基于吲哚-3-甘油磷酸合成酶結(jié)構(gòu)的新型抗結(jié)核藥物的篩選

周濤, 王菲菲，黃強，王洪海，沈洪波

1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444； 2. 中國科學(xué)院上海巴斯德研究所，上海 200031； 3. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，上海 200032； 4. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433

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基于吲哚-3-甘油磷酸合成酶結(jié)構(gòu)的新型抗結(jié)核藥物的篩選

周濤1,2, 王菲菲3，黃強4，王洪海4，沈洪波2

1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444； 2. 中國科學(xué)院上海巴斯德研究所，上海 200031； 3. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，上海 200032； 4. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433

摘要：本研究通過同源建模方法，模擬結(jié)核分枝桿菌H37Rv來源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶(IGPS)的結(jié)構(gòu)，采用分子對接法，以IGPS結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，從包含60 000種化合物的Maybridge化合物庫中篩選出能與IGPS活性中心良好結(jié)合的化合物，并用抑菌實驗等生物學(xué)方法進行驗證。結(jié)果表明，化合物ATB26能與IGPS很好結(jié)合，且能體外有效抑制H37Rv和臨床分離的敏感和耐藥菌株的生長，其對結(jié)核分枝桿菌的體外最低抑菌濃度約為0.1 μg/ml。細胞毒性實驗表明，ATB26與臨床常用抗結(jié)核藥物異煙肼、乙胺丁醇類似，對THP-1細胞系毒性較小。結(jié)果提示，化合物ATB26是一個新型IGPS抑制劑，有望開發(fā)成為新型的抗結(jié)核藥，也可作為新型抗結(jié)核藥物開發(fā)的一個潛在靶點。

關(guān)鍵詞：吲哚-3-甘油磷酸合成酶；結(jié)核分枝桿菌；抑制劑

耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)是近年來結(jié)核病肆虐的主要原因之一，人們急需開發(fā)新型抗結(jié)核藥物。基于藥物作用靶蛋白的藥物篩選和設(shè)計，是近年來發(fā)展的新型藥物開發(fā)技術(shù)。本研究基于結(jié)核分枝桿菌來源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶(indole-3-glycerol phosphate synthase，IGPS)結(jié)構(gòu)，進行新型抗結(jié)核藥物的篩選。

IGPS是催化生物體內(nèi)色氨酸生物合成的重要酶，將底物烯醇式1-(O-羧基苯氨基)-1-脫氧核酮糖-5′-磷酸(CdRP)催化，生成吲哚-3-甘油磷酸(indole-3-glycerol phosphate, IGP)[1-3]。IGPS與結(jié)核分枝桿菌細胞壁合成及菌體內(nèi)脂質(zhì)代謝關(guān)系密切，對維持結(jié)核分枝桿菌的存活起重要作用[4]。Himarl轉(zhuǎn)座子突變實驗也證明，IGPS的編碼基因TrpC是結(jié)核分枝桿菌的必需基因[5]。因為哺乳動物和人體中均不存在IGPS，所以IGPS可作為抗結(jié)核藥物的候選靶位，基于其開發(fā)的靶向性新型抗結(jié)核藥對人體的毒副作用將較小。

本研究首先通過同源建模方法獲得結(jié)核分枝桿菌來源的IGPS三維結(jié)構(gòu)；然后對IGPS結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，利用AutoDock程序從Maybridge化合物數(shù)據(jù)庫中通過分子對接篩選與IGPS活性中心結(jié)合能力強的化合物；最后通過體外酶活性動力學(xué)實驗、抑菌(無毒株和有毒株)實驗及細胞水平毒理實驗進行篩選，獲得能抑制結(jié)核分枝桿菌繁殖和生長且細胞毒性較小的新型活性化合物ATB26，其有望被開發(fā)為新型抗結(jié)核藥物。

1材料與方法

1.1　IGPS的結(jié)構(gòu)模擬

本研究選用了一個開源的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬軟件Modeller 8.0(http://www.salilab.org/modeller/modeller.html)[6]。針對結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv的IGPS序列，用Modeller軟件進行結(jié)構(gòu)建模。通過Mollder objective function參數(shù)，選擇該值最低的模型。模型評價采用DOPE potential參數(shù)。IGPS結(jié)構(gòu)的合理性評價采用網(wǎng)絡(luò)模型評價系統(tǒng)(http://mordred.bioc.cam.ac.uk/rapper/rampage.php)繪制Ramachandran圖進行。

1.2　IGPS結(jié)構(gòu)的分子動力學(xué)模擬

研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子動力學(xué)模擬采用GROMOS87力場[7]。模擬過程中，采用周期性邊界條件，將模擬的IGPS放入邊界距離蛋白表面≥1.5 nm的立方盒中，溶劑水模型為單點電荷(simple point charge，SPC)模型，填充該立方盒，水分子數(shù)目為19 622。此外，為保持體系的電中性，根據(jù)所計算的靜電勢，8個Na+替換負電荷高密度區(qū)域的水分子，進行10 ns的分子動力學(xué)模擬采樣，使體系充分達到平衡狀態(tài)。

所有分子動力學(xué)模擬通過開源免費軟件GROMACS (Version 3.0)[8]實現(xiàn)。實驗采用的超級計算機是具有32 Intel 2.8 GHz Xeon CPU的 Lenovo Shenteng1800計算機，分子結(jié)構(gòu)作圖軟件為PyMOL和VMD。

1.3　分子對接

根據(jù)模擬優(yōu)化后的IGPS結(jié)構(gòu)，用AutoDock程序[9]進行分子對接，以期找到抑制劑的活性構(gòu)象。采用包含60 000個化合物結(jié)構(gòu)的Maybridge數(shù)據(jù)庫，由英國Maybridge Chemical Comapny免費提供。

1.4　酶的分離純化及酶活性測定

IGPS的制備參照文獻[10]。酶活性測定反應(yīng)體系包含470 μl 5 mmol/L Tris、10 μl CdRP、20 μl 5 μg/ml IGPS，在280 nm處檢測吸光值。設(shè)立只有IGPS無CdRP以及只有CdRP無IGPS的對照體系，對照體系可排除IGPS和CdRP對吸光值的影響[11]。酶活性單位的定義為：37 ℃反應(yīng)條件下，每分鐘催化CdRP形成1 μmol/L IGP的酶活性定義為1 U[12]。

1.5　化合物的體外抑菌實驗

結(jié)核分枝桿菌無毒株H37Ra、標準有毒株H37Rv、臨床耐藥及敏感菌株等均由上海市肺科醫(yī)院樂軍博士惠贈。細菌在含10% OADC的7H9培養(yǎng)基中生長。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma公司，用于溶解小分子化合物，配制成5 mg/ml溶液。有毒株H37Rv、臨床耐藥及敏感菌株實驗均在上海市肺科醫(yī)院進行。

將結(jié)核分枝桿菌配制成1 mg/ml的菌液，取5 μl，含1×105~5×105個細菌，接種到500 μl 7H9液體培養(yǎng)基中，然后加入不同濃度的化合物，置37 ℃恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)，3周后觀察結(jié)果。

1.6　化合物的細胞毒性實驗

實驗細胞株為具有吞噬功能的懸浮細胞THP-1。采用甲基噻唑藍(methylthiazoly tetrazolium，MTT)比色法。在96孔板中，每孔加入100 μl約5 000個細胞和一定濃度的化合物溶液，共同培養(yǎng)24 h；加入10 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；加入100 μl甲臜(formazan)溶解液，至藍紫色晶體全部溶解，于570 nm測吸光值?；衔镉肈MSO溶解。

1.7　化合物與IGPS體外結(jié)合能力的測定

IGPS溶于含1% DMSO的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中，調(diào)整濃度為720 μg/ml。將IGPS固定在芯片上?；衔餄舛忍荻葹?×10-5mol/L、0.25×10-5mol/L、0.157×10-6mol/L和0.195×10-7mol/L。按儀器使用說明，用BIACORE 3000生物大分子相互作用分析儀測定化合物與蛋白的結(jié)合能力[13]，測定平衡解離常數(shù)(Kd)。

2結(jié)果

2.1　結(jié)核分枝桿菌H37Rv來源的IGPS建模

在Modeller搜索到的與結(jié)核分枝桿菌IGPS同源性較高的晶體結(jié)構(gòu)(表1)中選擇1VC4A(PDB ID)為模板，利用Modeller 8.0軟件進行同源建模，獲得H37Rv IGPS的5個三維結(jié)構(gòu)，分別為IGPS_1、IGPS_2、IGPS_3、IGPS_4和IGPS_5，其Modeller objective function值分別為1 633.370 5、1 745.012 0、1 681.453 7、1 650.790 6和1 611.094 2。

表1　Modeller搜索到的與結(jié)核分枝桿菌IGPS同源性較高的晶體結(jié)構(gòu)Tab.1　Structures with high similarity with IGPS of M.tuberculosis

根據(jù)模板1VC4A(圖1A)和5個IGPS模型(圖1B)的DOPE值曲線，發(fā)現(xiàn)5個模型的DOPE值曲線與模板曲線走勢基本一致，表明這5個模型與模板均有很好的一致性。

結(jié)構(gòu)模型IGPS_5的objective function值最低，因此選擇其作為IGPS的最佳模型，進行深入研究。結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv來源的IGPS結(jié)構(gòu)(圖2)屬典型的(β/α)8模型，具有8個β折疊組成的內(nèi)核結(jié)構(gòu)，外周包含8個α螺旋，之間通過柔性較大的環(huán)結(jié)構(gòu)相連。

A: 1VC4A. B: Five IGPS models.圖1　模板1VC4A(A)以及5個IGPS模型(B)的DOPE得分曲線Fig. 1　The DOPE score profile of 1VC4A and 5 IGPS models

圖2　IGPS中的預(yù)測活性位點Fig.2　The predicted active sites in IGPS

2.2　IGPS結(jié)構(gòu)模型的評價

IGPS結(jié)構(gòu)模型的Ramachandran圖(圖3)表明，249個點(92.2%)位于合理區(qū)域；12個點(4.4%)在允許區(qū)域；9個點位于不合理區(qū)域(3.3%)。表明模擬獲得的IGPS結(jié)構(gòu)模型中各Cα兩個相鄰肽單位的構(gòu)象比較合理，且具有立體化學(xué)允許的二面角(Φ，Ψ)所規(guī)定的構(gòu)象，即構(gòu)象能量最低，構(gòu)象穩(wěn)定、合理。

圖3　IGPS結(jié)構(gòu)模型的Ramachandran圖Fig.3　Ramachandran plot of IGPS

2.3　同源序列比對預(yù)測IGPS的活性中心

為確定IGPS結(jié)構(gòu)中化合物的對接位點，本課題組對其活性位點進行了理論預(yù)測。首先，與研究較多的包括大腸埃希菌在內(nèi)的一些菌株來源的IGPS序列進行多重序列比對，推測出相關(guān)重要氨基酸在結(jié)核分枝桿菌來源的IGPS中的位置。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，文獻報道的相關(guān)氨基酸在H37Rv來源的IGPS中位置分別為57E[14]、119K、168E[14]、189N[15]、219E[15]，其中119K被認為是可能的酸供體，219E為堿供體[15]。這些活性相關(guān)的氨基酸及保守性較高的氨基酸主要位于由β折疊和β/α環(huán)組成的區(qū)域(圖3)。在對接計算中，選取作用范圍的半徑為22.5 ?，其范圍超過分子中作用腔的半徑(最大半徑15~18 ?)，因此篩選覆蓋了整個可能的活性區(qū)域。

2.4　化合物的計算機輔助篩選

選擇Number of conformations、Final docked energy、Estimated free energy of binding等參數(shù)評價對接結(jié)果，篩選并購買綜合效果最好的100個化合物進行生物學(xué)實驗。由圖4可見，化合物在IGPS的結(jié)合位置主要位于β折疊組成的桶狀結(jié)構(gòu)上端(β折疊的C端)和β/α環(huán)，該位置是含(β/α)8結(jié)構(gòu)的蛋白的一個共有活性中心[16]。表明結(jié)核分枝桿菌來源的IGPS其結(jié)構(gòu)和功能均具有典型的(β/α)8結(jié)構(gòu)特征，屬于典型的(β/α)8結(jié)構(gòu)蛋白。

2.5　化合物ATB26的體外抑菌實驗

抑菌實驗結(jié)果表明，化合物ATB26(圖5)對結(jié)核分枝桿菌H37Ra的最小抑菌濃度為0.2 μg/ml(表2)。本研究還驗證了化合物ATB26對臨床分離耐藥菌株(至少對異煙肼、利福平具有抗性)的抑菌效果，以標準毒株H37Rv為對照。結(jié)果表明，化合物ATB26對H37Rv及臨床耐藥菌株的最低抑菌濃度約為0.1 μg/ml。

A: Bird’s eye view. B: Plat view.圖4　IGPS與化合物的結(jié)合模式Fig. 4　Binding of ligands with IGPS

圖5　化合物ATB26的結(jié)構(gòu)式Fig.5　Structure of ATB26

表2　化合物ATB26抑制結(jié)核分枝桿菌生長的部分實驗結(jié)果Tab. 2　MICs of ATB26 for different M. tuberculosis strains

* Eight MDR strains used.

2.6　化合物ATB26對IGPS活性的影響

檢測ATB26在體外對IGPS活性的影響，結(jié)果顯示，ATB26對IGPS活性有明顯抑制作用，表明IGPS抑制劑可能在細胞內(nèi)通過與IGPS結(jié)合并抑制其活性而影響細菌正常生長(圖6)。

圖6　化合物ATB26對IGPS酶活性的抑制作用Fig.6　Inhibition of ATB126 on IGPS activity

2.7　化合物ATB26與IGPS的體外結(jié)合能力

不同濃度ATB26與IGPS的結(jié)合曲線顯示，ATB26與IGPS的結(jié)合能力隨ATB26濃度的升高而增強，即ATB26與IGPS的結(jié)合能力與其濃度呈正相關(guān)。ATB26與IGPS的Kd值為2.3E-6，表明ATB26與IGPS具有較強的體外結(jié)合能力，可抑制IGPS的生物學(xué)活性(圖7)。

Representative sensorgrams obtained from injection of ATB26 at concentrations of 1×10-5 mol/L, 0.25×10-5 mol/L, 0.157×10-6 mol/L and 0.195×10-7 mol/L (from up tp down).圖7　化合物ATB26與IGPS的體外結(jié)合能力曲線Fig.7　Kinetic analysis of ATB26 binding to IGPS by SPR technology using BIACORE 3000

2.8　化合物ATB26的細胞毒性實驗

利用人源細胞THP-1驗證ATB26的細胞毒性。因為藥物溶于DMSO溶液，首先需選擇合適的DMSO濃度以消除DMSO對實驗的影響。結(jié)果表明，高濃度DMSO對細胞毒性較大，當DMSO濃度為3%時對細胞毒害作用較小，因此選擇3%為DMSO使用的最高濃度(圖8A)。

A： Effect of DMSO on the growth of THP-1 cells. B： Effect of drugs at different concentrations on the growth of THP-1 cells. The tests were repeated five times. INH, isoniazid; ETH, ethambutol.圖8　化合物ATB26的細胞毒性實驗Fig.8　Effect of ATB26 on the growth of THP-1 cells

選取目前臨床常用的一線藥物異煙肼(isoniazid)和乙胺丁醇(ethambutol)，稀釋成不同濃度，進行THP-1細胞毒性實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種藥物在高濃度時均具有一定細胞毒性，影響細胞正常生長。在較低濃度時，細胞毒性較弱。在濃度為50 μg/ml時，乙胺丁醇組細胞存活率超過90%，異煙肼組細胞存活率也有80%左右?；衔顰TB26細胞毒性較小，與乙胺丁醇和異煙肼相當。ATB26濃度為50 μg/ml時，細胞存活率維持在90%以上，表明其無明顯的細胞毒性，可用于進一步的藥物開發(fā)實驗(圖8B)。

3討論

基于人類基因組及后續(xù)功能基因組研究的深入，形成了“從基因組到藥物” 的藥物研究新模式[17]。在細胞和分子水平弄清疾病發(fā)生機制后，人們可發(fā)現(xiàn)并確證潛在的藥物作用靶標，然后針對其靶標有的放矢地尋找藥物。該過程包含3個重要步驟：①發(fā)現(xiàn)與確證新靶標；②發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化新型藥物先導(dǎo)化合物；③藥物開發(fā)[18]。隨著分子生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，一些靶標生物大分子的功能被闡明，三維結(jié)構(gòu)被測定。藥物分子設(shè)計已廣泛應(yīng)用于創(chuàng)新藥物先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化并取得突破性進展，同時帶動了藥物分子設(shè)計新方法的快速發(fā)展[19]，藥物分子設(shè)計已成為創(chuàng)新藥物研究的核心技術(shù)之一。

本研究以結(jié)核分枝桿菌H37Rv來源的IGPS作為篩選新型抗結(jié)核藥物的靶點，通過計算機輔助藥物設(shè)計獲得有潛力的抗結(jié)核藥物。在虛擬篩選中，采用優(yōu)化后的IGPS結(jié)構(gòu)模型，利用AutoDock程序進行基于結(jié)構(gòu)匹配和能量匹配的分子對接計算，篩選能很好地與IGPS活性中心結(jié)合的藥物先導(dǎo)化合物，然后分別進行體外酶活性動力學(xué)實驗、抑菌(無毒株和有毒株)實驗及細胞水平的毒理實驗，得到包括ATB26和ATB107[20]在內(nèi)的能有效抑制結(jié)核分枝桿菌繁殖和生長且無細胞毒性的新型活性化合物。對這些化合物，將進行體內(nèi)模型殺菌實驗篩選，有望獲得抗結(jié)核分枝桿菌尤其是抗耐藥結(jié)核分枝桿菌的新型藥物。本研究證明，結(jié)核分枝桿菌來源的IGPS是一個有效的篩選新型抗結(jié)核藥物的靶點。

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為了促進及幫助本刊讀者提高專業(yè)英語寫作水平，上期刊出了2句中文科技詞句，這一期將刊出其對應(yīng)的英文詞句，供讀者對比學(xué)習(xí)。

1.In light of the current outbreak of Ebola virus disease, there is an urgent need to develop effective therapeutics to treat Ebola infection, and drug repurposing screening is a potentially rapid approach for identifying such therapeutics.

評議：應(yīng)用In light of表達“鑒于”值得學(xué)習(xí)。

drug repurposing screening中的repurposing，中文中未表達，該詞是說明“有目的”篩選，可供藥物學(xué)撰寫中參用。

2.Although the active compounds found to block Ebola VLP entry need to be further tested in wild-type Ebola virus infection assays and in animal models to confirm their antiviral activity, our results represent a proof-of-principle investigation supporting the suitability of this assay for rapid screening of Ebola antiviral compounds that inhibit viral entry.

評議：proof-of-principle與proof-of-concept不同。前者用于闡明對實驗方法的確證，后者用于闡明對一種理論的證實。

應(yīng)用suitability(適用性)有特點，中文中未表達。

英文常可以用較長的句子，但是認為超過6行的句子為過長。

·論著·

·論著·

Corresponding author. SHEN Hong-Bo, E-mail: hbshen@ips.ac.cn

Screening of novel inhibitors of indole-3-glycerol phosphate synthase fromMycobacteriumtuberculosis

ZHOU Tao1,2, WANG Fei-Fei3, HUANG Qiang4, WANG Hong-Hai4, SHEN Hong-Bo2

1. School of Life Sciences, Shanghai University, Shanghai 200444, China; 2. Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China; 3.Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China; 4. School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China

Abstract:In this study, the structure of indole-3-glycerol phosphate synthase (IGPS) from Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) H37Rv was obtained by homologous modeling. Based on the IGPS structure, virtual screening was carried out to select novel inhibitors from the Maybridge database with about sixty thousand organic compounds. Through biological selection, one compound, named ATB26, was identified as a potential inhibitor of IGPS, which showed potent antimycobacterial activity not only against M. tuberculosis H37Rv, but also clinical isolates of multidrug-resistant M. tuberculosis strains with minimum inhibition concentration (MIC) of 0.1 μg/ml. ATB26 could bound tightly to IGPS in vitro and inhibited activity of IGPS. These results suggest that ATB26 is a novel potent inhibitor of IGPS, a potential target for the development of new anti-tuberculosis drugs.

Key words:Indole-3-glycerol phosphate synthase；Mycobacterium tuberculosis； Inhibitor

收稿日期：(2015-02-13)

通信作者：沈洪波

基金項目：中國科學(xué)院重點部署項目(KSZD-EW-Z-006)，上海市科委科技支撐項目(13431900103)