木犀草素通過NFE2L2/x-CT/GPX4信號軸調(diào)控ROS水平 抑制膠質(zhì)母細胞瘤

中圖分類號：R730.264 文獻標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20250608

Luteolin inhibits glioblastoma by regulating ROS levels via the NFE2L2/x-CT/GPX4 signalling axis

LIU Haiwei， YANG Jie， WANG Li，MENG Shibo，TANG Xusong，LIU Chengren，WANG Yongwang ， 541oo1， △Corresponding Author E -mail： wangyongwang81@126.com

Abstract： ObjectiveTo investigate therole luteolin （Lut） in regulating reactive oxygen species （ROS）levels throughnuclearfactorerythroid2-relatedfactor2（NFE2L2）/cystineglutamateantitransporter（x-CT）/glutathioneperoxidase 4（GPX4）signaling axis to inhibit the viability glioblastoma and promote apoptosis.MethodsU87 MGand U251 cels werecultured invitro.TheCCK-8assywasused todetectcellsurvivalratesafter48hours treatment withdifferent concentrations （0，6.25，12.5，25，50 and100 μmol/L ）Lut.Accordingto whether cellswere treated with Lut，cells were divided into the U87controlgroup，the U87Lut group，the U251 control group andthe U251Lut group.Thehalf-maximal inhibitory concentration （IC 50 ）at 48 hours was used as the unified treatment concentration for subsequent experiments.The apoptosis level celswasdetected byflow cytometrydouble staining method.Changes reactive oxygenspecies （ROS） levels in cells were detected by the DCFH-DA method.Molecular docking was conducted using AutoDock stware to verify the proteins related totheLutandoxidative stress pathway.Real-time fluorescence quantitative reverse transcription （RTqPCR）was used to detect the mRNA levels NFE2L2 and GPX4. The expression levels NFE2L2， X -CT and GPX4 proteins were detectedbyWesternblotassay.ResultsAfter U87MGand U251cells were treated withLutfor48 hours，the cell viabilitywassignificantlyinhibited，andwiththeincreaseLutconcentration，thecellviabilitydecreased（ Plt;0.05 ）

Compared with the U87controlgroupandthe U251control grouprespectively，theapoptosisratecelsincreased inthe U87Lutgroupandthe U251Lutgroup，the green fluorescence intensitywasenhanced，and the intracellularROS levelwas upregulated （ Plt;0.05 ）.Results molecular docking showed that Lut was tightly bound to NFE2L2， X -CT and GPX4. The results RT-qPCR and Western blot assay showed thatcompared withthe U87control group and the U251 control group respectively，the protein and mRNA levels NFE2L2andGPX4 incels the U87Lut groupand the U251Lut group，as well as the expression level X -CT protein，decreased Plt;0.05 ）. ConclusionLut regulates ROS levels through the NFE2L2 τ_X -CT/GPX4 signaling axis to inhibit the viability glioblastoma and promote cel apoptosis.

Keywords：glioblastoma;Luteolin;reactiveoxygenspecies;NF-E2-related factor2；phospholipidhydroperoxide glutathione peroxidase; apoptosis; GPX4

膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是一種具有高度侵襲性和致命性的原發(fā)性腦腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的 81%^[1] 。GBM與正常腦組織沒有明顯的界限，手術(shù)難以完全切除[2]。且GBM對一線治療藥物易產(chǎn)生耐藥性，復(fù)發(fā)率高，治療困難[3-4]。活性氧（ROS）是由細胞正常代謝產(chǎn)生的高活性分子，具有“雙刃劍\"的作用。一方面，ROS對維持生物穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，是信息傳輸、信號傳導(dǎo)、免疫和防御以及發(fā)育的關(guān)鍵[5。另一方面，細胞內(nèi)過量的ROS積累可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和氧化應(yīng)激，進而引發(fā)慢性炎癥，激活致癌信號通路，并觸發(fā)ROS依賴性細胞死亡信號。核因子紅細胞2相關(guān)因子2（NFE2L2）作為氧化調(diào)節(jié)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過激活線粒體相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子2（AIFM2，又稱FSP1）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）和胱氨酸-谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白（ （x-CT） 等下游靶點，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原平衡，抵御氧化損傷。GPX4通過阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)揮抗氧化作用，血紅素加氧酶1（HO-1）通過生成具有抗氧化和抗炎特性的產(chǎn)物來維持細胞穩(wěn)態(tài)，這些機制在癌癥、神經(jīng)退行性疾病及心血管疾病中發(fā)揮重要作用7]。木犀草素（Luteolin，Lut）是一種天然黃酮類化合物，存在于菠菜、紅薯葉等常見的蔬菜、水果和中藥中[8]。Lut具有親脂性，能夠穿越血腦屏障[9]。Lut具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎、保護神經(jīng)等作用，并且被證明具有多種抗癌特性。Lut還可通過調(diào)控氧化應(yīng)激在乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌中發(fā)揮抗癌作用[10]。然而，Lut在GBM中的相關(guān)研究較為有限。本研究采用具有代表性的GBM細胞系U87MG和U251，探討Lut對GBM細胞生物學(xué)行為的影響及其對氧化應(yīng)激水平的調(diào)控作用，并探討其對NFE2L2/σ_X. -CT/GPX4信號通路的調(diào)節(jié)機制。

1材料與方法

1.1試劑與儀器人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87MG和U251購自武漢普諾賽生命科技有限公司； 試劑盒購自美國GLPBIO公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國HyClone公司；ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；AnnexinV-APC/7-AAD雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物有限公司；兔抗人 σ_X. -CT、GPX4抗體購自上海泊灣生物科技有限公司；兔抗人NFE2L2、GAPDH，羊抗兔IgG二抗購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；RNA提取柱試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；酶標(biāo)儀、SDS-PAGE微型凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備購自美國BioRad公司；熒光倒置顯微鏡購自德國蔡司公司。

1.2細胞培養(yǎng)將處于對數(shù)生長期的U87MG和U251培養(yǎng)于含有 10% 胎牛血清， 1% 硫酸鏈霉素和青霉素（P/S）的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37 'C，5%CO₂ 的細胞培養(yǎng)箱，保持適當(dāng)濕度，培養(yǎng)至細胞融合度達到 80% 予以 Lut 處理。

1.3CCK-8法檢測細胞活力將U87MG和U251兩種細胞以 2.5×10³ 個/孔接種到96孔板中，每孔 100μL_ρ 。過夜貼壁后使用梯度濃度 ut分別處理2種細胞，每種濃度設(shè)置3個復(fù)孔。分別培養(yǎng)48h后，每孔加入CCK-8溶液 10μL ，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 1.5h ，使用酶標(biāo)儀測量各孔于波長 450nm 的光密度（OD）值。細胞存活率 （2 ，計算 48h 的半數(shù)抑制濃度 （IC₅₀） 。將 IC₅₀ 作為后續(xù)實驗濃度。使用非線性回歸分析擬合劑量-反應(yīng)曲線。根據(jù)細胞是否使用 Lut 處理，分為U87Control組和U87Lut組，U251Control組和U251Lut組。

1.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡將各組細胞以 8×10⁴ 個/孔接種至6孔板中，過夜貼壁后使用 50μmol/LLut 處理 48h ，胰酶消化后收集細胞，PBS緩沖液洗滌2次，加入 5μL AnnexinV-APC和 5μL 7-AAD染液，室溫、避光、孵育 10min 后進行流式細胞儀檢測。

1.5細胞內(nèi)ROS水平檢測收獲對數(shù)生長期細胞，培養(yǎng)過夜使其貼壁，用 50μmol/L 濃度的 Lut 處理2種細胞 48h 加入無血清培養(yǎng)基和DCFH-DA工作液，避光孵育 30min ，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞2次后使用倒置熒光顯微鏡拍攝熒光圖，根據(jù)綠色熒光強度檢測細胞ROS水平。

1.6藥物-關(guān)鍵靶點分子對接在PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）搜索Lut的3D化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，使用OpenBabel3.0軟件將其轉(zhuǎn)化為PDB格式。從PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載目標(biāo)靶蛋白質(zhì) σ_X -CT、GPX4、NFE2L2的3D結(jié)構(gòu)，通過PyMOL軟件去除水分子和小分子配體，使用AutoDock軟件進行分子對接，使用PyMOL軟件對結(jié)果進行可視化分析。

1.7實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測mRNA水平收集各組細胞，使用柱式法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行PCR擴增，引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系 （20μL） ：ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix 10.0μL ，上、下游引物（ 10μmol/L 各0.4μL ，cDNA 1.0μL ddH₂ 補至 20μL 反應(yīng)程序： 95°C 預(yù)變性 10min ；95℃變性 20s，60^°C 退火/延伸 40s ，共42個循環(huán)。檢測NFE2L2、GPX4相對表達量，歸一化為GAPDH采用2^-ΔΔCt 法進行相對定量分析，引物序列見表1。

1.8Westernblot法檢測各組細胞NFE2L2 ?_?X^? -CT、GPX4蛋白表達水平收集經(jīng) 50μmol/L Lut處理 ^48h 的U87MG和U251細胞，充分裂解后1 2 000×_g，4 C離心 15min ，采用BCA蛋白定量后煮沸變性。等質(zhì)量（ 30μg/ 孔）上樣，電泳后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜， 5% 脫脂奶粉室溫封閉 2h 將PVDF膜與兔屬一抗NFE2L2 ?_X -CT、GPX4（1：1000），GAPDH（1：50000）4℃孵育過夜，TBST洗滌，二抗 （1：20000） 孵育，TBST洗滌，ECL發(fā)光顯色，用ImageJ分析蛋白條帶灰度值，以目的與內(nèi)參條帶灰度值的比值計算目的蛋白的相對表達量。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法采用GrapdPadPrism10.1.2進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計量資料以 表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗， Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Lut對細胞活力的影響CCK-8結(jié)果顯示，0、 Lut處理的U87MG細胞存活率 （% ）分別為 100.00±0.84 / 103.67±1.61 、105.59±3.75.96.32±2.40.55.43±0.97 和 24.34±1.46 ，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （n=3，F(xiàn)=451.200，Plt; 0.01）；U251細胞存活率 （%） 分別為 100.00±2.18 ）95.54±0.41 、 90.32±1.86 、 73.51±1.43 、 48.70±1.30 35.12±3.49 ，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （n=3，F(xiàn)= 324.700， Plt;0.01 ）。Lut可抑制U87MG和U251細胞活力，且呈劑量依賴性。

2.2Lut對U87MG和U251細胞凋亡、ROS水平和各基因表達的影響流式細胞術(shù)分析顯示，分別與U87Control組和U251Control組相比，U87Lut組和U251Lut 組細胞凋亡率升高 （Plt;0.05 ，見圖1、表2。ROS檢測結(jié)果表明，分別與U87Control組和U251Control組相比， U87Lut 組和 U251Lut 組綠色熒光強度增強，細胞內(nèi)ROS水平上調(diào) （Plt;0.05 ，見圖2、表2。RT-qPCR結(jié)果顯示，分別與U87Control組和U251Control組相比， U87Lut 組和U251Lut組NFE2L2和 GPX4mRNA 表達水平下降，見表2。

2.3Lut與x-CT、GPX4、NFE2L2蛋白表達的分子對接情況Lut與x-CT、GPX4、NFE2L2靶蛋白的結(jié)合能分別為 -6.469?-8.657?-6.632kJ/mol ，結(jié)合緊密，其分子對接模式見圖3。

2.4Lut對U87MG和U251細胞NFE2L2、 GPX4，x- CT蛋白表達的影響Westernblot結(jié)果顯示，分別與U87Control組和U251Control組比較， U87Lut 組和U251Lut組細胞NFE2L2、GPX4 ?_?X -CT蛋白表達水平降低 （Plt;0.05 ，見表3、圖4。

3討論

目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的抗癌藥物中超過 50% 是天然膳食中提取的衍生物，使用含有天然活性成分的藥物逐漸成為治療癌癥的一種安全、有效的方法[1I-12]。Lut作為天然植物成分，在胃癌、乳腺癌等多種癌細胞中表現(xiàn)出抗癌作用[13]。本研究中，選擇Lut作用于具有代表性的膠質(zhì)瘤細胞系U87MG和 U25148h 的平均 IC₅₀"值50μmol/L 作為后續(xù)實驗統(tǒng)一處理的濃度。Yang等[14]研究發(fā)現(xiàn)Lut可抑制膽管癌細胞 Wnt 信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進細胞凋亡并抑制細胞遷移。與既往研究結(jié)果一致，本研究中Lut可抑制GBM細胞活力，促進細胞早期凋亡比例的增加，表明Lut不僅能有效抑制細胞活力，還可誘導(dǎo)細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

細胞內(nèi)源性（線粒體、各種氧化酶等）或外源性（環(huán)境、某些藥物等）產(chǎn)生的ROS升高會破壞氧化還原信號傳導(dǎo)平衡，造成生物分子（DNA、蛋白質(zhì)、膜）的損害，即氧化應(yīng)激（OS）[15]。OS是癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等多種疾病的病理因素[16]。由于遺傳突變和各種信號通路失調(diào)等復(fù)雜原因，癌細胞通常具有比正常細胞更高水平的 ROS^[17] 。ROS的升高可使癌細胞比正常細胞更早達到氧化應(yīng)激閾值，誘導(dǎo)癌細胞死亡。因此，能夠引起癌細胞ROS水平升高的天然成分，可對癌細胞產(chǎn)生靶向治療作用。如泰國姜提取物可通過引起卵巢癌細胞ROS水平增高，激活胱天蛋白酶（Caspase）-3和Caspase-9誘導(dǎo)細胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用，而使用抗氧化劑可逆轉(zhuǎn)這種作用[18]。大豆素（Daidzein）可引發(fā)乳腺癌MCF-7細胞內(nèi)ROS升高，導(dǎo)致線粒體功能障礙，誘導(dǎo)細胞凋亡[19]

Lut在正常細胞中表現(xiàn)為抗氧化性質(zhì)，其在一些惡性腫瘤細胞中表現(xiàn)出促氧化作用，可能與癌細胞基因組變異相關(guān)[20]。李歡等[2I]研究發(fā)現(xiàn)，Lut處理可顯著增加肺癌A549細胞內(nèi)ROS的水平，下調(diào)抗氧化物蛋白HO-1的表達，誘發(fā)細胞凋亡和自噬。Zheng等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Lut可促進結(jié)腸癌細胞ROS的過量產(chǎn)生，降低細胞的抗氧化反應(yīng)能力，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化物發(fā)生，引起癌細胞鐵死亡。Wang等23]發(fā)現(xiàn)ROS生成和積累有助于抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖，從而靶向治療膠質(zhì)瘤。與上述研究結(jié)果類似，本研究中Lut處理后GBM細胞ROS水平顯著升高。因此，筆者推測Lut對GBM的抑制作用可能是通過ROS異常積累導(dǎo)致的。

細胞存在復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng)，該系統(tǒng)由酶促抗氧化劑以及低分子抗氧化劑構(gòu)成（如GSH/GPX4、CoQ10/FSP1），它們協(xié)同作用以平衡OS水平[24-25]NFE2L2是一種調(diào)節(jié)抗氧化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它可激活下游抗氧化蛋白，包括HO-1、 σ_X. -CT、GPX4和AIFM2，清除過量產(chǎn)生的ROS，發(fā)揮抗氧化作用。抑制NFE2L2會導(dǎo)致其無法正常激活下游抗氧化基因的表達，致使細胞的抗氧化能力下降，細胞內(nèi)ROS水平升高。Tang等26發(fā)現(xiàn)Lut可有效抑制NFE2L2的激活，提高A549細胞對抗癌藥物阿霉素等的敏感性。GPX4是一種重要的抗氧化酶，而x-CT負責(zé)谷氨酸和半胱氨酸的交換，對維持細胞內(nèi)谷胱甘肽水平和抗氧化能力同樣重要。分子對接結(jié)果的結(jié)合能越低，提示受體和配體之間的親和力越高。一般認為，結(jié)合能 lt;-5.0kJ/mol 表明二者有較好的結(jié)合活性。本研究分子對接結(jié)果表明Lut和3個核心蛋白形成的構(gòu)象能量低，結(jié)合性良好，篩選結(jié)果可靠，Lut與抗氧化相關(guān)蛋白（NFE2L2 ，x -CT、GPX4）可自發(fā)結(jié)合，提示它們可能是Lut發(fā)揮作用的靶點。本研究中，經(jīng)Lut處理后GBM細胞中NFE2L2、 ?_X??_X? -CT、GPX4的表達水平降低?？寡趸鞍椎臏p少削弱了細胞的抗氧化防御能力，導(dǎo)致細胞對ROS的耐受性降低，從而抑制了癌細胞增殖并促進了癌細胞凋亡。

綜上所述，Lut可誘導(dǎo)U87MG和U251細胞ROS水平升高，調(diào)控氧化相關(guān)NFE2L2/x-CT/GPX4通路，促進膠質(zhì)瘤U87MG和U251細胞的凋亡并抑制其增殖。本研究為開發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤新的治療策略提供了理論依據(jù)。Lut作為一種天然植物成分，具有較好的生物相容性和較低的毒性，在未來的臨床應(yīng)用中具有潛在的優(yōu)勢。但本研究僅在體外實驗驗證了氧化應(yīng)激的作用，未涵蓋其可能的下游機制，如鐵死亡、線粒體自噬、壞死性凋亡等，這些機制的闡明將在后續(xù)實驗中進行。另外，后續(xù)還需進行體內(nèi)實驗，利用基因敲降或過表達技術(shù)，進一步驗證Lut在體內(nèi)的抗癌效果。

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