基于創(chuàng)新藥物研究的心肌缺血/心肌梗死生物模型Δ

王恒，沈祥春，余躍生，楊紅宇，吉楊丹（.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州都勻558003；.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004）

20世紀(jì)初期，全球心血管病死亡率僅占總死亡率的10%以下，占發(fā)達(dá)國家總死亡率的近50%、發(fā)展中國家的25%。目前我國每年約有300萬人死于心血管病，預(yù)計到2020年，因心血管疾病致殘的人數(shù)將到達(dá)2 500萬[1]。隨著人們的生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化，心血管疾病患者呈現(xiàn)出年輕化的趨勢，這一現(xiàn)狀已引起世界各國的高度重視，因此研制有效預(yù)防與治療心血管疾病的創(chuàng)新藥物成為當(dāng)務(wù)之急。心血管系統(tǒng)疾患尤以心肌缺血及心肌梗死成為近年來創(chuàng)新藥物研究的熱點。而創(chuàng)新藥物研究的關(guān)鍵是建立基于臨床特點的、有效反映藥物療效的生物模型。筆者通過查閱2001－2011年中國知網(wǎng)、萬方、維普及PubMed、HighWire Press、EBSCO-ASP等數(shù)據(jù)庫的相關(guān)文獻(xiàn)，對實驗動物的選擇和方法進(jìn)行歸納總結(jié)，旨在為心肌缺血/心肌梗死創(chuàng)新藥物評價提供合理可靠的生物模型。

1 整體實驗動物模型

根據(jù)多年來對心肌缺血/心肌梗死實驗動物模型的研究，目前傳統(tǒng)復(fù)制心肌缺血/心肌梗死動物模型所選用的動物大多為哺乳動物，有狗、兔、小牛、豚鼠、大鼠等。由于豬冠狀循環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)酷似人類，故近年來提倡用家豬或小豬復(fù)制心肌缺血/心肌梗死的模型[2，3]。

1.1 冠狀動脈結(jié)扎法

冠狀動脈結(jié)扎法是制作心肌缺血模型最早、且至今還普遍使用的方法[4]。其原理為：結(jié)扎冠狀動脈后血流動力學(xué)和心肌代謝的改變與冠心病患者嚴(yán)重心肌缺血及心肌梗死時有相似之處，且梗死發(fā)生快、缺血的范圍大致固定，可以進(jìn)行血流動力學(xué)監(jiān)測、心電圖J點標(biāo)測、組織染色檢查和血清酶學(xué)等綜合指標(biāo)測定。鑒于結(jié)扎冠狀動脈主干死亡率高，所以目前結(jié)扎部位主要選用左旋冠狀動脈、冠狀動脈前降支；亦有多處結(jié)扎的方法，即同時結(jié)扎幾處的冠狀動脈分支，以形成一個梗死區(qū)域。經(jīng)驗證明，結(jié)扎的冠狀動脈因其分布的心肌范圍和該區(qū)內(nèi)是否有其他冠狀動脈決定著心肌梗死的面積。結(jié)扎狗、兔、貓、大鼠等動物的左冠狀動脈前降支均可成功造模，因此結(jié)扎冠狀動脈引起的急性或亞急性梗死疾病模型可用于藥物效應(yīng)研究。結(jié)扎狗、家兔、大鼠建模舉例如下。

（1）結(jié)扎狗冠狀動脈左前降支建立急性心肌梗死模型。有文獻(xiàn)[5]選用成年健康雜種犬，♀♂不限，體重8.5～13.1 kg。用3%戊巴比妥鈉（30mg·kg－1）麻醉實驗犬，行氣管插管，呼噯機(jī)輔助呼吸，開胸后于犬左冠狀動脈前降支的第2對角支分支處以帶線縫針進(jìn)行縫扎。但狗的冠狀血管結(jié)構(gòu)與人相比有較大差異，尤其是犬冠狀動脈變異多、側(cè)支吻合豐富、室間隔動脈特別發(fā)達(dá)等，故不利于梗死功能評價。

（2）結(jié)扎家兔冠狀動脈前降支建立急性心肌梗死模型。有文獻(xiàn)[6]選用體重2 kg以上的健康家兔，全身麻醉，仰位固定，除毛；沿胸骨中線切開皮膚、暴露胸骨，沿胸骨左緣剪斷1～3根肋軟骨；用小開胸器輕輕撐開胸腔切口，可見心包及搏動心臟；提起心包膜正中，用眼科剪將心包膜前部剪開，用止血鉗將左心耳輕輕提起，用持針器持小彎針在冠狀動脈前降支根部（較深部）穿一線結(jié)扎。為減少側(cè)支循環(huán)、增大心肌梗死面積，便于觀察藥物療效，可在結(jié)扎線下約0.5 cm處再穿一線結(jié)扎。也可結(jié)扎左室支造成心肌梗死，但結(jié)扎位置不宜過高。如果進(jìn)行急性實驗，即可進(jìn)行給藥觀察；如果進(jìn)行亞急性實驗，結(jié)扎后即關(guān)閉胸腔，但每天應(yīng)注射青霉素或鏈霉素以防止感染[7]。

兔破壞胸膜結(jié)扎冠狀動脈，方法簡便：結(jié)扎前降支根部，并進(jìn)行雙重結(jié)扎阻斷，可減少側(cè)支循環(huán)的形成。此法產(chǎn)生的心肌梗死在3 d內(nèi)較穩(wěn)定，3 d后有自發(fā)緩解的趨勢，實驗時要注意。

（3）結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支建立急性心肌梗死模型。有文獻(xiàn)[7]選用250～300 g的SD♂大鼠。淺麻醉后，背位固定；用大半個橡皮球（大小正好套住大鼠頭頸部）連接到人工呼吸機(jī)，胸部去毛、消毒、沿左筋骨中線縱行切開皮膚約2 cm，在第4或第5肋間鈍性分離肌層，打開胸腔，剪開心包，輕壓右側(cè)胸部擠出心臟；在動脈圓錐與左心耳之間冠狀脈處結(jié)扎左冠狀動脈后，把心臟放回胸腔；迅速縫合胸壁，停止人工呼吸。如果進(jìn)行急性實驗，即可進(jìn)行給藥觀察；如果進(jìn)行亞急性實驗，每天應(yīng)注射青霉素或鏈霉素以防止感染。

1.2 藥物誘導(dǎo)法

（1）藥物增加心肌氧消耗。心肌缺氧是由心肌氧的供需平衡失調(diào)造成的，心肌需氧增加，供不應(yīng)求，也是出現(xiàn)心肌缺血甚至壞死的重要原因。擬交感神經(jīng)藥物可使心肌氧消耗增加，大劑量用藥會引起動物心肌壞死。引起心肌缺血性損傷常用的藥物有異丙腎上腺素、腎上腺素和去甲腎上腺素。從大動物狗到小動物貓、兔、豚鼠、大鼠及小鼠均可用，以應(yīng)用大鼠為最多。最常使用的藥物為異丙腎上腺素，采用大鼠皮下注射50mg·kg－1或?qū)⑺幬锛尤?00m L氯化鈉注射液中從家兔耳靜脈勻速（4 h）滴入，可分別給藥10、20、30mg·kg－1，或直接將藥物注入腹腔，均可復(fù)制模型[8]。

（2）藥物引起冠狀血管痙攣。常用藥物是垂體后葉素，其使冠狀動脈收縮，同時也使外周血管收縮、阻力增加、血壓升高，增加后負(fù)荷而產(chǎn)生心肌缺血。其可直接作用于不同動物的離體冠狀動脈條使之收縮，如使離體兔、貓心的冠狀動脈收縮。整體動物（免、豚鼠和大鼠等）靜脈注射時，出現(xiàn)典型的缺血性心電圖改變，如麻醉狗后靜脈注射垂體后葉素，血壓急劇升高而血流量明顯降低。引起小動物心電圖改變的垂體后葉素劑量一般為0.5～1.5 u·kg－1，5～15 s內(nèi)靜脈注入。狗的用量較小，靜脈注射0.3 u·kg－1即引起明顯的冠狀動脈痙攣[9]。由于該方法簡單、重復(fù)性好、不需特殊設(shè)備，因而廣泛用于抗心絞痛藥物篩選。

1.3 冠狀動脈氣囊法

通過放置在冠狀血管內(nèi)或血管外的可膨脹氣囊（或水囊）阻塞或壓迫血管而引起的冠狀動脈閉塞[10]。

（1）冠狀動脈內(nèi)氣囊法。冠狀動脈內(nèi)氣囊法是采用特制的雙腔氣囊導(dǎo)管，在X射線監(jiān)視下經(jīng)狗的頸總動脈插入到左冠狀動脈前降支或旋支的合適部位，注入50%的液體使氣囊膨脹，每天應(yīng)注射青霉素和鏈霉素以防止感染并控制所在部位氣囊膨脹的程度。在雙腔氣囊導(dǎo)管的另一端則分別連接注射器，從外導(dǎo)管注入氣體以膨脹氣囊和經(jīng)內(nèi)導(dǎo)管向缺血區(qū)注射藥物或抽取血樣品，并可測定返回血流和返回壓力。如在內(nèi)導(dǎo)管內(nèi)裝入鉑金電極還可測定缺血區(qū)冠狀動脈內(nèi)心電圖。該法不需開胸，避免了因開胸對血流動力和心肌代謝的影響；可完全或部分閉塞，也可突然或逐漸以及反復(fù)閉塞。

（2）冠狀動脈外氣囊法。冠狀動脈外氣囊法是在將動物麻醉開胸后，分離出左冠狀動脈1 cm左右（大多數(shù)是前降支）并放入壓迫器內(nèi)。當(dāng)氣囊膨脹時，壓迫血管而阻斷血流，短期阻斷產(chǎn)生心肌缺血，長期阻斷則產(chǎn)生心肌梗死。同一只動物，可在清醒狀態(tài)下反復(fù)阻斷冠狀動脈以引起心肌缺血。如在壓迫器的近心端冠狀動脈上放置1個電磁流量計換能器，則可監(jiān)測閉胸情況下部分閉塞冠狀動脈的程度。因此，該法是藥理研究中常用的方法之一。

1.4 電刺激法

犬急性心肌梗死模型的建立：肌肉注射氯胺酮100～200 mg麻醉犬、注射用維庫溴銨0.1mg松弛犬氣管平滑肌，氣管插管后連接呼吸機(jī)并予心電監(jiān)護(hù)；沿胸骨左緣第3～4肋骨開胸，逐層打開至心包膜，制作心包吊床，清晰暴露左冠狀動脈前降支血管；距離前降支開口約1.5 cm處將正、負(fù)刺激電極間隔1 min置前降支血管外膜，微電流刺激儀刺激犬冠狀動脈血管外膜，電流由小至大逐漸加強(qiáng)，刺激血管外膜15～20 cm，間隔10min。心電監(jiān)護(hù)顯示心電穩(wěn)定后，同部位再次予電流刺激20min至血管外膜顏色加深為止。觀察無嚴(yán)重心律失常及出血等，逐層縫合關(guān)閉胸腔，置胸腔引流水封瓶[11]。

2 離體心臟模型

近年來，在心肌缺血的研究中，離體心臟灌流技術(shù)越來越多被采用。正常離體心肌在缺氧時再給氧可加劇心肌組織缺血性損傷，與臨床冠狀動脈搭橋術(shù)、溶栓術(shù)及冠狀動脈痙攣等灌注所致心肌損傷相似。

一般用朗根多夫（Langendorff）法對離體豬、兔和大鼠心臟進(jìn)行灌流，以通Krebs-henseleit液灌流或結(jié)扎心臟的冠狀動脈，引起全心或局部心肌缺氧，觀察整個心臟或局部心肌的冠狀動脈血流、心收縮力、心外膜電圖以及冠狀動脈流出液中乳酸、乳酸脫氫酶、磷酸肌酸激酶活性和鉀離子、環(huán)磷酸腺苷含量以了解心肌缺血程度和心肌缺血時的功能和代謝；并可直接測定心肌內(nèi)上述指標(biāo)的改變來評價藥物對冠狀動脈血管、心臟功能和心肌代謝的直接作用[12]。

在整體條件下心臟的能量來源主要為血液中的脂肪酸，而離體心肌缺氧/再給氧損傷模型能量來源則為灌流液中的葡萄糖，且離體心臟失去整體條件下的神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，故不可視為此模型完全等同于在體心臟。離體心臟維持不久，故須在一定時間內(nèi)完成，此亦受到限制。

3 體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞

3.1 過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)法建立心肌損傷模型

取生長良好的細(xì)胞隨機(jī)分組，同時加入藥物4 h后再加H2O2（終濃度為0.5mmol·L－1）刺激細(xì)胞4 h，即可造模成功[13]。

3.2 氰化鈉復(fù)制心肌細(xì)胞損傷模型

當(dāng)氰離子與氧化型細(xì)胞色素氧化酶中的三價鐵結(jié)合后，由于二者的結(jié)合力較強(qiáng)，阻止氧化酶中三價鐵的還原，即阻斷了氧化過程中的電子傳遞，組織細(xì)胞不能利用組織液中的氧（等同于乏氧性缺氧或缺血性缺氧時的組織液中缺氧），細(xì)胞處于內(nèi)窒息狀態(tài)。因此，氰化鈉引起的細(xì)胞缺氧模型相當(dāng)于各種缺氧的終末階段，即細(xì)胞對氧的利用障礙[14]。如，取生長良好的細(xì)胞隨機(jī)分組，給予1μmol·m L－1的氰化鈉作用24 h可復(fù)制心肌細(xì)胞損傷[15]。

3.3 兒茶酚胺誘導(dǎo)心肌損傷模型

兒茶酚胺（Catecholamines，Cas）作為誘導(dǎo)心肌肥大的神經(jīng)體液刺激因素之一，具有通過腎上腺素受體（Adrenergic receptor，AR）直接促進(jìn)心肌肥大效應(yīng)及肌球蛋白基因表達(dá)的作用。異丙腎上腺素（ISO）和腎上腺素（NE）是經(jīng)典的體外誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥厚致心肌損傷的因素[16]。如，常規(guī)培養(yǎng)心肌細(xì)胞2 d后，換液，為了減少血清中的成分對實驗結(jié)果的影響，換液時更換含小牛血清體積分?jǐn)?shù)為0.000 4的培養(yǎng)基，并采用20μmol·L－1的ISO復(fù)制心肌損傷模型[17]。

心肌細(xì)胞培養(yǎng)能夠排除神經(jīng)體液、冠狀動脈血管差異等因素影響，所有的細(xì)胞處于均一的環(huán)境中，故實驗可靠。但是這個方法是缺氧而不是缺血情況，且缺氧細(xì)胞生成的代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)基中積累升高，故與整體動物心肌組織缺血時的環(huán)境及代謝有所差異。

4 結(jié)語

在體心肌梗死模型中結(jié)扎冠狀動脈是各種模型中最接近冠心病患者嚴(yán)重缺血及梗死的病理狀態(tài)，其他各種模型亦各有優(yōu)缺點。所以，在創(chuàng)新藥物研究過程中，應(yīng)根據(jù)不同階段的需要，選擇合適的模型，以提高研究效率、降低研究風(fēng)險。

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