分枝桿菌脂質(zhì)組分加強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌亞單位疫苗效應(yīng)的初步研究

何珊珊，何娟娟，劉勛，孔祥熙，譚繼英，祝秉東

1. 甘肅省循證醫(yī)學(xué)與臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨蘭州大學(xué)結(jié)核病研究中心，蘭州730000；2. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所，蘭州 730000；3. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，蘭州 730000

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分枝桿菌脂質(zhì)組分加強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌亞單位疫苗效應(yīng)的初步研究

何珊珊1,2，何娟娟1,3，劉勛1,3，孔祥熙1,2，譚繼英1,2，祝秉東1,3

1. 甘肅省循證醫(yī)學(xué)與臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨蘭州大學(xué)結(jié)核病研究中心，蘭州730000；2. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所，蘭州 730000；3. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，蘭州 730000

摘要：分枝桿菌細(xì)胞壁含豐富的脂質(zhì)組分，其中一些具有抗原性，或具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。為探討這些脂質(zhì)組分在結(jié)核分枝桿菌亞單位疫苗中的作用，研發(fā)有效疫苗，本研究對卡介苗(BCG)細(xì)胞壁總脂成分進(jìn)行萃取，用硅膠柱色譜法將其分離為非極性脂、中間極性脂和極性脂，檢測各類脂質(zhì)組分在人群中的免疫原性，并將總脂和各類脂質(zhì)組分分別與佐劑二甲基三十六烷基銨(DDA)和Poly(I∶C)混合，進(jìn)一步與結(jié)核分枝桿菌融合蛋白LT70(ESAT6-Ag85B-MPT64<190-198>-Mtb8.4-Rv2626c)混合，構(gòu)建含脂質(zhì)的結(jié)核分枝桿菌亞單位疫苗。在小鼠BCG攻擊模型中進(jìn)行保護(hù)效率評價，包括BCG初免后含脂質(zhì)亞單位疫苗的強(qiáng)化免疫保護(hù)效率評價。結(jié)果顯示，結(jié)核病患者脂質(zhì)特異性抗體IgG高于健康人群(P<0.05)。在小鼠BCG攻擊模型免疫保護(hù)效果評價中，含脂質(zhì)亞單位疫苗LT70-總脂組小鼠肺部的荷菌數(shù)顯著低于BCG組(P<0.05)。在BCG初免-含脂質(zhì)亞單位疫苗加強(qiáng)免疫策略中，LT70-總脂和LT70-中間極性脂組小鼠肺部荷菌數(shù)均低于BCG組(P<0.01)和LT70組(P<0.05)。研究表明，分枝桿菌脂質(zhì)成分具有較強(qiáng)的免疫原性，與亞單位疫苗聯(lián)合使用能增強(qiáng)亞單位疫苗的抗結(jié)核分枝桿菌效果。其中，中間極性脂類強(qiáng)化作用明顯，值得深入研究。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；亞單位疫苗；卡介苗；細(xì)胞壁；脂質(zhì)

結(jié)核病(tuberculosis)是全球傳播范圍最廣、持續(xù)時間最長、危害最為嚴(yán)重的傳染病。據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)報告，全球約有900萬人罹患結(jié)核病，150萬人死于結(jié)核?。磺译S著人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)共感染、多重耐藥結(jié)核分枝桿菌和廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌增多，結(jié)核病的治療更加困難[1]。因此，人們越來越注重免疫預(yù)防性抗結(jié)核措施。目前，結(jié)核病防治所使用的疫苗卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)能預(yù)防新生兒和兒童全身粟粒性結(jié)核及結(jié)核性腦膜炎，但不能有效預(yù)防成人肺結(jié)核病，因此尋找新型有效的疫苗尤為重要。現(xiàn)階段結(jié)核分枝桿菌疫苗的研究以重組BCG疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗和蛋白亞單位疫苗為主，而分枝桿菌脂質(zhì)成分疫苗的研究尚不多見[2]。

分枝桿菌細(xì)胞壁含有大量特異的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的脂質(zhì)成分。它們具有抗原性，還可調(diào)節(jié)宿主抗感染免疫。目前，研究最多的索狀因子海藻糖二霉菌酸酯(trehalose-6,6′-dimycolate，TDM)為一種分枝菌酸與海藻糖結(jié)合的糖脂，能使結(jié)核分枝桿菌相互粘連，促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放促炎癥因子，提高體液免疫和細(xì)胞免疫[3,4]。TDM及其衍生物海藻糖二十二酸酯(trehalose-6,6′-dibehenate，TDB)是結(jié)核分枝桿菌亞單位疫苗的有效佐劑。由TDB與二甲基三十六烷基銨(N,N′-dimethyl-N,N′-dioctadecylammonium， DDA)組成的佐劑CAF01可誘導(dǎo)較強(qiáng)的Th1免疫應(yīng)答，增強(qiáng)Ag85B-ESAT-6(H1)疫苗的保護(hù)性[5]。分枝桿菌細(xì)胞壁脂質(zhì)還可通過不同于經(jīng)典抗原呈遞途徑的CD1系統(tǒng)活化T細(xì)胞，發(fā)揮免疫保護(hù)效應(yīng)[6]。已在結(jié)核病患者和經(jīng)BCG免疫的健康人中檢測到脂質(zhì)特異性CD1限制性T細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)此類細(xì)胞通過記憶性免疫應(yīng)答控制結(jié)核分枝桿菌感染[7]。

本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的融合蛋白LT70 (ESAT6-Ag85B-MPT64<190-198>-Mtb8.4-Rv2626c，相對分子質(zhì)量70 000)包含結(jié)核分枝桿菌在不同生長時期表達(dá)的抗原，同時證實(shí)陽離子脂質(zhì)體DDA與Poly(I∶C)復(fù)合佐劑具有誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用[8]。由兩者組成的LT70亞單位疫苗在小鼠模型H37Rv攻毒保護(hù)效力評價實(shí)驗(yàn)中具有較好的抗結(jié)核免疫效應(yīng)。本研究基于以上結(jié)果，將BCG細(xì)胞壁總脂和各脂質(zhì)組分萃取、分離，并與LT70疫苗混合構(gòu)建含脂質(zhì)亞單位疫苗，采取脂質(zhì)亞單位疫苗免疫和BCG初免-亞單位疫苗加強(qiáng)免疫策略免疫小鼠，通過BCG攻擊評價保護(hù)效率，初步探討分枝桿菌細(xì)胞壁脂質(zhì)成分在結(jié)核分枝桿菌亞單位疫苗中的應(yīng)用。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1菌株BCG(丹麥株)由蘭州生物制品研究所惠贈，本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.1.2培養(yǎng)基Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基、Middlebrook 7H11固體培養(yǎng)基、增菌液OADC均購自美國BD公司。

1.1.3主要試劑融合蛋白LT70由本實(shí)驗(yàn)室制備，DDA、Poly(I∶C)購自Sigma公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記山羊抗人總IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)顯色劑、戊巴比妥鈉、氨芐西林購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.4實(shí)驗(yàn)動物無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級BABL/c雌鼠，4~6周齡，體重18~22 g，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2　方法

1.2.1BCG菌種制備將BCG接種于Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)3周，制備成懸液；于蘇通培養(yǎng)基(pH 7.2~7.4)37 ℃培養(yǎng)4周，121 ℃滅活20 min；用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered sa1ine，PBS)洗3次，收集菌體。

1.2.2總脂和各脂質(zhì)組分的萃取、分離與檢測每10 g BCG菌體加氯仿∶甲醇(2∶1)混合液30 ml，過夜。收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)氯仿和甲醇獲得總脂。硅膠柱色譜法分離總脂，依次用氯仿∶甲醇、氯仿∶甲醇∶水、氯仿∶丙酮∶甲醇∶水洗脫，獲得非極性脂、中間極性脂和極性脂。具體方法為：150 ml氯仿浸泡50 g硅膠粉末，過夜，勻漿濕法裝柱。氯仿∶甲醇 (2∶1)溶解總脂，濃度為1 g/ml，上樣1 ml。依次加入100 ml氯仿∶甲醇(96∶4)、氯仿∶甲醇∶水(100∶14∶0.8)、氯仿∶丙酮∶甲醇∶水(47∶25∶3∶5)，分別收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，獲得非極性脂、中間極性脂和極性脂3種脂質(zhì)組分。用二向薄層色譜(two direction-thin layer chromatography，2D-TLC)法分析鑒定總脂和各脂質(zhì)組分。脂質(zhì)成分的鑒定參考Dobson等的TLC分析，展開劑系統(tǒng)a-c見表1[9]。碘熏蒸或磷鉬酸乙醇溶液顯色檢測脂類。

表1　2D-TLC分析脂質(zhì)用展開劑系統(tǒng)[9]Tab.1　Developing solvent system for 2D-TLC analysis of lipids[9]

1.2.3疫苗制備將DDA分別與各脂質(zhì)組分混合，用氯仿∶甲醇(9∶1)溶解，真空抽濾蒸干有機(jī)溶劑，形成白色薄膜。低溫、干燥過夜，除去殘余有機(jī)溶劑，57 ℃水浴震蕩，用PBS溶解，與LT70、Poly(I∶C)混合，制成含脂質(zhì)亞單位疫苗。每劑疫苗含DDA 250 μg、脂質(zhì)成分(總脂/非極性脂/極性脂/中間極性脂)250 μg、Poly(I∶C) 50 μg、抗原LT70 10 μg。

1.2.4免疫策略于BABL/c小鼠腹股溝皮下注射含脂質(zhì)亞單位疫苗，每只200 μl。BCG初免-含脂質(zhì)亞單位疫苗加強(qiáng)策略組：在小鼠BCG初免(劑量5×106cfu)9周后，亞單位疫苗加強(qiáng)免疫2次，每次間隔3周。含脂質(zhì)亞單位疫苗免疫策略組：亞單位疫苗共免疫3次，每次間隔3周。BCG(劑量5×106cfu)0周免疫一次作為對照，PBS免疫作為空白對照。

1.2.5保護(hù)效率檢測所用感染方式用BCG滴鼻方式感染BABL/c鼠。末次免疫5周后，用0.3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠(100 μl/10 g)，50 μl BCG(2.5×106cfu )菌液滴鼻感染小鼠。

1.2.6肺荷菌量計(jì)數(shù)BCG攻毒3周后，處死小鼠，取肺組織，研磨成勻漿。用PBS 10倍梯度稀釋至10、100、1 000共3個梯度，均勻涂布于Middlebrook 7H11固體培養(yǎng)基(含10% OADC、25 μg/ml氨芐西林)。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)3周，菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果以每組小鼠每克肺組織的log10cfu均值表示。

1.2.7脂質(zhì)特異性IgG檢測取蘭州市肺科醫(yī)院臨床確診結(jié)核病患者22人份全血和甘肅省人民醫(yī)院健康體檢者10人份血清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清脂質(zhì)特異性IgG。主要步驟：以正己烷∶甲醇為包被液，用80 μg/ml非極性脂、中間極性脂、極性脂抗原包被，每孔25 μl，室溫過夜；1%牛血清白蛋白37 ℃封閉1 h，PBS洗滌，加入倍比稀釋的待檢血清100 μl，37 ℃孵育1 h；PBS洗5次，加入HRP標(biāo)記羊抗人IgG 100 μl，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌，加入TMB 100 μl，顯色15 min；用2 mol/L硫酸終止，檢測450 nm處的光密度(optical density，OD)。

1.3　統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以mean±SD表示，SPSS19軟件進(jìn)行分析。多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1　總脂和各脂質(zhì)組分的萃取和檢測

用氯仿∶甲醇萃取BCG細(xì)胞壁總脂。為分析總脂中脂質(zhì)成分的極性和含量，選用3種不同極性的展開劑系統(tǒng)進(jìn)行檢測。極性較低的a展開劑系統(tǒng)可檢測到2種成分(圖1A)；中間極性的b展開劑系統(tǒng)可檢測到多種成分(圖1B)；極性較高的c展開劑系統(tǒng)亦可檢測到多種成分(圖1C)。

Total lipids were extracted using chloroform-methanol. Three groups of lipids were isolated by silica column. The composition of total lipids and three groups of lipids were analyzed using analytical 2D-TLC. A-C: Total lipids were analyzed with TLC systems a, b, c and visualized by exposing the TLC plates to iodine vapor for 5 min. D: Nonpolar lipids analyzed with TLC systems a; E: Intermediate polar lipids analyzed with TLC systems b; F: Polar lipids analyzed with TLC systems c.圖1　總脂和3種脂質(zhì)組分的2D-TLC分析Fig.1　2D-TLC analysis of total lipids and three groups of lipids

通過硅膠柱色譜法分離獲得非極性脂、中間極性脂和極性脂3種脂質(zhì)組分，非極性脂、中間極性脂和極性脂的比例約為1∶6∶3。根據(jù)極性大小，選擇相應(yīng)的展開劑系統(tǒng)檢測所含成分的多少并顯色(圖1D~F)。結(jié)合文獻(xiàn)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9-11]，發(fā)現(xiàn)非極性脂質(zhì)組分含2種成分，可能為結(jié)核菌醇二分枝菌酸(phthiocerol dimycocerosate，PDIM)和三酰甘油；中間極性脂質(zhì)組分主要是糖脂，在總脂中占比較大；極性脂質(zhì)組分主要含磷脂類，占比介于非極性脂質(zhì)組分與中間極性脂質(zhì)組分之間。

3.2　脂質(zhì)抗原特異性IgG

檢測結(jié)核病患者和健康人血清中各脂質(zhì)組分特異性IgG(圖2)，發(fā)現(xiàn)人群中可檢測到一定水平脂質(zhì)特異性IgG，其中極性脂抗體水平在兩類人群中最高，非極性脂抗體次之，中間極性脂抗體最低。在健康人中，極性脂IgG水平明顯高于其他2種脂質(zhì)IgG水平。結(jié)核病患者血清中非極性脂、中間極性脂和極性脂IgG水平高于健康人。

Lipid-specific IgG in sera of twenty-two tuberculosis patients and ten healthy individuals were analyzed by ELISA. Each point represents the average and standard deviation of three independent experiments. The solid line represents sera of tuberculosis patients. The dotted line represents sera of healthy individuals.圖2　各脂質(zhì)組分在人群中的IgG抗體水平Fig.2　Antibody responses to three groups of lipids in human population

LT70 subunit vaccine was mixed with total lipids, nonpolar lipids, intermediate polar lipids and polar lipids respectively to form subunit vaccines containing different lipids. Mice were immunized three times with subunit vaccines containing different lipids at 0, 3rd, and 6th week (A). Mice were primed by BCG at 0 week and boosted twice with vaccines containing different lipids at 9st and 12th week (B). Five weeks after the last injection, all mice were challenged nasally with 2.5×106 cfu of BCG. Three weeks after infection, cfu in mouse lung were measured. LT70 subunit vaccine was composed of fusion protein ESAT6-Ag85B-MPT64<190-198>-Mtb8.4-Rv2626c. *P﹤0.05, **P﹤0.01.圖3　含不同脂質(zhì)成分亞單位疫苗的保護(hù)效應(yīng)Fig.3　Protective efficacy of subunit vaccine containing different lipids

3.3　保護(hù)效率評價

在小鼠模型中評價保護(hù)效率。含脂質(zhì)亞單位疫苗免疫策略組：于BABL/c小鼠腹股溝皮下注射含脂質(zhì)亞單位疫苗3次，滴鼻感染，感染后3周計(jì)數(shù)肺部荷菌量。結(jié)果顯示，LT70-總脂組有較好的保護(hù)效率。LT70-總脂組、LT70-中間極性脂組和LT70-非極性脂組小鼠肺部荷菌量(log10cfu)分別為4.98±0.23、5.21±0.12和5.29±0.22。BCG組荷菌量(log10cfu)為5.27±0.23。與BCG組相比，LT70-總脂組肺部荷菌量顯著降低(P<0.05)；LT70-中間極性脂組肺部荷菌量有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LT70-非極性脂組肺部荷菌量高于BCG組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A)。

在小鼠BCG初免9周后，用含脂質(zhì)亞單位疫苗加強(qiáng)免疫2次，滴鼻感染，感染后3周計(jì)數(shù)肺部荷菌量。結(jié)果顯示，BCG初免-含脂質(zhì)亞單位疫苗加強(qiáng)策略組中總脂和中間極性脂顯著加強(qiáng)LT70的保護(hù)效率。與BCG組荷菌數(shù)(log10cfu)5.55±0.25相比，LT70-總脂組、LT70-中間極性脂組和LT70-極性脂組荷菌數(shù)均顯著下降，分別為4.95±0.18、5.03±0.18和5.19+0.22(P<0.01，P<0.05)；與不含脂質(zhì)的單獨(dú)LT70疫苗組小鼠肺部荷菌數(shù)(log10cfu)5.29±0.23相比，LT70-總脂組和LT70-中間極性脂組具有更高的細(xì)菌清除率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，脂質(zhì)組分，尤其是中間極性脂質(zhì)組分的加入可顯著降低小鼠肺部荷菌數(shù)，增強(qiáng)LT70的保護(hù)性(圖3B)。

4討論

本研究在前期構(gòu)建的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白亞單位疫苗LT70的基礎(chǔ)上，加入分枝桿菌細(xì)胞壁各類脂質(zhì)組分，構(gòu)建含脂質(zhì)的結(jié)核亞單位疫苗，檢測各類脂質(zhì)組分在人群中的免疫原性，并用小鼠BCG攻擊模型評價疫苗的保護(hù)效率。結(jié)果顯示，在LT70疫苗中加入脂質(zhì)組分能增加免疫效應(yīng)和抗結(jié)核保護(hù)效率，中間極性脂誘導(dǎo)的免疫保護(hù)強(qiáng)于其他脂質(zhì)組分，為進(jìn)一步研究脂質(zhì)對疫苗的作用提供參考。

目前，結(jié)核疫苗研究的出發(fā)點(diǎn)是識別主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類或Ⅱ類分子呈遞的肽類抗原而引發(fā)傳統(tǒng)的CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)[12]。脂質(zhì)成分的加入可彌補(bǔ)蛋白疫苗的不足，提高疫苗保護(hù)效率。這是因?yàn)镸HC非依賴途徑的非傳統(tǒng)T細(xì)胞識別非肽類抗原，也參與抗結(jié)核免疫反應(yīng)。此外，與MHC分子相比，CD1分子的多態(tài)性非常有限，將CD1限制性脂類抗原作為疫苗能被具有基因多樣性的不同人群的免疫細(xì)胞識別[13,14]。因此，脂類抗原應(yīng)與蛋白類抗原聯(lián)合使用來構(gòu)建疫苗。

研究表明，通過CD1呈遞的分枝桿菌脂質(zhì)抗原包括分枝菌酸(mycolic acid，MA)、葡萄糖單霉菌酸酯(glucose monomycolate，GMM)、脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)、脂甘露聚糖(lipomannan，LM)、磷脂酰肌醇甘露糖苷(phosphatidylinositol mannoside，PIM)等[6]。單一脂質(zhì)組分簡單，結(jié)構(gòu)明確，但缺乏足夠的免疫原性?；旌铣煞值囊粋€明顯優(yōu)勢是可激活保護(hù)性免疫反應(yīng)的多個分子，誘導(dǎo)更廣泛、更持久的生物活性。因此，本研究構(gòu)建混合脂質(zhì)組分疫苗來免疫小鼠，盡可能多地刺激脂質(zhì)特異性T細(xì)胞。

本研究分離了BCG脂類，通過2D-TLC檢測并結(jié)合文獻(xiàn)對總脂和各類脂質(zhì)組分進(jìn)行分析[9-11]。非極性脂質(zhì)組分可能主要為PDIM和三酰甘油；中間極性脂質(zhì)組分主要是糖脂，在總脂中占比較大，可能包含海藻糖單霉菌酸酯(trehalose monomycolate，TMM)、TDM、GMM、LAM、LM等脂質(zhì)；極性脂質(zhì)組分可能是含磷脂類，包含磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)、二磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol，DPG)、PIM等。

將BCG胞壁脂質(zhì)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌亞單位疫苗而研究脂質(zhì)成分保護(hù)效率的實(shí)驗(yàn)表明，總脂和占總脂比例較大的中間極性脂顯著降低小鼠肺荷菌數(shù)，增強(qiáng)LT70疫苗的保護(hù)性。這與中間極性脂質(zhì)組分誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫和天然免疫相關(guān)。中間極性脂的可能成分GMM、LAM與LM均可被CD1b限制性 T細(xì)胞識別，啟動適應(yīng)性免疫，促進(jìn)細(xì)菌清除[6]。例如，LAM激活的T細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，并分泌γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)，被認(rèn)為是結(jié)核保護(hù)性免疫中最重要的細(xì)胞因子[15]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是天然免疫相關(guān)分子。體外研究表明，LM通過巨噬細(xì)胞表面TLR2活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放Th1型炎癥因子白細(xì)胞介素12(interleukin 12，IL-12)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。PIM2是LM的前體，但沒有此作用，兩者的差異在于甘露糖核心基團(tuán)不同，表明糖基對維持LM活性的重要性[16]。中間極性脂富含具有糖基的糖脂，這些脂質(zhì)成分的共同作用導(dǎo)致總脂和中間極性脂質(zhì)組分增強(qiáng)LT70疫苗的保護(hù)性。Hiromatsu等用H37Ra的脂質(zhì)疫苗免疫豚鼠后的體外增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)實(shí)驗(yàn)也獲得相似結(jié)果，即脾細(xì)胞對總脂和糖脂反應(yīng)強(qiáng)烈，認(rèn)為這與豚鼠CD1b1和CD1c2分子有關(guān)[17]。

非極性脂無論在哪種策略中都沒有加強(qiáng)LT70蛋白疫苗的保護(hù)性，這可能與其中的PDIM有關(guān)。PDIM是分枝桿菌的毒力因子，致病機(jī)制還不清楚。有研究表明，PDIM 抑制T 細(xì)胞反應(yīng)，隱藏病原相關(guān)分子模式，阻止模式識別受體識別有效分子，誘導(dǎo)趨化因子CCL2釋放，招募并感染對分枝桿菌生長有利的巨噬細(xì)胞[18,19]。Collins等[20]用澳大利亞帚尾袋貂檢測PDIM敲除的牛分枝桿菌免疫保護(hù)性，發(fā)現(xiàn)缺陷株的保護(hù)效果強(qiáng)于野生株。Quintero-Macias等[21]在小鼠體內(nèi)也獲得相同結(jié)果，表明PDIM對結(jié)核免疫發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。

由于結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)寄生菌，一般認(rèn)為細(xì)胞免疫在清除結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)性免疫中發(fā)揮主要作用，抗體在這一過程中的作用還存在爭議。有研究表明，在接種過BCG的健康人和結(jié)核病患者體內(nèi)均可檢測到脂質(zhì)特異性抗體，但這些抗體與清除結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)性免疫沒有相關(guān)性[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，保護(hù)效應(yīng)最好的中間極性脂類抗體水平反而最低。

由于BCG與人結(jié)核分枝桿菌的脂質(zhì)大部分相同，所以本研究沒有進(jìn)行H37Rv攻毒實(shí)驗(yàn)，而是用BCG攻擊評價疫苗保護(hù)效率。已有研究表明，BCG攻擊模型可區(qū)分疫苗誘導(dǎo)的抗結(jié)核免疫力的強(qiáng)弱，評價候選疫苗的免疫保護(hù)效率[23,24]。當(dāng)然，BCG攻擊也存在缺陷，如無法評價少數(shù)具有種屬特異性的脂類。脂質(zhì)組分保護(hù)效率最終還需用結(jié)核分枝桿菌毒力株攻擊模型進(jìn)行評價，如何應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌脂質(zhì)成分使其發(fā)揮最有效的抗結(jié)核分枝桿菌作用值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]WHO.Global tuberculosis report 2014 [R/OL]. http://www.who.int/tb/publications/global_report/en.

[2]Girard MP, Fruth U, Kieny MP. A review of vaccine research and development: tuberculosis [J]. Vaccine, 2005, 23(50): 5725-5731.

[3]Yamagami H, Matsumoto T, Fujiwara N, Arakawa T, Kaneda K, Yano I, Kobayashi K. Trehalose 6,6′-dimycolate (cord factor) of Mycobacterium tuberculosis induces foreign-body- and hypersensitivity-type granulomas in mice [J]. Infect Immun, 2001, 69(2): 810-815.

[4]Saito R, Tanaka A, Sugiyama K, Azuma I, Yamamura Y. Adjuvant effect of cord factor, a mycobacterial lipid [J]. Infect Immun, 1976, 13(3): 776-781.

[5]van Dissel JT, Joosten SA, Hoff ST, Soonawala D, Prins C, Hokey DA, O’Dee DM, Graves A, Thierry-Carstensen B, Andreasen LV, Ruhwald M, de Visser AW, Agger EM, Ottenhoff TH, Kromann I, Andersen P. A novel liposomal adjuvant system,CAF01,promotes long-lived Mycobacterium tuberculosis-specific T-cell responses in human [J]. Vaccine, 2014, 32(52): 7098-7107.

[6]De Libero G, Mori L. The T-cell response to lipid antigens of Mycobacterium tuberculosis [J]. Front Immunol, 2014, 5: 219.

[7]Montamat-Sicotte DJ, Millington KA, Willcox CR, Hingley-Wilson S, Hackforth S, Innes J, Kon OM, Lammas DA, Minnikin DE, Besra GS, Willcox BE, Lalvani A. A mycolic acid-specific CD1-restricted T cell population contributes to acute and memory immune responses in human tuberculosis infection [J]. J Clin Invest, 2011, 121(6): 2493-2503.

[8]達(dá)澤蛟，胡麗娜，王秉翔，姜雯雯，傅林鋒，于紅娟, 雒或, 祝秉東.二甲基三十六烷基銨及卡介苗多糖核酸佐劑在結(jié)核亞單位疫苗加強(qiáng)BCG免疫中的效應(yīng)研究 [J].中華微生物與免疫學(xué)雜志，2010，30(6)：555-559.

[9]Dobson G, Minnikin DE, Minnikin SM, Parlett JH, Goodfellow M. Systematic analysis of complex Mycobacterial lipids [M]. In: Goodfellow M, Minnikin DE, eds. Chemical methods in bacterial systematics. London: Academic Prees, 1985 :237-266.

[10]Pirson C, Jones GJ, Steinbach S, Besra GS, Vordermeier HM. Differential effects of Mycobacterium bovis—derived polar and apolar lipid fractions on bovine innate immune cells [J]. Vet Res, 2012, 43: 54.

[11]Rosenkrands I, Agger EM, Olsen AW, Korsholm KS, Andersen CS, Jensen KT, Andersen P. Cationic liposomes containing mycobacterial lipids: a new powerful Th1 adjuvant system [J]. Infect Immun, 2005, 73(9): 5817-5826.

[12]Kaufmann SH, Hussey G, Lambert PH. New vaccines for tuberculosis [J]. Lancet, 2010, 375(9731): 2110-2119.

[13]Brigl M, Brenner MB. CD1: antigen presentation and T cell function [J]. Annu Rev Immunol, 2004, 22: 817-890.

[14]Felio K, Nguyen H, Dascher CC, Choi HJ, Li S, Zimmer MI, Colmone A, Moody DB, Brenner MB, Wang CR. CD1-restricted adaptive immune responses to Mycobacteria in human group 1 CD1 transgenic mice [J]. J Exp Med, 2009, 206(11): 2497-2509.

[15]Sieling PA, Chatterjee D, Porcelli SA, Prigozy TI, Mazzaccaro RJ, Soriano T, Bloom BR, Brenner MB, Kronenberg M, Brennan PJ. CD1-restricted T cell recognition of microbial lipoglycan antigens [J]. Science, 1995, 269(5221): 227-230.

[16]Dao DN, Kremer L, Guérardel Y, Molano A, Jacobs WR Jr, Porcelli SA, Briken V. Mycobacterium tuberculosis lipomannan induces apoptosis and interleukin-12 production in macrophages [J]. Infect Immun, 2004, 72(4): 2067-2074.

[17]Hiromatsu K, Dascher CC, LeClair KP, Sugita M, Furlong ST, Brenner MB, Porcelli SA. Induction of CD1-restricted immune responses in Guinea pigs by immunization with mycobacterial lipid antigens [J]. J Immunol, 2002, 169(1): 330-339.

[18]黃新華，王德成.分枝桿菌細(xì)胞壁脂質(zhì)PDIM致病機(jī)制研究進(jìn)展 [J].科技導(dǎo)報，2012，30(7)：63-67.

[19]Cambier CJ, Falkow S, Ramakrishnan L. Host evasion and exploitation schemes of Mycobacterium tuberculosis [J]. Cell, 2014, 159(7): 1497-1509.

[20]Collins DM, de Lisle GW, Aldwell FE, Buddle BM. A new attenuated Mycobacterium bovis vaccine protects brushtail possums (Trichosurus vulpecula) against experimental tuberculosis infection [J]. Vaccine, 2007, 25(24): 4659-4664.

[21]Quintero-Macias L, Santos-Mendoza T, Donis-Maturano L, Silva-Sanchez A, Aguilar D, Orozco H, Gicquel B, Estrada-Garcia I, Flores-Romo L, Hernandez-Pando R. T-cell responses and in vivo cytotoxicity in the target organ and the regional lymphoid tissue during airborne infection with the virulent Mycobacterium tuberculosis MT103 and its lipid mutant fadD26 [J]. Scand J Immunol, 2010, 71(1): 20-28.

[22]Brown RM, Cruz O, Brennan M, Gennaro ML, Schlesinger L, Skeiky YA, Hoft DF. Lipoarabinomannan-reactive human secretory immunoglobulin A responses induced by mucosal bacille Calmette-Guérin vaccination [J]. J Infect Dis, 2003, 187(3): 513-517.

[23]Matsumiya M, Satti I, Chomka A, Harris SA, Stockdale L, Meyer J, Fletcher HA, McShane H. Gene expression and cytokine profile correlate with mycobacterial growth in a human BCG challenge model [J]. J Infect Dis, 2015, 211(9): 1499-1509.

[24]Harris SA, Meyer J, Satti I, Marsay L, Poulton ID, Tanner R, Minassian AM, Fletcher HA, McShane H. Evaluation of a human BCG challenge model to assess antimycobacterial immunity induced by BCG and a candidate tuberculosis vaccine, MVA85A, alone and in combination [J]. J Infect Dis, 2014, 209(8): 1259-1268.

·論著·

Corresponding authors. ZHU Bing-Dong, E-mail: bdzhu@lzu.edu.cn; TAN Ji-Ying, E-mail: tanjy@lzu.edu.cn

Mycobacteriumlipid components enhanced the protective efficacy of tuberculosis subunit vaccine

HE Shan-Shan1,2，HE Juan-Juan1,3，LIU Xun1,3，KONG Xiang-Xi1,2，TAN Ji-Ying1,2，ZHU Bing-Dong1,3

1. Lanzhou Center for Tuberculosis Research & Gansu Provincial Key Laboratory of Evidence-Based Medicine and Clinical Translation, Institute of Pathogenic Biology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 2. Institute of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 3. Institute of Pathogenic Biology, School of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

Abstract:Mycobacterium cell wall is rich in lipid components, and some of the lipids may have antigenicity or play an important role in the process of immune regulation. To investigate the effects of the lipids from Mycobacterium cell wall in tuberculosis subunit vaccine, the total lipids were extracted from bacillus Calmette-Guérin (BCG) cell wall and separated by silica column into three different groups: the nonpolar lipids, the intermediate polar lipids and the polar lipids. The lipids were used as the antigen to screen the immune responses in general population. Furthermore, the total lipids and the three groups of lipids were mixed with fusion protein LT70(ESAT6-Ag85B-MPT64<190-198>-Mtb8.4-Rv2626c) in adjuvant of N, N′-dimethyl-N, N′-dioctadecylammonium(DDA) and Poly (I∶C) respectively. The subunit vaccines containing lipids were used to immunize mice and the protective efficacy were evaluated by challenging with BCG. The results showed that the level of lipid-specific IgG in tuberculosis patients was significantly higher than that in healthy people (P<0.05). For the protective efficacy, the number of bacteria harbored in mice immunized with LT70-total lipids significantly declined compared with BCG vaccination (P<0.05). In BCG prime-subunit vaccine boost strategy, LT70-total lipids and LT70-intermediate polar lipids vaccines resulted in significantly low bacterial number than BCG (P<0.01) and LT70 (P<0.05). In conclusion, lipids from Mycobacterium cell wall have high immunogenicity; combination of them, especially the total lipids or intermediate polar lipids, with fusion protein antigen can enhance the antimycobacterial protective efficacy of subunit vaccine.

Key words:Mycobacterium tuberculosis；Subunit vaccine；Bacillus Calmette-Guérin；Cell wall；Lipid

收稿日期：(2015-02-13)

通信作者：祝秉東，譚繼英

基金項(xiàng)目：“十二五”國家科技重大專項(xiàng)(2012ZX10003-008-006)