牧區(qū)醪糟中微生物分離鑒定及耐受性、產(chǎn)酶特性的研究

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.07.015

中圖分類號(hào)：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2025）07-0104-04

lsolation and ldentification of Microoganisms from Fermented Glutinous Rice in Pastoral Area and Study on Their Tolerance and Enzyme Production Characteristics

LIU Hong-wei1'2， ZHANG Mei-li2 * （1.Hetao College，Bayannur O15ooo， China; 2. College of Food Science and Engineering， InnerMongolia Agricultural University，Hohhot Olool8，China）

Abstract：With fermented glutinous rice in the pastoral area of Ordos region as the test material，the dominant microorganisms in it are isolated and purified，physiological and biochemical identification is conducted，and their tolerance and enzyme production characteristics are studied. The results show that three strains of Brevibacterium casei （LZl #， LZ2# and ）and three strains of Bacillus subtilis （ ， LZ4# and ）are isolated from fermented glutinous rice in the pastoral area. The six strains isolated from fermented glutinous rice can all grow at 65^°C and have good high-temperature resistance characteristics. LZ3#， LZ4? and LZ6# have good salt tolerance. LZl #， LZ3# and LZ5# can produce amylase，and all the six strains can produce protease and lipase. The research results are expected to provide eficient fermentation agents and enzyme preparations for the rapid fermentation and quality control of fermented glutinous rice in the pastoral area.

Key words： fermented glutinous rice in pastoral area；microoganisms；resistance；enzyme production characteristics

發(fā)酵食品具有悠久的歷史，微生物發(fā)酵賦予食品優(yōu)良的味道、香氣、質(zhì)地、營(yíng)養(yǎng)特性和功能活性。發(fā)酵是增強(qiáng)農(nóng)畜產(chǎn)品貨架期的有效手段之一。微生物是食品發(fā)酵的動(dòng)力源泉，微生物及其產(chǎn)生的相應(yīng)酶類能夠通過酸化作用、乙醇發(fā)酵、蛋白質(zhì)水解或氨基酸轉(zhuǎn)化等途徑增強(qiáng)產(chǎn)品的貨架期和感官品質(zhì)，直接影響發(fā)酵食品的品質(zhì)[1]。醪糟是一種以復(fù)合菌種為發(fā)酵劑制得的傳統(tǒng)發(fā)酵飲品，與東南亞、非洲等發(fā)展中國(guó)家的一些發(fā)酵飲品極為相似，因其味美可口而廣受喜愛[2]。傳統(tǒng)醪糟以糯米為主要原料，因糯米的別稱為江米或酒米，故醪糟有甜酒釀等多種別名[3]。與傳統(tǒng)的醪糟不同，牧區(qū)醪糟是先將發(fā)芽后的燕麥、玉米、小麥等谷物磨成粉制成自制曲，然后以黃米面等為原料充分將其熬熟糊化，再加入自制曲和高度糧食酒，利用環(huán)境中的微生物（主要是根霉菌、乳酸菌和酵母菌）自然發(fā)酵而成，是一種具有少數(shù)民族地方特色的食品，與晉陜地區(qū)的“酸食\"異曲同工，其口味香醇、甜酸適口[4-5]。傳統(tǒng)的工藝傳承及特定的區(qū)域環(huán)境，一定程度上是對(duì)相關(guān)微生物的定向馴化與選擇，也正是因此才形成了我國(guó)多種區(qū)域性醪糟制品。

傳統(tǒng)食品發(fā)酵體系中，微生物是發(fā)酵食品的“靈魂”，與發(fā)酵食品的工藝、風(fēng)味等直接相關(guān)。牧區(qū)醪糟作為特定區(qū)域的傳統(tǒng)谷物發(fā)酵食品，多為家庭式或小作坊式生產(chǎn)，不同批次產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定，難以工業(yè)化生產(chǎn)，因此了解牧區(qū)醪糟優(yōu)勢(shì)微生物、對(duì)牧區(qū)醪糟中發(fā)酵微生物進(jìn)行種質(zhì)資源開發(fā)能更好地滿足牧區(qū)醪糟的發(fā)展需求。本研究以鄂爾多斯牧區(qū)醪糟為供試材料，對(duì)牧區(qū)醪糟的優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行分離鑒定并研究其耐受性和產(chǎn)酶特性，旨在為穩(wěn)定并提高牧區(qū)醪糟純種發(fā)酵、品質(zhì)調(diào)控、產(chǎn)品開發(fā)提供基礎(chǔ)和保障。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種來源牧區(qū)醪糟：取自鄂爾多斯地區(qū)，冷藏備用。

1.1. 2 儀器與設(shè)備

DL-CJ-1NHDL-潔凈工作臺(tái)北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；PB-3O普及型pH計(jì)德國(guó)賽多利斯公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SX-300 高壓蒸汽滅菌器Tomy股份有限公司；BSA124S萬分之一電子天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.1. 3 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白脈培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、霉菌培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基；產(chǎn)脂肪酶鑒別培養(yǎng)基：參照伍朝亞等研究中的初篩培養(yǎng)基；產(chǎn)淀粉酶鑒別培養(yǎng)基8：可溶性淀粉培養(yǎng)基；產(chǎn)蛋白酶鑒別培養(yǎng)基：參照陳明霞等[9研究中的初篩培養(yǎng)基。

盧戈氏碘液的配制：分別用天平稱取碘化鉀 2.0g 、碘片 1.0g ，用少量水先將碘化鉀溶解，再將碘片溶解于碘化鉀溶液中，待完全溶解后，用去離子水補(bǔ)足。

1.2方法

1.2.1 菌種分離、純化

微生物的分離采用稀釋平板涂布法。將12份醪糟樣品分別稱取 500g ，充分混勻，取 25g 混合樣品置于 225mL 滅菌生理鹽水中混勻，制備成菌懸液，采用梯度稀釋法稀釋至 10^-6 倍，選取 1.0mL10^-4 10^-5 .10^-6 倍的稀釋菌液接種于無菌培養(yǎng)血中，分別傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、霉菌培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基于接種菌液的培養(yǎng)皿中，細(xì)菌分離培養(yǎng)基培養(yǎng)皿于37^°C 倒置培養(yǎng) ^48h ，乳酸菌分離培養(yǎng)基培養(yǎng)皿于 32^°C 倒 置培養(yǎng) ^48h ，霉菌和酵母菌培養(yǎng)皿于 30^°C 恒溫恒濕培養(yǎng) 箱中正置培養(yǎng)5d[10]。

培養(yǎng)結(jié)束后，觀察并挑選菌落形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行分離純化（挑起單菌落多次劃線純培養(yǎng)操作，至平板菌落形態(tài)單一為正），將分離純化得到的菌株進(jìn)行編號(hào)并轉(zhuǎn)接于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基中 4^°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌落形態(tài)特征觀察

宏觀形態(tài)觀察：細(xì)菌、乳酸菌、酵母菌等分離純化培養(yǎng)結(jié)束，觀察單一菌落的形態(tài)特征。

微觀形態(tài)觀察：用接種環(huán)挑取少許細(xì)菌、乳酸菌菌落，制成水浸片，在 10×100 倍油鏡下進(jìn)行觀察；用接種環(huán)挑取少許酵母菌菌落，制成水浸片，在 10×40 倍油鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.3 生理生化試驗(yàn)[11-12]

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》，對(duì)所篩選的醪糟分離菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征和生理生化鑒定。

乳酸菌鑒定：通過革蘭氏染色、接觸酶、氧化酶、運(yùn)動(dòng)性、 7% NaCl、V-P試驗(yàn)、明膠水解、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原、硫化氫試驗(yàn)和過氧化氫試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

芽孢桿菌鑒定：通過氧化酶、葡萄糖發(fā)酵、V-P試驗(yàn)、脲酶酶反應(yīng)、甘露醇利用、明膠水解、硝酸鹽還原和pH5.7 生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

1. 2.4 16SrRNA序列分析

將分離得到的優(yōu)勢(shì)微生物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序得到的結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST（basic local alignment search tool，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同源性比對(duì)分析。

1.2.5 醪糟分離菌耐受性研究

1.2.5.1對(duì)溫度的耐受性研究

將活化好的醪糟分離菌接種于牛肉膏蛋白脈培養(yǎng)基中，分別置于32，37，42，47，65℃培養(yǎng) ^48h ，觀察生長(zhǎng)情況。每組設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.5.2 對(duì)鹽濃度的耐受性研究

將活化好的分離菌接種于NaCl濃度為 2%.5% 、7%.10% 的牛肉膏蛋白脈培養(yǎng)基中， 37^°C 培養(yǎng) ^48h 觀察分離菌的生長(zhǎng)情況。每組設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.6 醪糟分離菌產(chǎn)酶特性研究

產(chǎn)淀粉酶試驗(yàn)[13-14]：將 15mL 可溶性淀粉培養(yǎng)基注入直徑為 90cm 的無菌培養(yǎng)皿中，待凝固成平板后，挑取單菌落點(diǎn)接于平板上，于 培養(yǎng) ^48h 后，將碘液滴加在平板上，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，若出現(xiàn)透明圈，說明該菌株能夠產(chǎn)淀粉酶，具有分解淀粉的能力。用直尺分別測(cè)量透明圈直徑和菌落直徑的大小并記錄，取平均值，以HC為指標(biāo)，通過比較HC的大小進(jìn)行篩選，其中 HC= 透明圈直徑/菌落直徑。

產(chǎn)脂肪酶、蛋白酶試驗(yàn)[13]：挑取單菌落點(diǎn)接于鑒別培養(yǎng)基平板上，置于 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基菌落周圍是否出現(xiàn)明顯的透明圈，如有明顯的透明圈出現(xiàn)，說明該菌株能夠產(chǎn)蛋白酶或脂肪酶，具有分解脂類、蛋白質(zhì)大分子的能力。觀察透明圈，用直尺分別測(cè)量透明圈直徑和菌落直徑并記錄，取平均值，以HC為指標(biāo)，通過比較HC的大小進(jìn)行篩選，其中 HC= 透明圈直徑/菌落直徑。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SPSS25.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1醪糟中微生物的鑒定

2.1.1醪糟乳酸菌的鑒定

表1乳酸菌形態(tài)鑒定結(jié)果

注：“ + ”代表陽性反應(yīng)，“一”代表陰性反應(yīng)，表4同。

采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)牧區(qū)醪糟分離得到的優(yōu)勢(shì)乳酸菌進(jìn)行分離、純化。由表1和表2可知，牧區(qū)醪糟中分離得到3株優(yōu)勢(shì)乳酸菌。根據(jù)表1和表2中乳酸菌形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定的結(jié)果，查詢《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》并結(jié)合16SrRNA序列測(cè)序的同源性比對(duì)結(jié)果可知LZ1#、LZ2#、LZ5#為乳酪短桿菌。

2.1.2 醪糟中芽孢桿菌的鑒定

采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)燕麥醪糟中分離得到的芽孢桿菌進(jìn)行分離、純化。最終在牧區(qū)醪糟中得到3株優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌。3株芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)結(jié)果和生理生化鑒定結(jié)果見表3和表4。

根據(jù)芽孢桿菌形態(tài)學(xué)結(jié)果、生理生化鑒定結(jié)果，查詢《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》結(jié)合 序列測(cè)序的同源性比對(duì)結(jié)果可知LZ3#、LZ4#、LZ6#均為枯草芽孢桿菌。

2.2 醪糟分離菌耐熱性

耐高溫菌指在高于 45°C 的環(huán)境中能夠生長(zhǎng)和繁殖的微生物，其耐熱嗜熱、降解性能好、代謝效率高，在多領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。不同溫度下醪糟分離菌的生長(zhǎng)情況見表5。

表5不同溫度下醪糟分離菌的生長(zhǎng)情況

由表5可知，6株醪糟分離菌在 47，65^°C 下均能生長(zhǎng)，具有較好的耐熱性能；隨著培養(yǎng)溫度的升高，LZ1#、LZ2#、LZ4#、LZ5＃、LZ6＃菌落總數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；LZ3#菌落總數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；LZ4#在32，37，42，47℃下的菌落總數(shù)遠(yuǎn)高于其他菌株。

2.3 醪糟分離菌耐鹽性

表6不同鹽分下醪糟分離菌的生長(zhǎng)情況

Table6Growthofbacteria isolated fromfermented glutinous riceat different salt content

注：“一\"表示不生長(zhǎng)。

由表6可知，6株醪糟分離菌在不同鹽含量下的生長(zhǎng)情況不同， LZ1#，LZ2#，LZ5# 僅在鹽含量為2% 時(shí)生長(zhǎng)，LZ3#、LZ4#、LZ6#在鹽含量達(dá) 10% 時(shí)還能生長(zhǎng)，這3株醪糟分離菌具有較好的耐鹽性能； LZ6# 在不同鹽分下的菌落總數(shù)均高于其他菌株，其具有更好的耐鹽特性，可作為耐鹽發(fā)酵食品的發(fā)酵劑進(jìn)行開發(fā)[15]。

2.4醪糟分離菌的產(chǎn)酶特性

表7醪糟分離菌的產(chǎn)酶特性

注：“一\"表示不產(chǎn)相應(yīng)酶；同列不同小寫字母表示差異顯著（Plt;0.05） 。

由表7可知，LZ1#、LZ3#、LZ5#能夠產(chǎn)淀粉酶，具有水解淀粉的能力，LZ3#、LZ5#產(chǎn)淀粉酶的能力顯著高于LZ1#（ Plt;0.05） ；由于淀粉液化過程對(duì)淀粉酶的熱穩(wěn)定性要求極高，所以淀粉深加工的細(xì)菌源淀粉酶多數(shù)來自枯草芽孢桿菌，因此，結(jié)合LZ5#的耐熱性，其可作為細(xì)菌源淀粉酶的菌株，微生物源淀粉酶廣泛應(yīng)用于食品、淀粉改性等領(lǐng)域[16]。6株醪糟分離菌均能夠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶。 LZ3?，LZ6 #產(chǎn)蛋白酶的能力顯著高于其余菌株（ Plt;0.05） 。LZ1#產(chǎn)脂肪酶的能力最強(qiáng)，且顯著高于其余菌株（ （Plt;0.05） 。與動(dòng)植物源酶比較，微生物源酶類培養(yǎng)簡(jiǎn)便且易批量生產(chǎn)，具有成本低、效益高的優(yōu)勢(shì)，因此，6株醪糟分離菌依據(jù)其產(chǎn)酶特性可作為微生物源酶的產(chǎn)生菌。

3結(jié)論

本研究以牧區(qū)醪糟為微生物來源，進(jìn)行微生物的分離、純化、鑒定。從牧區(qū)醪糟中分離得到6株菌株，經(jīng)生理生化鑒定和16SrRNA分子生物學(xué)鑒定，LZ1#、LZ2#，LZ5 #為乳酪短桿菌， LZ3#，LZ4#，LZ6# 為枯草芽孢桿菌。利用菌落計(jì)數(shù)法觀察6株菌在不同鹽環(huán)境下和不同培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn) LZ3?，LZ4? 、LZ6#具有很強(qiáng)的耐鹽性，在 10% 的鹽環(huán)境下仍能夠保持生長(zhǎng)；6株菌均能在 65^°C 下生長(zhǎng)，具有耐熱性， LZ4? 的耐熱性更強(qiáng)。6株菌均能夠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶，能夠分解蛋白質(zhì)和脂類。LZ1#、LZ3#、LZ5#能夠產(chǎn)淀粉酶，具有水解淀粉的能力。因此，醪糟分離菌（LZ1#、LZ3?、LZ5?） 具有良好的耐熱性且其具有產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶的能力，3株醪糟分離菌有望開發(fā)成牧區(qū)醪糟專用發(fā)酵菌劑和酶制劑，為提高牧區(qū)醪糟純種發(fā)酵、品質(zhì)調(diào)控、產(chǎn)品開發(fā)提供菌種資源保障。

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