3種齊墩果酸納米粒對(duì)小鼠HCa-F細(xì)胞體外抑制作用比較Δ

陳華，徐紅，安磊，鮑旭，高萌，梅林，田燕#（1.大連兒童醫(yī)院藥劑科，遼寧大連116001；.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧大連 116044）

齊墩果酸（OA）是天然五環(huán)三萜類化合物，具有消炎、抗腫瘤和抗高血脂等多方面的藥理作用[1]，目前市售劑型主要有片劑、膠囊劑等。但是由于OA脂溶性較強(qiáng)，在胃腸道的溶出低、吸收差，導(dǎo)致其生物利用度低，不能被人體很好地吸收利用，故限制了其藥理作用的充分發(fā)揮。

納米粒（NPs）用作藥物載體具有粒度小、比表面積大、活性中心多、吸附能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)靜脈注射后，在體內(nèi)的分布首先取決于微粒的粒徑大小。通常粒徑為50～100 nm的微粒系統(tǒng)可以進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中；粒徑為100～200 nm的微粒很快被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞從血液中清除，最終可到達(dá)肝枯否細(xì)胞（Kupffer cell）溶酶體中；同時(shí)表面帶負(fù)電荷的微粒易被肝臟攝取[2]。因此控制NPs的粒徑及表面帶電性，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)肝臟的主動(dòng)靶向作用。

本試驗(yàn)采用水溶性四氮唑（WST-1）法比較大連醫(yī)科大學(xué)自制的3種OA-NPs，即OA/乳酸羥基乙酸共聚物納米粒（OAPLGA-NPs，簡(jiǎn)稱OPN）[3]、OA/乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素E納米粒（OA-PLGA-TPGS-NPs，簡(jiǎn)稱OPTN）[4]和OA/聚己內(nèi)酯-聚乳酸-水溶性維生素E納米粒（OA-PCL-PLA-TPGS-NPs，簡(jiǎn)稱OPPTN），對(duì)小鼠腹水型肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移細(xì)胞株（HCa-F）的體外抑制作用，為OA-NPs在體內(nèi)對(duì)肝臟的主動(dòng)靶向性、體內(nèi)抑瘤率等試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，以使OA能更好地發(fā)揮其保肝和抗肝癌等作用，并為制備OA新制劑提供試驗(yàn)依據(jù)，使其具有更大的開發(fā)和應(yīng)用前景。

1 儀器與材料

1.1 儀器

354型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo電子公司）；FA1104型萬分之一電子天平（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試藥

OPN（批號(hào)：20100908，規(guī)格：260mg·g－1）、OPTN（批號(hào)：20100908，規(guī)格：280mg·g－1）、OPPTN（批號(hào)：20100908，規(guī)格：270mg·g－1）、OA溶液劑（簡(jiǎn)稱OS，溶媒：聚乙二醇400，批號(hào)：20100912，濃度：800μg·m L－1）均由大連醫(yī)科大學(xué)藥劑學(xué)教研室自制；氟尿嘧啶注射液（深圳三順制藥有限公司，批號(hào)：20110320，規(guī)格：25mg·m L－1）；WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（德國(guó)羅氏公司，批號(hào)：M1680）；DMEM培養(yǎng)基（上海億欣生物科技有限公司，批號(hào)：9008-97-3）；其余輔料均為藥用規(guī)格，所用試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞株

HCa-F，由大連醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)教研室提供，培養(yǎng)條件：pH 7.2的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2 方法[5]與結(jié)果

2.1 細(xì)胞傳代

常規(guī)方法復(fù)蘇HCa-F凍存細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)活瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)。調(diào)整活瘤細(xì)胞濃度為3×107個(gè)/m L。將0.2m L細(xì)胞懸液接種于小鼠腹腔，6 d后腹水完全形成，取腹水，將活瘤細(xì)胞濃度調(diào)整為2×107個(gè)/m L，為體外試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

2.2 細(xì)胞分組[5]

試驗(yàn)分為8組，分別為陽(yáng)性對(duì)照組：接種細(xì)胞后加入10μL氟尿嘧啶注射液（終濃度為2.5、10、20μg·m L－1）；OPN、OPTN、OPPTN組：接種細(xì)胞后分別加入10μL對(duì)應(yīng)的OPN、OPTN、OPPTN的混懸液（OA終濃度分別為2.5、10、20μg·m L－1）；OS組：接種細(xì)胞后加入10μL OS（OA終濃度分別為2.5、10、20 μg·m L－1）；空白NPs組：接種細(xì)胞后加入10μL空白NPs混懸液（不含OA，材料濃度同OS組）；陰性對(duì)照組：接種細(xì)胞后加入10μL培養(yǎng)液；空白組：不加任何物質(zhì)，直接將96孔板在酶標(biāo)IR＝[1－（A試驗(yàn)組－A空白組）（/A陰性對(duì)照組－A空白組）]×100%。用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)采用±s表示，多組資料采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。測(cè)得空白組A＝0.046±0.011（n＝6），陰性對(duì)照組A＝0.063±0.013（n＝6），試驗(yàn)組培養(yǎng)不同時(shí)間后對(duì)HCa-F細(xì)胞的IR及其方程（將同一培養(yǎng)時(shí)間的3個(gè)藥物濃度分別與對(duì)應(yīng)的IR進(jìn)行線性回歸，得到不同培養(yǎng)時(shí)間的IR方程）見表1。儀上測(cè)定。每組6個(gè)復(fù)孔，除陰性對(duì)照組和空白組外其余各組為試驗(yàn)組。

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）

用含10%胎牛血清、100 u·m L－1青霉素、100μg·m L－1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μL。按“2.2”項(xiàng)下分組分別加入相應(yīng)藥物，每孔10μL，在飽和濕度條件下，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入計(jì)算量的WST-1溶液10μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。選擇450 nm波長(zhǎng)在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的吸光度（A）值，參比波長(zhǎng)為600 nm，記錄結(jié)果，分別計(jì)算其IR，

表1 試驗(yàn)組培養(yǎng)不同時(shí)間后對(duì)HCa-F細(xì)胞的IR值及其方程（±s，n＝6）Tab 1 Absorbance and IR equation of HCa-F after different incubation duration（±s，n＝6）

表1 試驗(yàn)組培養(yǎng)不同時(shí)間后對(duì)HCa-F細(xì)胞的IR值及其方程（±s，n＝6）Tab 1 Absorbance and IR equation of HCa-F after different incubation duration（±s，n＝6）

組別空白NPs組陽(yáng)性對(duì)照組濃度/μg·mL－1 IR/%OPN組2.5 10 20 2.5 10 20 IR方程OPTN組2.5 10 20 IR方程OPPTN組2.5 10 20 IR方程OS組2.5 10 20 24h 2.2±0.3 29.3±0.8 47.5±0.9 57.6±1.4 21.7±0.9 28.9±0.7 39.6±0.9 IR=1.0254c+18.958（r=0.9991）35.8±1.1 57.6±1.2 68.7±1.3 IR=1.8384c+34.118（r=0.9299）32.9±1.0 51.6±1.1 60.7±1.2 IR=1.5519c+31.588（r=0.9241）12.9±0.6 17.6±0.7 23.8±0.9 48h 4.9±0.4 30.2±0.8 49.8±1.0 60.3±1.1 35.8±1.0 56.3±1.1 70.6±1.4 IR=1.9584c+33.018（r=0.9662）50.7±1.2 69.6±1.3 85.6±1.3 IR=1.9730c+47.259（r=0.9831）43.2±1.1 64.4±1.0 78.6±1.2 IR=1.8930c+39.559（r=0.9901）15.8±0.8 21.3±0.7 28.7±0.6 72h 6.2±0.6 31.5±0.9 50.3±0.8 60.6±0.9 42.9±0.9 63.6±1.1 75.4±1.3 IR=1.8443c+40.786（r=0.9479）54.3±1.2 79.2±1.4 92.6±1.5 IR=2.3211c+49.122（r=0.9991）50.8±0.8 71.7±1.3 83.9±1.2 IR=2.0876c+43.851（r=0.9657）16.7±0.8 22.5±1.0 29.4±0.9

由表1結(jié)果表明，（1）空白NPs組培養(yǎng)72 h時(shí)的IR＝（6.2±0.6）%，計(jì)算可知其中細(xì)胞的存活率為93.8%，表明空白NPs沒有明顯的細(xì)胞毒性。（2）與同組中相同時(shí)間2.5μg·m L－1比較，OPN、OPTN、OPPTN組OA濃度為20μg·m L－1時(shí)IR均明顯升高（P均＜0.01），表明隨OA濃度的增加，OPN、OPTN、OPPTN的體外抗腫瘤活性逐漸增強(qiáng)，即其抗腫瘤活性具有濃度依賴性。（3）與陽(yáng)性對(duì)照組相同濃度比較，72 h時(shí)OPN、OPTN、OPPTN組OA濃度為10、20μg·m L－1時(shí)IR均明顯升高（P均＜0.01），OA濃度為2.5μg·m L－1時(shí)IR無明顯變化，表明OPN、OPTN和OPPTN具有良好的緩釋作用以及較高的體外抗腫瘤活性。（4）與陽(yáng)性對(duì)照組相同濃度比較，OS組3個(gè)濃度培養(yǎng)24、48、72 h的IR均無明顯變化（P均＞0.05），表明OS組和陽(yáng)性對(duì)照組中的藥物釋放快，在培養(yǎng)液中很快達(dá)到最大釋放量，而發(fā)揮其抗腫瘤的作用，故不同時(shí)間對(duì)HCa-F細(xì)胞的IR變化較小。（5）與同組中相同濃度24 h比較，OPN、OPTN、OPPTN組3個(gè)濃度培養(yǎng)72 h的IR均明顯升高（P均＜ 0.01），表明隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OPN、OPTN、OPPTN的體外抗腫瘤活性逐漸增強(qiáng)，即其抗腫瘤活性具有時(shí)間依賴性。

2.4 半數(shù)抑制濃度（IC50）

IC50是在指定時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞被殺死一半時(shí)所需要的藥物濃度，是體外藥物制劑治療作用的定量評(píng)價(jià)方法。根據(jù)OPN、OPTN、OPPTN組的IR方程，將IR＝50%分別代入不同培養(yǎng)時(shí)間的IR方程，計(jì)算其IC50。不同濃度OPN、OPTN、OPPTN組培養(yǎng)不同時(shí)間后對(duì)HCa-F細(xì)胞的IC50比較見表2。

表2 不同濃度OPN、OPTN、OPPTN組培養(yǎng)不同時(shí)間后對(duì)HCa-F細(xì)胞的IC50比較（n＝6）Tab 2 Comparison of IC50 of OPN，OPTN and OPPTN at different concentrations to HCa-F after different incubation duration（n＝6）

由表2結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，3種OA-NPs對(duì)HCa-F細(xì)胞的IC50逐漸減小，其中OPTN組明顯小于OPPTN組和OPN組（P＜0.05或P＜0.01），主要是因?yàn)镺PTN粒徑更小、表面所帶負(fù)電荷的絕對(duì)值更大[3，4]，更易被腫瘤細(xì)胞攝取、吞噬，以及藥物釋放更快更完全[2]。

3 討論

不同濃度OPN、OPTN和OPPTN組的IR在相同時(shí)間時(shí)分別明顯高于OS組（P均＜0.01），表明NPs作為藥物載體由于其粒徑、表面電荷等有助于OA被細(xì)胞更好地?cái)z取、吞噬，使OA能更好地發(fā)揮其抗腫瘤作用；而3種OA-NPs均在72 h時(shí)的抗腫瘤作用最強(qiáng)，這是因?yàn)榇藭r(shí)NPs釋放出藥物量最多，表明其良好的緩釋性和靶向性。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，HCa-F細(xì)胞體外培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)3個(gè)濃度的OPTN、OPPTN組的IR均明顯比OPN組高，差異具有顯著性意義（P＜0.05或P＜0.01）。這是因?yàn)镺PTN組和OPPTN組隨著其載體材料PLGA-TPGS、PCL-PLA-TPGS的降解能釋放出更多的TPGS，而TPGS能通過抑制P糖蛋白改善細(xì)胞膜的滲透性，增強(qiáng)藥物的吸收，有效地抑制癌細(xì)胞的增長(zhǎng)[6]；將其與PLGA、PCL、PLA合成新的高分子材料后，不但能增強(qiáng)載體的水溶性，同時(shí)由于其所帶負(fù)電荷，更易被肝細(xì)胞攝取，還能加強(qiáng)載體對(duì)肝臟的主動(dòng)靶向作用，能進(jìn)一步增強(qiáng)OA的抗腫瘤活性。

本試驗(yàn)采用WST-1法測(cè)定，是因?yàn)槠渥鳛镸TT的升級(jí)替代產(chǎn)品，和MTT或其他MTT類似產(chǎn)品如XTT（二甲氧唑黃細(xì)胞增殖分析試劑盒）、MTS（3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑鹽細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒）等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。首先，WST-1被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成的甲（Formazan）是水溶性的，不需要有特定的溶劑（如二甲基亞砜）來溶解，可以省去后續(xù)的溶解步驟；其次，WST-1產(chǎn)生的甲比XTT和MTS產(chǎn)生的甲更易溶解，可減少損失；再次，WST-1比XTT和MTS穩(wěn)定，也可使試驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定，故線性范圍更寬、靈敏度更高。

本研究關(guān)于IC50的計(jì)算參考國(guó)外文獻(xiàn)[7]采用3個(gè)濃度，試驗(yàn)結(jié)果存在一定的局限性，有待進(jìn)一步證明。

綜上，3種OA-NPs具有良好的細(xì)胞相容性和抗腫瘤作用，IR均明顯高于OS組，其中OPTN組的最高，對(duì)OA應(yīng)用和臨床研究具有一定的參考價(jià)值。由于時(shí)間有限，本試驗(yàn)僅用WST-1法研究OA-NPs在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，其對(duì)肝臟的主動(dòng)靶向性、體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)等有待進(jìn)一步的研究。

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