器官保存液中腺苷和別嘌呤醇的含量測定

李天媛，鄒麗敏，陳建斌，李博，張偉（1.南京醫(yī)科大學附屬南京兒童醫(yī)院，南京10008；.中國藥科大學，南京 10009；.江蘇省生產(chǎn)力促進中心，南京 1004）

器官移植為21世紀醫(yī)學發(fā)展的主要方向之一，是治療終末期器官衰竭唯一有效的根治手段。器官保存是器官移植學的基石，器官保存的根本目的是最大限度減少缺血對離體器官造成的各種損傷，使離體器官保持有效的活力，以便完成運送、配型和手術，使移植器官在手術后迅速恢復功能[1]。器官保存液是器官保存研究中最為重要的問題之一，為了提高患者長期存活率、緩解供器官短缺的矛盾，器官保存液必須能夠在一定的時間內最大限度地降低離體器官的缺血性損傷。

再灌注損傷主要是氧自由基大量產(chǎn)生的結果，阻止自由基產(chǎn)生可以防止缺血/再灌注損傷[2]。別嘌呤醇是一種黃嘌呤氧化酶的特異性抑制劑，能競爭性地抑制黃嘌呤氧化酶，減少再灌注期氧自由基的產(chǎn)生。腺苷參與心肌能量代謝，同時還參與擴張冠脈血管、增加血流量。因此，別嘌呤醇和腺苷兩者均為細胞保存液中的重要成分，是保持離體器官活性的重要物質[3～5]。筆者據(jù)此自制了器官保存液，雖然其配比簡單，但也可以達到維持細胞周圍內環(huán)境相對穩(wěn)定的效果，前期試驗表明低溫保存狀態(tài)下可保存16 h。為考察其質量，筆者建立了可同時測定細胞保存液中別嘌呤醇和腺苷含量的高效液相色譜（HPLC）法，并對該方法進行了驗證。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10ATHPLC儀、SPD-10A紫外-可見光檢測器（日本島津公司）；智達N2000色譜工作站（浙江大學）。

1.2 試藥

腺苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110879-200202，純度：99.9%）；別嘌呤醇對照品（江蘇方強制藥廠，批號：20111023，純度：99.5%）；樣品：器官保存液（南京醫(yī)科大學附屬南京兒童醫(yī)院，處方：腺苷1.5 g，別嘌呤醇0.15 g，混勻后，加水溶解并稀釋至1 000m L，即得）；甲醇為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Lichrospher C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-50mmol·L－1磷酸二氫鉀溶液（20∶80），流速：1.0m L·min－1；檢測波長：260 nm；柱溫：室溫；進樣量：20μL。理論板數(shù)按腺苷和別嘌呤醇峰計算不低于1 200。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液。精密稱取腺苷對照品30mg，置于10m L量瓶中，甲醇溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，即得腺苷對照品貯備液。精密稱取別嘌呤醇對照品約30mg，置于100m L量瓶中，甲醇溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，即得別嘌呤醇對照品貯備液。分別精密移取2種對照品貯備液各0.5m L，置于10m L量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液。精密移取器官保存液樣品1m L，置于10 m L量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

2.3 專屬性試驗

取樣品溶液5份，分別加入0.2mol·L－1NaOH溶液、1 mol·L－1H2SO4溶液、5%雙氧水溶液破壞3 h，在100℃加熱1 h和5 000 lx強光照射3 h，在各條件下破壞后測定。結果，腺苷和別嘌呤醇降解產(chǎn)物均能與二者較好地分離，詳見圖1A～E。另取輔料（即水）進樣測定，結果基線平穩(wěn)，表明其對主成分測定無干擾，證明該條件可以用于腺苷和別嘌呤醇的含量測定，詳見圖1F。對照品色譜見圖1G。

圖1 高效液相色譜圖A.堿破壞后樣品；B.酸破壞后樣品；C.氧化破壞后樣品；D.熱破壞后樣品；E.光破壞后樣品；F.水；G.對照品；1.腺苷；2.別嘌呤醇Fig 1 HPLC chrom atogram sA.samples treated with alkali；B.samples treated with acid；C.samples treated with oxidation；D.samples treated with heat；E.samples treated with highlight；F.water；G.substance control；1.adenosine；2.allopurinol

2.4 線性關系考察

分別精密量取腺苷和別嘌呤醇對照品貯備液各5.0m L，置于50m L量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取該溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0m L，置于10m L量瓶中，加流動相定量稀釋成系列濃度，進樣測定。以濃度（c）與峰面積（A）進行回歸分析，得腺苷、別嘌呤醇的回歸方程分別為：A＝3.116×104c+9.081×103（r＝0.999 9）、A＝2.775×104c－2.425×103（r＝0.999 9），表明二者檢測濃度線性范圍分別為0.03～0.3、0.003～0.03mg·m L－1。

2.5 定量限和檢測限試驗

取標準曲線最低濃度點溶液（腺苷、別嘌呤醇濃度分別為0.03、0.003mg·m L－1），用流動相稀釋制成一系列濃度的溶液，搖勻，進樣測定。經(jīng)計算得腺苷的定量限和檢測限分別為7.5（S/N≥10）、3.7 ng·m L－1（S/N≥3）；別嘌呤醇的定量限和檢測限分別為7.6（S/N≥10）、3.8 ng·m L－1（S/N≥3）。

2.6 回收率試驗

分別精密取腺苷對照品、別嘌呤醇對照品及水，混勻并制成含腺苷和別嘌呤醇80%、100%、120%處方量的模擬制劑。分別取該模擬制劑按照“2.9”項下方法處理并測定，計算低、中、高濃度回收率。結果腺苷和別嘌呤醇的平均回收率分別為99.14%和99.11%，表明本方法回收率良好，詳見表1。

表1 回收率試驗結果（n＝3）Tab 1 Resultsof recovery test（n＝3）

2.7 穩(wěn)定性試驗

取樣品溶液10m L，室溫下避光放置，分別在0、0.5、1、2、4、8、16 h取1m L，經(jīng)處理后進樣測定，結果16 h內腺苷以及別嘌呤醇峰面積沒有明顯變化，RSD均為0.55%，表明器官保存液含量測定溶液避光放置在16 h內是穩(wěn)定的。

2.8 精密度試驗

2.8.1 進樣精密度。取腺苷和別嘌呤醇對照品溶液各重復進樣6次，結果RSD分別為0.63%、0.58%，表明進樣精密度良好。

2.8.2 重復性。取同1批樣品同日內共分析6次，結果腺苷和別嘌呤醇RSD分別為0.46%、0.54%，表明本方法重復性良好。

2.8.3 中間精密度。3位操作者分別在不同時間、采用不同儀器測定同1批樣品的含量，計算含量，結果腺苷平均含量為96.2%，RSD＝0.44%；別嘌呤醇平均含量為91.8%，RSD＝0.55%。表明方法中間精密度良好。

2.9 含量測定

精密移取3批器官保存液樣品1m L，置于10m L量瓶中，甲醇稀釋至刻度，進樣測定，外標法計算含量。結果，腺苷含量分別為98.3%、96.2%、98.0%，別嘌呤醇含量分別為96.7%、95.8%、97.2%。

3 討論

（1）波長的選擇。在“2.1”項流動相條件下，腺苷和別嘌呤醇的最大吸收波長分別為280、260 nm。因樣品中別嘌呤醇含量較低，故選擇260 nm作為檢測波長。在該波長處，腺苷和別嘌呤醇都具有較強的吸收，有良好的靈敏度，符合試驗的要求。

（2）流動相的選擇。參考文獻[6]條件并通過試驗調整優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)甲醇-50mmol·L－1磷酸二氫鉀比例為20∶80時，腺苷和別嘌呤醇均能得到較好分離，且降解產(chǎn)物無干擾，最終確定了此流動相。

本文建立的分析方法準確可靠、簡便易行，可用于器官保存液中腺苷和別嘌呤醇的含量測定。

[1]朱有華，張 雷.器官保存研究的新進展[J].實用醫(yī)學進修雜志，2006，34（1）：12.

[2]覃 珍，陳 超.別嘌醇研究的新進展[J].中國藥理學通報，2003，19（11）：1 220.

[3]鄭軍華，閔志廉，李玉莉，等.自制長征-1號多器官保存液的動物實驗和部分臨床應用研究[J].第二軍醫(yī)大學學報，1999，20（6）：341.

[4]段桂新.器官保存的研究進展[J].醫(yī)學研究生學報，2006，19（8）：745.

[5]朱水波，殷桂林，孫宗全，等.腺苷預處理保存供心的實驗研究[J].臨床外科雜志，2003，8（11）：4.

[6]樓麗君，周靜安.反相高效液相色譜法測定靈芝及其制劑中腺苷的含量[J].中醫(yī)藥學刊，2006，24（12）：2 332.