一株生防木霉的鑒定及對(duì)山藥病原菌的拮抗作用

摘要

由膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的炭疽病和交鏈格孢Alternaria alternata引起的黑斑病是山藥生產(chǎn)中的主要病害，嚴(yán)重威脅著山藥產(chǎn)業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展，尋找高效環(huán)保的生物防治方法對(duì)提高山藥的產(chǎn)量與質(zhì)量具有重要意義。本研究從山藥塊莖上分離得到一株木霉菌株TKN1，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定確認(rèn)為擬康寧木霉Trichoderma koningiopsis。生物學(xué)特性研究顯示，25℃和pH為6最適合擬康寧木霉生長(zhǎng)。平板對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)顯示，該木霉對(duì)山藥常見(jiàn)病原菌：膠孢炭疽菌、交鏈格孢、藤倉(cāng)鐮刀菌Fusarium fujikuroi和腐皮鐮刀菌Fusarium solani均表現(xiàn)出顯著的拮抗作用，平均抑制率超過(guò)84%。顯微觀察顯示，擬康寧木霉通過(guò)纏繞和消解方式有效破壞了藤倉(cāng)鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)。室內(nèi)防效評(píng)估結(jié)果顯示，該木霉對(duì)膠孢炭疽菌、交鏈格孢和藤倉(cāng)鐮刀菌引起的山藥葉部和塊莖病害的防治效果能達(dá)到44%以上。以上研究結(jié)果表明，擬康寧木霉TKN1抑菌譜廣，具備良好的生防潛力，可為山藥種植中多種真菌病害的綠色防控提供新的生防菌種資源。

關(guān)鍵詞

擬康寧木霉; 生物防治; 分離鑒定; 山藥病害

中圖分類號(hào)：

S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024381

Identification of a biocontrol Trichoderma strain and its antagonistic activity against yam pathogens

WANG Gang， WAN Zhirui， SHEN Danyu*， DOU Daolong

（College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract

Anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides and black spot caused by Alternaria alternata are major diseases affecting yam production， posing significant threats to its sustainability and quality. In this study， a Trichoderma strain designated TKN1 was isolated from yam tubers and identified as Trichoderma koningiopsis based on morphological characteristics and molecular phylogeny. The strain exhibited optimal growth at 25℃ and pH 6. Dualculture assays revealed strong antagonistic activity of TKN1 against C.gloeosporioides， A.alternata， Fusarium fujikuroi， and F.solani， with an average inhibition rate exceeding 84%. Microscopic observation showed that TKN1 parasitized F.fujikuroi hyphae through coiling and lysis. Indoor bioassays further demonstrated that TKN1 effectively reduced both foliar and tuber diseases caused by the three pathogens， achieving more than 44% disease control efficacy. These findings highlight that TKN1 has a broad antifungal spectrum and significant potential as a biocontrol agent for managing fungal diseases in yam cultivation.

Key words

Trichoderma koningiopsis; biological control; isolation and identification; yam diseases

山藥Dioscorea polystachya隸屬于薯蕷科Dioscoreaceae薯蕷屬Dioscorea，廣泛種植于我國(guó)長(zhǎng)江以北地區(qū)，南方地區(qū)也有其同屬植物的種植。山藥以其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和多種藥用功效而聞名，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床和食療中［1］。作為營(yíng)養(yǎng)豐富的藥食同源作物，在中國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和日常生活中具有重要地位。山藥富含碳水化合物，為人體提供能量，并含有適量的蛋白質(zhì)，其氨基酸比例對(duì)人體有益。在藥用方面，山藥性味甘平，有補(bǔ)脾肺腎之氣、滋陰養(yǎng)生的功效，可用于治療脾胃虛弱、肺腎虧虛、虛熱消渴等病癥［24］。

然而，隨著山藥種植面積的不斷擴(kuò)大，病害問(wèn)題日益嚴(yán)峻，成為制約山藥產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的重大障礙。近年來(lái)，山藥病害種類不斷增多，如膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的炭疽病、交鏈格孢Alternaria alternata引起的黑斑病等頻繁發(fā)生且嚴(yán)重程度加?。?］。這些病害導(dǎo)致山藥產(chǎn)量銳減、品質(zhì)下滑，嚴(yán)重影響了山藥的市場(chǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益［6］。當(dāng)前，病害防控主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，但農(nóng)藥的濫用帶來(lái)了殘留問(wèn)題、環(huán)境污染及抗藥性等挑戰(zhàn)。在此背景下，綠色農(nóng)業(yè)理念的推廣使得探索新的綠色防控技術(shù)成為迫切需求。

生物防治利用有益生物及其代謝產(chǎn)物控制有害生物，具有生態(tài)友好和安全無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為防治作物病害的優(yōu)選方案。隨著生物防治技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注生防菌在山藥病害防治中的應(yīng)用。例如，馬來(lái)西亞鏈霉菌Streptomyces malaysiensis菌株MJM1968不僅能抑制膠孢炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，還能減輕山藥炭疽病的發(fā)生［7］。此外，從蘆薈中分離出的內(nèi)生細(xì)菌地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis也對(duì)山藥炭疽病表現(xiàn)出顯著的防治效果［8］。還有研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis和細(xì)黃鏈霉菌Streptomyces microflavus對(duì)山藥腐爛微生物青霉菌具有較強(qiáng)的抑菌活性［9］。

木霉作為一類重要的生防真菌，具有抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、孢子存活期長(zhǎng)等特點(diǎn)［10］，對(duì)多種植物病害具有良好的抑制作用，且不易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，有助于促進(jìn)植物生長(zhǎng)和控制病害發(fā)生［11］。木霉通過(guò)多種途徑防治病害，包括直接作用如釋放細(xì)胞壁降解酶、合成抗生素、與病原菌爭(zhēng)奪生態(tài)位和營(yíng)養(yǎng)資源，以及建立寄生關(guān)系;還通過(guò)間接機(jī)制如改善土壤微環(huán)境、激發(fā)植物自身免疫系統(tǒng)等，實(shí)現(xiàn)病害的有效控制［12］。有研發(fā)發(fā)現(xiàn)哈茨木霉Trichoderma harzianum菌株Th7對(duì)山藥炭疽菌有顯著的抑制效果，能有效減輕山藥炭疽病的發(fā)生，表明木霉在山藥病害防治中具有良好的應(yīng)用潛力［13］。

本研究從江西省瑞昌山藥的塊莖上分離獲得一株木霉，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法對(duì)其進(jìn)行了鑒定，并進(jìn)一步研究了其生物學(xué)特性。利用平板對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)測(cè)定了這株木霉對(duì)山藥4種病原菌的抑制效果，并通過(guò)室內(nèi)防效評(píng)估試驗(yàn)測(cè)定了其對(duì)山藥病害的防效，旨在挖掘優(yōu)良的生防菌資源用于山藥病害的防治。

1 材料與方法

1.1 木霉的分離與純化

選取田間采集的瑞昌山藥部分塊莖，在皮層處取0.5 cm2的組織塊，先用2%的次氯酸鈉消毒1 min 45 s，然后用75%的乙醇消毒35 s，無(wú)菌水漂洗6 min，隨后在滅菌的濾紙上晾干，置于PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d，從長(zhǎng)出的菌落邊緣挑取菌絲轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基上［14］。

1.2 木霉的形態(tài)觀察

將純化后的木霉菌株接至PDA平板2 d后，用光學(xué)顯微鏡觀察木霉的菌絲及孢子的形態(tài)特征。

1.3 木霉的分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB法提取樣品DNA，并于-20℃保存?zhèn)溆?。利用ITS通用引物ITS1/ITS4（ITS1：5′TCCGTAGGTGAACCTGCCG3′，ITS4：5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）和鈣調(diào)蛋白基因通用引物CAL228F/CAL737R（CAL228F：5′GAGTTCAAGGAGGCCTTCTCCC3′，CAL737R：5′CATCTTTCTGGCCATCATGG3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（南京）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至NCBI網(wǎng)站，使用BLAST進(jìn)行比對(duì)分析［15］，并使用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 木霉菌株的生物學(xué)特性

1.4.1 pH對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

使用0.1 mol/L NaOH和HCl調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基pH至4、5、6、7、8、9、10后，121℃滅菌20 min［16］。將保存的菌株活化并接種于PDA培養(yǎng)基上，待菌落生長(zhǎng)2 d后，用無(wú)菌打孔器（直徑 5 mm）在菌落邊緣切取大小一致的菌餅，接種于不同pH的PDA培養(yǎng)基上，于 25℃黑暗條件培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，2 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.4.2 溫度對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

將直徑為5 mm菌餅接種于pH為6的PDA培養(yǎng)基上，設(shè)置4、18、25、30、37℃共5個(gè)溫度處理，黑暗條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)4次，2 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.4.3 光照對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

將直徑為5 mm的菌餅接種于pH為6的PDA培養(yǎng)基上，設(shè)置光照周期L∥D=12 h∥12 h、L∥D=16 h∥8 h和L∥D=0 h∥24 h培養(yǎng)條件，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)4次，2 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.4.4 培養(yǎng)基對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL）、馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，蔗糖15 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL）、水瓊脂（WA）培養(yǎng)基（瓊脂20 g，蒸餾水 1 000 mL）、察氏（CZA）培養(yǎng)基（硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵 0.01 g，蔗糖 30 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL）和蛋白胨（PWCM）培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，葡萄糖 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水 1 000 mL）共5種培養(yǎng)基，將直徑5 mm菌餅接種于培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，2 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.5 平板對(duì)峙試驗(yàn)

選取膠孢炭疽菌、交鏈格孢、藤倉(cāng)鐮刀菌Fusarium fujikuroi和腐皮鐮刀菌F.solani作為供試病原菌，這些病原菌由實(shí)驗(yàn)室前期從山藥病害樣品中分離并保存。用打孔器分別打取木霉和病原菌的菌餅（直徑為5 mm）用于平板對(duì)峙培養(yǎng)。處理組每個(gè)平板上分別接種1個(gè)木霉菌餅和1個(gè)病原菌菌餅，位置分別設(shè)在平板直徑的1/8和7/8處。對(duì)照組只接種病原菌而不接種木霉，病原菌接種在平板直徑1/8處。病原菌在25℃下培養(yǎng)，拮抗試驗(yàn)重復(fù)3次。當(dāng)對(duì)照組病原菌生長(zhǎng)超過(guò)培養(yǎng)基的2/3時(shí)，分別測(cè)量對(duì)照平板和對(duì)峙培養(yǎng)平板上病原菌菌落的直徑，計(jì)算抑制率，并根據(jù)木霉菌絲覆蓋病原菌菌落的情況，評(píng)定其覆蓋度級(jí)別。

抑制率=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑×100%。覆蓋度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為3級(jí)［17］。Ⅰ 級(jí)：木霉菌落與病原菌菌落不接觸，木霉菌絲不能覆蓋病原菌菌落;Ⅱ級(jí)：木霉菌絲覆蓋病原菌菌落的一半以下，且病原菌菌落顏色無(wú)變化;Ⅲ級(jí)：木霉菌絲完全覆蓋病原菌菌落，且在病原菌菌落上產(chǎn)生大量孢子，導(dǎo)致病原菌菌落萎縮和顏色變暗。

1.6 木霉發(fā)酵液的制備與抑菌率的測(cè)定

將木霉接種在直徑為90 mm的PDA平板上，在25℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)至產(chǎn)孢，用5 mm打孔器打取4個(gè)木霉菌絲塊，置于含有200 mL PDB培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶中，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、黑暗條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d。將初步發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到預(yù)先滅菌的50 mL離心管中，以8 000 r/min離心10 min，取上清，經(jīng)0.22 μm過(guò)濾膜除菌后得到木霉無(wú)菌發(fā)酵液。

將無(wú)菌的木霉發(fā)酵液與冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基按1∶9比例混合后倒入平板中固化，設(shè)置添加等體積PDB的PDA平板作為對(duì)照。培養(yǎng)基凝固后，將直徑為5 mm的病原菌菌絲塊接種于平板中央，在25℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，期間觀察病原菌菌落生長(zhǎng)情況。當(dāng)對(duì)照組病原菌即將長(zhǎng)滿整個(gè)平板時(shí)，使用十字交叉法測(cè)量對(duì)照組和處理組的病原菌菌落直徑，計(jì)算木霉發(fā)酵液對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)的抑制率，每組試驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù)。發(fā)酵液的抑菌率＝（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑×100%。

1.7 木霉孢子懸浮液的制備

將木霉接種在直徑為90 mm的PDA平板上，在25℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)至產(chǎn)孢，使用無(wú)菌水洗脫P(yáng)DA平板上的孢子，經(jīng)3層滅菌濾紙過(guò)濾，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子懸浮液的濃度。

1.8 木霉對(duì)人工接種病原菌的防治效果測(cè)定

將鐵棍山藥塊莖切塊，用去離子水浸泡并沖洗表面黏液，使用2%次氯酸鈉表面消毒3 min，隨后用75%乙醇消毒1 min，用無(wú)菌去離子水沖洗3次。將木霉孢子懸浮液浸泡山藥塊莖30 min，之后將塊莖放置在吸水紙上晾干。分別在處理過(guò)和未處理的塊莖中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，同時(shí)設(shè)立經(jīng)木霉孢子懸浮液處理后接種無(wú)菌瓊脂塊的塊莖作為陰性對(duì)照，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。將接種塊莖置于恒溫培養(yǎng)箱中，25℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d。

防病效果=（對(duì)照組病斑直徑-處理組病斑直徑）/對(duì)照組病斑直徑×100%。

將鐵棍山藥葉片用75%乙醇噴灑正反面，放入純水中浸泡并漂洗10 s，擦干后豎直放置在接種盤(pán)上。設(shè)置處理組和對(duì)照組，每組處理3片葉片，共6個(gè)重復(fù)，處理組使用濃度為1.7×106 cfu/mL的木霉孢子懸浮液浸泡處理葉片30 min;對(duì)照組使用等體積的無(wú)菌水處理。在處理組和對(duì)照組的葉片針刺處接種病原菌，同時(shí)設(shè)立經(jīng)木霉孢子懸浮液處理后接種無(wú)菌瓊脂塊的葉片作為陰性對(duì)照。將接種葉片保濕密封后，置于黑暗環(huán)境下25℃培養(yǎng)24 h，之后分別接種2種病原菌菌餅，接種7 d后觀察侵染結(jié)果，使用十字交叉法測(cè)量病斑直徑以計(jì)算防病效果。

防病效果=（對(duì)照組病斑直徑-處理組病斑直徑）/對(duì)照組病斑直徑×100%。

1.9 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析和Duncan氏新復(fù)極差法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株TKN1的鑒定

2.1.1 菌株TKN1的形態(tài)學(xué)觀察

將從山藥塊莖樣品中分離得到的菌株TKN1置于PDA培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)該菌株在25℃環(huán)境下生長(zhǎng)迅速且旺盛，培養(yǎng)60 h后，菌落能夠完全覆蓋90 mm直徑的培養(yǎng)皿。初期菌絲呈白色，菌落長(zhǎng)滿后均勻產(chǎn)生綠色或黃綠色的產(chǎn)孢簇，有時(shí)呈棉絮狀，不產(chǎn)生擴(kuò)散性色素和氣味（圖1）。隨后有綠色分生孢子產(chǎn)生，分生孢子呈橢球形或球形。分生孢子梗直立，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生瓶?；蚨?jí)分枝（圖1）?？捎种Φ捻敹送ǔＳ?～5個(gè)渦狀排列的瓶梗，瓶梗直或彎曲，中部明顯膨大。菌株TKN1的整體菌落形態(tài)特征與木霉基本一致［18］。

2.1.2 菌株TKN1的分子生物學(xué)鑒定

使用ITS和鈣調(diào)蛋白基因的通用引物對(duì)菌株TKN1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得了菌株TKN1的ITS序列（GenBank登錄號(hào)：PP973872）和鈣調(diào)蛋白基因序列（GenBank登錄號(hào)：PP977147）。隨后將這些測(cè)序序列提交到NCBI數(shù)

據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，結(jié)果顯示菌株TKN1的ITS序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的擬康寧木霉序列的相似度為100%，鈣調(diào)蛋白基因序列的相似度為99.7%。

2.2 擬康寧木霉的生物學(xué)特性

pH對(duì)擬康寧木霉TKN1菌株生長(zhǎng)的影響測(cè)試結(jié)果顯示，在pH為4～10的范圍內(nèi)，擬康寧木霉TKN1均能正常生長(zhǎng)（圖3）。特別是在pH=6條件下，其生長(zhǎng)速度相對(duì)較快，菌落直徑在第2天時(shí)平均可以達(dá)到7.43 cm，幾乎覆蓋了培養(yǎng)皿的大部分面積。在不同的溫度條件處理下，擬康寧木霉能夠在18～30℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)（圖3），其中25℃是其最適宜的生長(zhǎng)溫度，菌落生長(zhǎng)速度最快。在較低溫度4℃和較高溫度37℃下，擬康寧木霉的生長(zhǎng)受到顯著抑制，菌落基本不生長(zhǎng)。在光照條件方面，擬康寧木霉在L∥D=16 h∥8 h、L∥D=12 h∥12 h和L∥D=0 h∥24 h培養(yǎng)條件下均能生長(zhǎng)（圖3），其中在光暗交替環(huán)境下，菌株的生長(zhǎng)速率更快。雖然不同光照條件下，擬康寧木霉的菌絲生長(zhǎng)速率有所不同，但總體影響并不顯著。擬康寧木霉在測(cè)試的5種培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng)，但在不同培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速率和菌絲的疏密度有所差異，其中擬康寧木霉在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）和蛋白胨培養(yǎng)基（PWCM）培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率最快，在水瓊脂培養(yǎng)基（WA）和察氏培養(yǎng)基（CZA）上生長(zhǎng)較慢（圖3）。

2.3 擬康寧木霉對(duì)4種病原菌的拮抗作用

選取了4種山藥常見(jiàn)病原菌：膠孢炭疽菌、交鏈格孢、藤倉(cāng)鐮刀菌和腐皮鐮刀菌，分別與擬康寧木霉TKN1進(jìn)行了平板對(duì)峙試驗(yàn)。對(duì)峙培養(yǎng)2 d后，觀察到擬康寧木霉菌落開(kāi)始與病原菌接觸，導(dǎo)致病原菌菌絲邊緣的生長(zhǎng)速度明顯減慢，甚至停止生長(zhǎng)。對(duì)峙培養(yǎng)7 d時(shí)，擬康寧木霉的菌絲均已覆蓋了病原菌的一部分菌落（圖4）。測(cè)定結(jié)果顯示，擬康寧木霉對(duì)這4種病原菌的抑制率均超過(guò)84%（表1），其中對(duì)膠孢炭疽菌的抑制率最高，達(dá)到了88.32%。此外，擬康寧木霉的菌絲能夠覆蓋在其他病原菌的菌落上，并產(chǎn)生了一定數(shù)量的孢子，說(shuō)明其對(duì)這些病原菌存在一定的寄生能力，但覆蓋面積未超過(guò)病原菌菌落的一半，且未導(dǎo)致病原菌顏色變化或明顯的菌落萎縮，因此覆蓋度等級(jí)判定為Ⅱ級(jí)。

2.4 顯微觀察擬康寧木霉的寄生作用

本研究以藤倉(cāng)鐮刀菌為代表，收集了擬康寧木霉與其對(duì)峙培養(yǎng)5 d的樣品進(jìn)行顯微觀察。結(jié)果顯示，擬康寧木霉的菌絲通過(guò)纏繞和消解的方式寄生于藤倉(cāng)鐮刀菌的菌絲上，導(dǎo)致部分藤倉(cāng)鐮刀菌的菌絲出現(xiàn)了消解現(xiàn)象（圖5），同時(shí)擬康寧木霉的存在能夠抑制藤倉(cāng)鐮刀菌的菌絲正常生長(zhǎng)。

2.5 擬康寧木霉發(fā)酵濾液的抑菌作用

使用擬康寧木霉TKN1的無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)腐皮鐮刀菌、藤倉(cāng)鐮刀菌、膠孢炭疽菌和交鏈格孢抑菌作用試驗(yàn)結(jié)果顯示，混合培養(yǎng)基上病原菌的菌落大小明顯小于對(duì)照培養(yǎng)基，生長(zhǎng)也不如對(duì)照組旺盛，菌落周圍的菌絲較為短小，菌落邊緣生長(zhǎng)更加規(guī)則。進(jìn)一步的測(cè)定結(jié)果顯示（表2），擬康寧木霉發(fā)酵濾液對(duì)藤倉(cāng)鐮刀菌和交鏈格孢菌的抑菌率最高，分別達(dá)到了36.45%和22.17%。相比之下，對(duì)腐皮鐮刀菌的抑制效果最差，僅為13.37%。擬康寧木霉發(fā)酵濾液的抑菌活性不如對(duì)峙培養(yǎng)，可能是因?yàn)槟久箤?duì)病原菌的直接抑制作用要大于其代謝產(chǎn)物對(duì)這些病原菌的影響。

2.6 擬康寧木霉的活體防病效果

為了進(jìn)一步評(píng)估擬康寧木霉對(duì)山藥病害的防治效果，本試驗(yàn)中測(cè)定了其孢子懸浮液處理山藥葉片和塊莖后的防病效果。

接種病原菌7 d后，對(duì)照組的山藥塊莖表面出現(xiàn)不規(guī)則近圓形的病斑，藤倉(cāng)鐮刀菌侵染形成的病斑直徑為2.4 cm，顏色為深褐色，而膠孢炭疽菌形成的病斑直徑較小，為1.7 cm（圖6a）。相較于對(duì)照組，經(jīng)擬康寧木霉處理的病斑直徑僅為 1.2 cm 和1.0 cm（圖6b），對(duì)藤倉(cāng)鐮刀菌和交鏈格孢的防病效果分別達(dá)到49.0%和44.2%，顯示擬康寧木霉能有效抑制這些病原菌對(duì)山藥塊莖的侵染。

未經(jīng)擬康寧木霉處理的山藥葉片在接種病原菌后7 d形成了不規(guī)則的深褐色病斑（圖7a），而經(jīng)擬康寧木霉孢子懸浮液處理的葉片發(fā)病面積明顯較小，對(duì)膠孢炭疽菌和交鏈格孢的防病效果分別為58.7%和50.3%（圖7b），表明擬康寧木霉同樣能有效控制山藥葉部的病害。

3 結(jié)論與討論

山藥是一種傳統(tǒng)的藥食同源作物，在其生長(zhǎng)的各個(gè)階段常面臨多種病原菌的侵染，進(jìn)而引發(fā)長(zhǎng)勢(shì)衰弱、產(chǎn)量銳減和品質(zhì)下降等問(wèn)題，嚴(yán)重制約了我國(guó)山藥種植業(yè)的健康發(fā)展［19］。在生產(chǎn)上，山藥病害防控高度依賴化學(xué)農(nóng)藥，但長(zhǎng)期使用容易導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、病原菌抗藥性增強(qiáng)及生態(tài)環(huán)境污染等嚴(yán)峻問(wèn)題［20］。近年來(lái)，作為可持續(xù)農(nóng)業(yè)的重要組成部分，生物防治技術(shù)受到日益關(guān)注。與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比，生物防治具有環(huán)保、高安全性和對(duì)非靶標(biāo)生物影響小的特性，被視為推動(dòng)農(nóng)業(yè)綠色轉(zhuǎn)型的重要途徑之

一［21］。目前，已有一些生防菌應(yīng)用于山藥病害的防治中，例如鏈霉菌、地衣芽胞桿菌和哈茨木霉對(duì)山藥炭疽病表現(xiàn)出良好的防治效果［22］。然而，面對(duì)山藥病害防控的復(fù)雜需求，高效生防資源的儲(chǔ)備仍顯不足，需要進(jìn)一步擴(kuò)展與深化。

本研究從山藥塊莖上分離獲得一株木霉菌株TKN1，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確認(rèn)為擬康寧木霉。擬康寧木霉TKN1對(duì)多種山藥病原菌表現(xiàn)出廣譜的抑菌作用，能有效抑制常見(jiàn)的幾種山藥病原菌，包括膠孢炭疽菌、交鏈格孢、腐皮鐮刀菌和藤倉(cāng)鐮刀菌等，對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中，其抑制率超過(guò)了84%，顯示出較強(qiáng)的生物防治潛力。擬康寧木霉TKN1在不同的環(huán)境條件下（如pH、溫度、培養(yǎng)基等）展現(xiàn)出良好的適應(yīng)性和快速的生長(zhǎng)能力，尤其在適宜的溫度和pH條件下能迅速形成密集的菌絲網(wǎng)，有效競(jìng)爭(zhēng)并抑制病原菌的生長(zhǎng)，與文獻(xiàn)報(bào)道的特性相似［23］。此外，木霉難以引起病原菌的抗藥性，其復(fù)雜的作用機(jī)制包括競(jìng)爭(zhēng)性抑制、生物殺菌物質(zhì)的產(chǎn)生、寄生作用等，使其在病害防治中長(zhǎng)期有效［24］。

木霉的抑菌機(jī)制是其用于生物防治的核心優(yōu)勢(shì)之一。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，木霉能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性占據(jù)生存空間和營(yíng)養(yǎng)資源、分泌抑制性代謝產(chǎn)物和寄生等多種機(jī)制抑制病原菌［25］。本研究中通過(guò)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，擬康寧木霉TKN1的菌絲能有效纏繞并消解病原菌菌絲，進(jìn)而破壞其結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致其死亡。這種寄生作用顯著降低了病原菌的侵染能力，同時(shí)減少了病害的發(fā)生和傳播［26］。此外，培養(yǎng)皿對(duì)峙試驗(yàn)中觀察到，擬康寧木霉TKN1菌絲能快速生長(zhǎng)并覆蓋病原菌菌絲，有效抑制病原菌的進(jìn)一步生長(zhǎng)和繁殖。這些發(fā)現(xiàn)表明，擬康寧木霉TKN1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性占據(jù)關(guān)鍵生存空間和營(yíng)養(yǎng)資源，有效限制了病原菌的生長(zhǎng)，展現(xiàn)了其在生物防治中的重要作用［27］。

木霉作為一種生防菌，在山藥病害防治中展示了一定的應(yīng)用潛力，但其在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)和限制。為了擴(kuò)大木霉的應(yīng)用范圍并提升其效果，需要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行深入研究和探索：首先，優(yōu)化木霉菌株的篩選和鑒定流程。目前，盡管已有多個(gè)木霉菌株被鑒定具有生物防治潛力［28］，但針對(duì)特定地域和作物病害的木霉菌株的篩選和鑒定仍需進(jìn)一步深入，獲得更具針對(duì)性的高效菌株。其次，優(yōu)化木霉的發(fā)酵工藝。木霉的生產(chǎn)效率和生物活性物質(zhì)的效能直接影響到其實(shí)際應(yīng)用的效果［29］，研究和優(yōu)化適宜的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基配方，是提高產(chǎn)量和活性的關(guān)鍵。第三，開(kāi)發(fā)多功能的復(fù)合生物農(nóng)藥。將木霉與其他抑菌機(jī)制互補(bǔ)的微生物相結(jié)合，形成協(xié)同增效的防控體系，以更加全面、持久地應(yīng)對(duì)山藥病害的挑戰(zhàn)［30］。

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（責(zé)任編輯：田 喆）