合征冠狀病毒的實驗室檢測技術(shù)

王蔚1，田棣1，胡蕓文1,2

1. 上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心病原體檢測與生物安全部，上海 201508；2. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室，上海 200032

摘要：中東呼吸綜合征(MERS)是一種由中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)感染所致的急性呼吸道傳染病，其臨床診斷需依據(jù)實驗室病原學(xué)檢測結(jié)果。本文就MERS-CoV的核酸檢測、抗原和抗體檢測、病毒分離鑒定及基因變異監(jiān)測等方面的最新研究進展作一綜述。

關(guān)鍵詞：中東呼吸綜合征冠狀病毒；實驗室診斷；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome，MERS)是一種由中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)感染所致的急性呼吸道傳染病。MERS-CoV是繼嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)后一種新發(fā)現(xiàn)的傳播力強、病死率高、可感染人的冠狀病毒。該病毒是有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約30 kb，基因組結(jié)構(gòu)與其他已知的人類冠狀病毒相似，至少含有10個開放讀碼框架(open reading frame，ORF)，編碼病毒的多種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白[1]。從遺傳進化上看，MERS-CoV屬于乙型冠狀病毒屬 C組成員，病毒溯源分析提示其可能來源于蝙蝠或中東沙漠地區(qū)的單峰駱駝[2]。人因接觸感染了MERS-CoV的動物而被感染，已有證據(jù)表明該病毒在人與人之間可通過密切接觸而傳播。

與其他常見呼吸道病原所致肺部感染相比，MERS-CoV感染的臨床表現(xiàn)沒有特征性差異，因此MERS確診病例的診斷需依據(jù)實驗室病原學(xué)檢測結(jié)果。MERS-CoV的實驗室檢測包括病毒核酸檢測、抗原和抗體檢測及作為病毒感染診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”的病毒分離鑒定。其中，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)因檢測病毒核酸具有周期短、易標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)勢而廣泛應(yīng)用于MERS的病原學(xué)診斷工作。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)于2012年12月首次推薦MERS-CoV的實驗室診斷標(biāo)準(zhǔn)流程，以指導(dǎo)臨床標(biāo)本的初篩和確認實驗。隨著人們對該病毒的深入研究和逐步了解，WHO又分別于2013年9月和2014年9月更新了指南內(nèi)容。以下就MERS-CoV實驗室檢測方法及流程進行簡要綜述。

1標(biāo)本采集

用于MERS-CoV檢測的標(biāo)本來自患者呼吸道、血液、尿液、糞便等。MERS-CoV的受體二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP4；又稱CD26)在呼吸道中主要分布于下呼吸道[3]，因此痰液、支氣管肺泡灌洗液、氣管抽吸物等下呼吸道標(biāo)本中含有高滴度MERS-CoV，是理想的標(biāo)本類型[4]。然而，在病程初期最易獲得的是鼻咽抽吸物或咽拭子，因此這些上呼吸道標(biāo)本仍為臨床主要送檢標(biāo)本類型。WHO建議，在條件允許的情況下，應(yīng)同時采集患者的上下呼吸道標(biāo)本，并在采集鼻咽拭子和咽拭子時使用專用的帶有病毒轉(zhuǎn)運液的拭子(http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/WHO_ interim_recommendations_ lab_detection_ MERSCoV_092014.pdf)。

除肺組織外，DPP4還廣泛分布于人體的腎、小腸、肝、前列腺等多種組織器官的上皮和內(nèi)皮細胞，以及樹突細胞、單核-巨噬細胞和T細胞等免疫細胞。這一分布特征導(dǎo)致MERS-CoV感染可累及體內(nèi)多種臟器，也造成其在呼吸道外的多途徑排毒[5]。有研究表明，部分患者的血液標(biāo)本可通過PCR檢測到病毒核酸，在尿和糞便標(biāo)本中也可檢測到病毒存在。盡管上述肺外標(biāo)本中的病毒載量比呼吸道標(biāo)本低，但臨床如能采集送檢可進一步提高病毒的檢出率，有利于盡快診斷。

同一病例在多個時間點采樣送檢對診斷、治療和疫情控制均有意義。初次采集的上呼吸道標(biāo)本中MERS-CoV檢測如為陰性，有必要進行重復(fù)采樣送檢。有研究認為，MERS-CoV與SARS-CoV相似[6]，鼻咽拭子標(biāo)本中病毒載量高峰可能出現(xiàn)在癥狀出現(xiàn)后的第2周而非發(fā)病初期。對于已確診的病例，有研究發(fā)現(xiàn)重癥患者排毒時間往往比輕癥患者長，而危重癥患者呼吸道及血液的排毒時間可超過3周[7]。因此，在患者隔離治療過程中，需每2~4 d采集1次上、下呼吸道標(biāo)本及其他類型標(biāo)本(如血液、尿液、糞便等)進行病毒核酸的PCR檢測。這樣，一方面可觀察治療效果，另一方面可跟蹤呼吸道排毒和肺外排毒時間，便于醫(yī)務(wù)人員采取相應(yīng)的感染控制措施。對于恢復(fù)期的病例，WHO建議每天進行呼吸道標(biāo)本的采集和PCR檢測，連續(xù)2次陰性者可考慮解除隔離(http://www.who.int/csr/disease/ coronavirus_infections/WHO_ interim_recommend ations_lab_detection_ MERSCoV_092014.pdf)。

標(biāo)本采集后，一般情況下應(yīng)盡快送實驗室檢測；如暫時無法送檢，應(yīng)根據(jù)標(biāo)本類型進行適當(dāng)處理后保存于-80 ℃，避免反復(fù)凍融。如在采樣環(huán)節(jié)中存在產(chǎn)生氣溶膠的風(fēng)險，醫(yī)務(wù)人員需在標(biāo)準(zhǔn)防護的基礎(chǔ)上增加N95口罩、眼罩、長袖防護服等個人防護裝備。

2MERS-CoV的核酸分子檢測

自2012年確認首例人感染MERS-CoV病例至2015年6月，全球已有MERS病例1 185例(http://www.who.int/csr/don/05-june-2015-mers-korea/en/)。因此，建立特異、有效的快速分子診斷方法對早期發(fā)現(xiàn)和防控疫情十分重要。

WHO推薦將MERS-CoV包被蛋白(envelop protein，E蛋白)基因的5′端上游序列(upstream of envelop gene，UpE)作為初篩檢測靶標(biāo)，ORF1a/1b作為進一步確診檢測靶標(biāo)。如果患者雙靶標(biāo)檢測陽性，則為確診病例；如果患者初篩靶標(biāo)陽性但第二靶標(biāo)檢測陰性，則需檢測其他基因，包括核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N蛋白)、RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependant RNA polymerase，RdRp)和刺突蛋白(spike protein，S蛋白)基因，且通過擴增產(chǎn)物測序確定；如果患者臨床癥狀和流行病學(xué)史高度符合但僅初篩陽性，缺少其他基因檢測結(jié)果，則作為疑似病例。所有確診或疑似病例均需連續(xù)采集2次以上標(biāo)本檢測，排除假陽性或假陰性。值得注意的是，對于上呼吸道標(biāo)本檢測陰性而臨床及流行病學(xué)史高度符合的患者，應(yīng)積極采集下呼吸道標(biāo)本送檢，降低假陰性(http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/WHO_interim_recommendations_lab_detection_MERSCoV_092014.pdf)。

目前，多個研究小組建立了MERS-CoV快速分子檢測方法，針對不同基因靶標(biāo)，分別采用實時RT-PCR、反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)或反轉(zhuǎn)錄等溫重組酶聚合酶擴增(reverse transcription-isothermal recombinase-polymerase amplification，RT-RPA)等技術(shù)。適用這些方法檢測的樣本包括上下呼吸道、糞便和血清樣本(表1)。其中，Corman等建立了針對UpE和ORF1b靶標(biāo)的實時RT-PCR，最低檢出限達3.4 RNA拷貝/反應(yīng)，是目前最廣泛采用的MERS-CoV初篩方案[8]。在以N基因作為靶標(biāo)的檢測方法中，實時RT-PCR或RT-RPA的最低檢出限為≤10 RNA拷貝/反應(yīng)[9,10]；RT-LAMP的最低檢出限達3.4 RNA拷貝/反應(yīng)[11]。以UpE和ORF1a為靶標(biāo)，采用實時RT-PCR的最低檢出限分別為5.3和9.3 RNA拷貝/反應(yīng)[12]。這些檢測均可作為MERS-CoV的實驗室初篩和確診方法。

表1MERS-CoV的核酸檢測方法
Tab.1Nucleic acid amplification tests for laboratory diagnosis of MERS-CoV

ReferencesMethodTargetgeneLimitofdetection(perreaction)Clinicalspecimen8rRT-PCRUpE3.4RNAcopies/0.01TCID50ORF1b64RNAcopies/0.1TCID50Respiratoryswab,sputum,endotrachealaspirate9rRT-PCRN≤10RNAcopies/2.6×10-5TCID50Sputum,serum,stool10RT-RPAN10RNAcopiesCell-culturedstrain11RT-LAMPN3.4RNAcopiesPharyngealswab12rRT-PCRORF1a9.3RNAcopies/2.8×10-3pfuUpE5.3RNAcopies/2.8×10-3pfuAspirationtube,exudate,bronchoalveolarfluid,stool13RT-LAMPORF1a0.02-0.2pfuORF1b0.02-0.2pfuUpE0.02-0.2pfuCell-culturedstrain14rRT-PCRLeadersequences5RNAcopies/5.62×10-5TCID50Nasalpharyngealswab

與傳統(tǒng)實時 RT-PCR相比，RT-LAMP和RT-RPA等新技術(shù)對儀器設(shè)備要求較低，樣本交叉污染小，更適用于缺乏完善實驗室條件下的現(xiàn)場快速篩查。Bhadra等針對UpE、ORF1b和ORF1a基因建立RT-LAMP檢測方法，最低檢出下限達0.02~0.2 pfu/反應(yīng)，但其檢測靈敏度未經(jīng)過臨床標(biāo)本驗證[13]。

此外，香港大學(xué)袁國勇研究小組建立針對冠狀病毒各亞型特異性前導(dǎo)序列(leading sequence)的RT-PCR，可一次鑒定5種冠狀病毒亞型：MERS、229E、OC43、HKU1和NL63病毒(表1)，最低檢出限達5 RNA拷貝/反應(yīng)，臨床診斷應(yīng)用前景較廣[14]。

3MERS-CoV的抗原檢測

MERS-CoV的抗原檢測主要應(yīng)用于確認動物組織中的病毒感染，也用于驗證病毒培養(yǎng)過程中陽性病變細胞內(nèi)的病毒復(fù)制。近期，Song等[15]建立了一種快速的膠體金免疫層析法(immuno-chromatographic assay，ICA)，用于檢測單峰駱駝鼻咽拭子中的MERS-CoV抗原。該方法利用高選擇性的單克隆抗體，可在室溫條件下短時間內(nèi)快速檢測到病毒的N蛋白。以針對UpE和ORF1a的實時RT-PCR檢測結(jié)果為參考，ICA的相對靈敏度和特異度分別為93.9%和100%。然而，臨床標(biāo)本中抗原檢測的合適時機尚不清楚，需進一步對MERS病例的中和抗體動態(tài)曲線及標(biāo)本排毒規(guī)律進行充分了解。

4MERS-CoV的抗體檢測

過去幾年中，研究者已建立了一些用于檢測MERS-CoV中和性抗體或非中和性抗體的方法，但尚需在臨床大規(guī)模驗證。這些方法包括間接免疫熒光試驗(immunofluorescence assay，IFA)、基于重組蛋白表達的酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、蛋白芯片技術(shù)(protein microarray)及假病毒中和抗體測試(pseudoparticle neutralization test，ppNT)。

Corman等[16]發(fā)現(xiàn)1例患者具有MERS-CoV感染的臨床癥狀，利用RT-PCR不能在呼吸道分泌物中檢出病毒，而IFA可在血清中檢出抗體。因此，初步檢測時，可利用IFA測試血清中所含的抗體。需注意的是，檢測可能會出現(xiàn)假陽性，因此建議該方法用于有明確流行病學(xué)特點的患者，且只能作為初篩而不能用于確診。

Al-Abdallat等[17]通過HKU5.2 N蛋白ELISA、IFA和微量中和實驗(micro-neutralisation test，MNT)檢測血清抗體?；蛐蛄蟹治鲲@示，蝙蝠冠狀病毒HKU4和HKU5與MERS-CoV類似，因此美國疾病預(yù)防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)開發(fā)了基于重組HKU5.2 N蛋白的ELISA，檢測MERS疑似病例血清中是否存在交叉反應(yīng)抗體；檢測到交叉反應(yīng)后，再利用IFA和MNT檢測MERS-CoV特異抗體。

Perera等[18]構(gòu)建了MERS-CoV S蛋白假病毒顆粒用于ppNT，與傳統(tǒng)的MNT一起對1 343份人血清和625份動物血清進行檢測。單峰駱駝血清中，MNT檢測到93.6%的血清對MERS-CoV有抗體反應(yīng)，ppNT檢測到98.2%的血清對MERS-CoV有抗體反應(yīng)。MNT檢測抗體效價≥1 280，ppNT檢測抗體效價≥10 240。ppNT與MNT檢測結(jié)果有很好的相關(guān)性。這種新的中和抗體檢測方法不需在生物安全三級實驗室中進行，同時避免了中和試驗中操作MERS-CoV活病毒帶來的生物安全隱患。

Reusken等[19]將蛋白芯片技術(shù)應(yīng)用于MERS-CoV和SARS-CoV的IgM和IgG抗體檢測。以MERS-CoV和SARS-CoV S1蛋白受體結(jié)合單元作為抗原，被來自4種常見人冠狀病毒(human coronavirus，hCoV)暴露人群的交叉反應(yīng)血清及hCoV-EMC或SARS-CoV恢復(fù)期患者的血清所驗證。這種方法允許最小樣品要求的高通量檢測，并可使用干燥血點進行測試，易于樣品運輸。

然而，因MERS-CoV抗體與其他人感染冠狀病毒存在交叉反應(yīng)，在缺乏病毒核酸檢測結(jié)果的情況下，基于上述方法的單次抗體檢測結(jié)果均不能作為病例確診的依據(jù)，必須通過檢測同一病例的急性期和恢復(fù)期的雙份血清來確定。因此，MERS-CoV的抗體檢測主要用于臨床流行病學(xué)調(diào)查和人群感染的回顧性研究。

5MERS-CoV的分離培養(yǎng)

病毒分離培養(yǎng)仍是鑒定特定病原體感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”。MERS-CoV具有宿主細胞的廣嗜性，可在體外感染多種人源或非人源細胞系，且在敏感細胞中復(fù)制速度較快，以合胞體形成為主要的細胞病變效應(yīng)。目前，基因工程改造可進一步提高細胞系對MERS-CoV的敏感度，為病毒研究、疫苗和藥物的研發(fā)等工作帶來了方便。

Zaki等[20]利用Vero和LLC-MK2細胞系培養(yǎng)MERS-CoV，接種5 d內(nèi)可引起一系列細胞病理改變。在低pH值時LLC-MK2細胞形成合胞體，在中性或堿性pH值時Vero和LLC-MK2細胞均出現(xiàn)細胞變圓及分離。Shirato等[21]利用穩(wěn)定表達跨膜絲氨酸蛋白酶2(transmembrane serine protease 2，TMPRSS2)的Vero細胞(Vero-TMPRSS2)培養(yǎng)MERS-CoV，接種3 h發(fā)生細胞融合，18 h后即出現(xiàn)合胞體。同時Vero-TMPRSS2細胞對MERS-CoV的敏感度比普通Vero細胞高100倍。

Chan等[22]研究MERS-CoV的細胞敏感性，發(fā)現(xiàn)與其他hCoV相比，其可在更加廣泛的細胞系中快速生長，如支氣管上皮細胞系Calu-3、胚胎成纖維細胞系HFL、肺腺癌細胞系A(chǔ)549、胚胎腎細胞系HEK、結(jié)直腸細胞腺癌細胞系Caco-2、肝癌細胞系Huh-7和細胞惡性組織細胞瘤細胞系His-1。在這些感染細胞中均能觀察到明顯的細胞病變，免疫染色可檢測到N蛋白表達，或在上清液中檢測到病毒復(fù)制，病毒載量可增加1~5倍。

此外，在單核細胞及T細胞系THP-1、U937和H9中，雖可檢測到病毒載量增加，但復(fù)制效率較低，且無核蛋白表達和細胞病變效應(yīng)。Tao等[23]在Jurkat T細胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CD26/DPP4編碼質(zhì)粒，獲得的Jurkat_CD26/DPP4細胞對MERS-CoV敏感，在感染病毒1或2 d后，80%~88%細胞死亡。

由于病毒培養(yǎng)所需周期較長，且需在生物安全三級實驗室中進行，該法在MERS-CoV臨床診斷中應(yīng)用受限。

6MERS-CoV的基因變異監(jiān)測

研究MERS-CoV基因變異情況，不僅有助于追溯病毒傳播流行途徑，還可實時監(jiān)測病毒對人體的適應(yīng)性變異，對疾病防控和治療有重要意義。

目前，GenBank已發(fā)表的MERS-CoV全長基因組核苷酸序列相似性>99%[24]，根據(jù)進化親緣關(guān)系分為4個簇(cluster)：A、B1、B2和C。然而，這一基因進化監(jiān)測需基于全長基因序列的分析，費時費力。MERS-CoV全長基因組有4個高變區(qū)，分別在ORF1a、S和ORF4a基因區(qū)域[13]。Koopmans研究小組根據(jù)長度為615 bp的S基因高變區(qū)序列，對MERS-CoV分型，結(jié)果與采用全長基因組序列的分型方法一致[25]。與全長基因組分析相比，該方法簡便，便于疫情暴發(fā)時當(dāng)?shù)貙嶒炇覍ERS-CoV變異情況進行密切監(jiān)測。

7結(jié)語

MERS病例的早發(fā)現(xiàn)和早治療對MERS疫情的防控至關(guān)重要，采用規(guī)范的診斷流程和快速、敏感的檢測方法是及時發(fā)現(xiàn)病例、控制疫情的關(guān)鍵。MERS-CoV的病原學(xué)診斷方法包括分子檢測方法、血清學(xué)方法及病毒分離培養(yǎng)等，各有優(yōu)勢和適用時機。對于特定病例和特定目的，需選擇合適的采樣時間、樣本種類、檢測手段，并結(jié)合流行病學(xué)史和臨床癥狀等對檢測結(jié)果進行準(zhǔn)確判斷和合理解釋。值得注意的是，隨著MERS-CoV在世界范圍內(nèi)的傳播，病毒可能加快變異。因此，在常規(guī)病原學(xué)診斷時，需多靶標(biāo)確認，并對病毒主要抗原蛋白的基因進行測序，必要時進行全長基因組測序，以降低漏檢率。同時，通過測序還可跟蹤監(jiān)測病毒變異情況，為防控工作提供重要數(shù)據(jù)。

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·論著·

Corresponding author. HU Yun-Wen, E-mail: ywhu@shaphc.org

Laboratory detections for Middle East respiratory syndrome coronavirus

WANG Wei1, TIAN Di1, HU Yun-Wen1,2

1. Department of Pathogen Detection and Biological Safety, Shanghai Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University, Shanghai 201508, China; 2. Department of Medical Microbiology and Parasitology, Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China

Abstract:Middle East respiratory syndrome (MERS) is an acute respiratory infectious disease caused by Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV). Its clinical diagnosis is based on pathogen detection in the laboratory. In this review, we summarize the latest research progress on the methodology of nucleic acid detection, serological detection, virus isolation and genetic variation monitoring of MERS-CoV.

Key words:Middle East respiratory syndrome coronavirus; Laboratory diagnosis; Reverse transcriptase-polymerase chain reaction

收稿日期：(2015-07-06)

通信作者：胡蕓文

基金項目：國家傳染病防治科技重大專項(2014ZX10004-211)