YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白2對(duì)亞砷酸鈉誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響

中圖分類號(hào)：R114文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-503X（2025）03-0333-10

DOI：10.3881/j. issn. 1000-503X. 16246

Effect of YTH Domain Family Protein 2 on the Sodium Arsenite-Induced Malignant Transformation ofSkin Cells

XIONG Wenxiao，ZHAO Tianhe，LONG Keyan， ZHANG Zunzhen

Department of Occupational Health and Environmental Hygiene，West China School of Public Health and WestChina FourthHospital，SichuanUniversity，Chengdu61OO41，China

Corresponding author：ZHANG ZunzhenTel：O28-855O1298，E-mail：zhangzunzhen@163.com

ABSTRACT： ObjectiveTo investigate the effect of liquid-liquid phase separation （LLPS）of YTH domain family protein 2（YTHDF2）on the sodium arsenite-induced malignant transformation of skin cells，providinganew intervention target for thepreventionand control ofsodiumarsenite-inducedcarcinogenesis.MethodsThe HaCaT cell model of malignant transformation was constructed by continuous treatment with

1 μmol/L sodium arsenite for 22 weeks， including cells with normal YTHDF2 LLPS （YTHDF2-wt） and cells with inhibited YTHDF2 LLPS（YTHDF2- mut）. Confocal microscopy was employed to observe and characterize the LLPS droplets formed byYTHDF2 during sodiumarsenite-induced malignant transformationof skin cells.Cell proliferation，scratch healing，and colony formation assayswere performed to detect malignant phenotypes.Western blotting，quantitative reverse transcription PCR，and immunofluorescence experiments were conducted to examine the efects of YTHDF2 LLPSon the mRNA and protein levels of phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten（PTEN）during sodium arsenite-induced malignant transformation of skin cels. ResultsAfter 4 weeks of sodium arsenite treatment，LLPS droplets of YTHDF2 appeared in YTHDF2-wt cells，and the number of droplets gradually increased as the treatment time was prolonged（ F=35.252 ， Plt; 0.001），while no phase-separated droplets were observed in YTHDF2-mut cels. Compared with YTHDF2-mut cells，YTHDF2-wt cells showed enhanced proliferation at the time points of ^f48h（t=3.654，P=0.006） and 72 h （ t=5.458 ， Plt;0.001 ）after 22 weeks of sodium arsenite treatment.The scratch healing rate of YTHDF2- wt cells was increased at the 8th （ t=12. 137 ， Plt;0.001 ）and 22th （ t=4.484 ， P=0.011 ）weeks of sodium arsenite treatment.The number of colonies formed by YTHDF2-wt cels was higher at the 4th（ t=3.365 ， （204 P=0.027 ），8th（ t=5.580 ，P=0.005），and 22th（ t=3.328，P=0.029， ）weeks of sodium arsenite treatment. Compared with YTHDF2-mut cells，YTHDF2-wt cells showed down-regulated protein （ t=-3.119 ！ P= 0.036）and mRNA（ t=4.051，P=0.015， ）levels of PTEN after 22 weeks of sodium arsenite treatment. Immunofluorescence results showed that after4 weeks of sodium arsenite treatment，YTHDF2LLPS droplets in YTHDF2-wt cells were localized to stress granules， translation-related membrane-less organeles. Conclusions During sodium arsenite-induced malignant transformation of skin cells，YTHDF2 undergoes LLPS and localizes to stress granules，translation-related membrane-less organelles.YTHDF2 LLPS participates insodiumarsenite-induced malignant transformation of skin cels by down-regulating the mRNA level of the key tumor suppressor PTEN.

Key words：YTH domain family protein2；phase separation；phosphatase and tensinhomolog deletedon chromosome en；sodium arsenite；malignant transformation

ActaAcadMedSin，2025，47（3）：333-342

砷是廣泛分布于自然界的非金屬元素，主要以三價(jià)砷或五價(jià)砷等無機(jī)態(tài)形式存在于土壤和水體中，其中三價(jià)砷（如亞砷酸鹽）毒性最大[1-2]。我國存在多個(gè)地方性砷中毒病區(qū)，當(dāng)?shù)鼐用衩媾R長期砷暴露的健康風(fēng)險(xiǎn)[3]。皮膚是碑中毒的主要靶器官[4]，長期低劑量砷暴露與非癌性皮膚病變及皮膚基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率增加有關(guān)[5]。國際癌癥研究中心早在2004年已將無機(jī)砷認(rèn)定為I類致癌物[6。砷誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及致癌的機(jī)制復(fù)雜，以往的研究未能在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)層面闡明生物大分子如何精細(xì)調(diào)控砷導(dǎo)致的皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程。近幾年發(fā)現(xiàn)的生物大分子液-液相分離（liquid-liquid phase separation，LLPS）為深入探究砷誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制開辟了新思路。

LLPS是指細(xì)胞內(nèi)生物大分子之間相互碰撞、融合形成液滴的相分離過程[7]。具有內(nèi)在無序區(qū)的蛋白質(zhì)易通過分子間的相互作用聚集形成液滴狀凝聚體[8]而干擾蛋白質(zhì)內(nèi)在無序區(qū)序列則可以有效抑制LLPS的發(fā)生[9]。LLPS形成的凝聚體可以募集翻譯相關(guān)因子干預(yù)mRNA的翻譯過程，在癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[10]。第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometen，PTEN）是磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（proteinkinaseB，AKT）信號(hào)通路上游的關(guān)鍵抑制因子，YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白2（YTHdomainfamilyprotein2，YTHDF2）通過調(diào)控PTEN的表達(dá)水平影響PI3K/AKT信號(hào)通路的激活[11]。YTHDF2序列存在內(nèi)在無序區(qū)[12]，具備發(fā)生LLPS的必要條件[8]PTENmRNA具有多個(gè)N6-甲基腺苷（N6-methylade-nosine， m⁶A ）位點(diǎn)[11]，YTHDF2 可以識(shí)別并結(jié)合發(fā)生 m⁶A 修飾的mRNA 進(jìn)一步觸發(fā)LLPS[13-14]，并定位于與翻譯相關(guān)的無膜細(xì)胞器應(yīng)激顆粒中[13，15-16]。由此可以推測YTHDF2LLPS可能通過干預(yù)PTEN的翻譯過程，降低細(xì)胞內(nèi)PTEN含量，并激活PI3K/AKT信號(hào)通路，從而影響細(xì)胞的增殖、代謝及細(xì)胞周期等過程，最終促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。因此，本研究通過構(gòu)建亞砷酸鈉誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型，觀察YTH-DF2LLPS對(duì)細(xì)胞惡性表型、PTEN水平及翻譯率的影響，深入探索YTHDF2LLPS在亞砷酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1 材料

人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT購自南京開集生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基購自塞維爾生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，亞砷酸鈉購自瑞士Fluka化學(xué)試劑公司，CCK-8試劑盒購自伊萊瑞特生物科技股份有限公司，PTEN一抗購自英國Abcam公司，G3BP1一抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞總RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京擎科生物科技股份有限公司。 AlR+ 激光共聚焦顯微鏡購自日本尼康公司，凝膠成像系統(tǒng)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1. 2 細(xì)胞株構(gòu)建與培養(yǎng)

1. 2. 1 細(xì)胞株構(gòu)建

采用慢病毒構(gòu)建綠色熒光蛋白標(biāo)記的YTHDF2野生型HaCaT細(xì)胞系（YTHDF2-wt）和綠色熒光蛋白標(biāo)記的YTHDF2突變型HaCaT細(xì)胞系（YTHDF2-mut），其中突變體是通過將YTHDF2內(nèi)在無序區(qū)（aa230-383）的谷氨酰胺（Q）替換為丙氨酸（A）而獲得。具體構(gòu)建方法參照本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的文章[17]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

細(xì)胞采用含 10% 胎牛血清的DEME培養(yǎng)基，置于37^qC ！ 5% （2 CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用 1μmol/L 亞砷酸鈉連續(xù)處理YTHDF2-mut及YTHDF2-wt細(xì)胞1（未轉(zhuǎn)化）、4（可能早期轉(zhuǎn)化）、8（早期轉(zhuǎn)化）、22周（惡性轉(zhuǎn)化），建立亞砷酸鈉誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型。

1.3 細(xì)胞LLPS檢測

1.3.1激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞LLPS

將適量細(xì)胞接種于 35mm 直徑玻璃底共聚焦培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到 50%～70% 。在激光共聚焦顯微鏡 488nm 激發(fā)光下觀察并拍攝圖片。采用NIS-Elements軟件、ImageJ軟件分析處理圖像。

1.3.2熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測YTHDF2蛋白顆粒流動(dòng)性

采用配備熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)?zāi)K的激光共聚焦顯微鏡選擇細(xì)胞中高熒光強(qiáng)度YTHDF2蛋白顆粒，設(shè)置100% 功率的 488nm 激光漂白細(xì)胞中的高熒光強(qiáng)度顆粒 15s ，并采用NIS-Elements軟件記錄熒光猝滅區(qū)域漂白后200s圖像及熒光強(qiáng)度。

1.4 細(xì)胞惡性表型檢測

1.4.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力

將細(xì)胞（ 2×10³ 個(gè)/孔）接種于96孔板中，分別培養(yǎng)0、24、48、 ^72h 后，PBS沖洗，每孔加入 100μL 含 10μL CCK-8溶液的無血清DEME培養(yǎng)基， 37^qC 避光孵育 1.5h 。采用酶標(biāo)儀測量 450nm 波長處吸光度，并以培養(yǎng) ^0h 組的吸光度為基準(zhǔn)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.4.2劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

將適量細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至100% 融合度后，使用無菌 200μL 槍頭垂直劃線，更換無血清DEME培養(yǎng)基，培養(yǎng)0、 36h 后在同一位置拍照記錄。采用ImageJ軟件計(jì)算劃痕面積，以培養(yǎng)0h的劃痕面積為基準(zhǔn)計(jì)算劃痕愈合率。

1.4.3平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力

將細(xì)胞 （ 2×10³ 個(gè)/孔）接種于6孔板中，連續(xù)培養(yǎng) 14d 。加入 4% 多聚甲醛室溫固定 20min 、 1% 結(jié)晶紫染液室溫染色 15min ，PBS沖洗后拍照記錄。計(jì)算大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.5蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測PTEN含量

根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入適量含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒進(jìn)行總蛋白濃度定量。各組蛋白樣品（ 25μg ）經(jīng)過 10% SDS-PAGE分離后，通過濕式電轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。 5% 脫脂牛奶室溫下封閉PVDF膜 2h 后，將膜與一抗置于 環(huán)境下孵育過夜，清洗后加入二抗室溫孵育1.5h ，最后在膜上均勻滴加ECL發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參比較目的蛋白表達(dá)水平。

1.6細(xì)胞免疫熒光檢測YTHDF2蛋白LLPS液滴與應(yīng)激顆粒定位

以應(yīng)激顆粒核心成分G3BP1蛋白作為指示物，檢測YTHDF2蛋白形成的顆粒是否定位于應(yīng)激顆粒中。將細(xì)胞接種于 35mm 玻璃底共聚焦培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá) 50%～70% 。依次使用 4% 多聚甲醛室溫固定 20min 、 0.5% TritonX-100通透 15min 、 10% 山羊血清（溶于 1×PBS ）封閉 ¹h 。隨后加入 1：80 G3BP1一抗 4‰ 孵育 ^12h ，再加入抗兔二抗室溫避光孵育 ¹h ，使用DAPI染液室溫避光染色 8min ，最后滴加抗熒光淬滅封片液封片保存。在激光共聚焦顯微鏡405、488、 590nm 激發(fā)光下拍攝圖片，采用ImageJ軟件分析YTHDF2蛋白顆粒與G3BP1蛋白共定位情況。

1.7定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測PTENmRNA起始密碼子翻譯率

采用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測PTENmRNA起始密碼子（ATG）翻譯率[18]。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入適量含有蛋白酶抑制劑的Trizol裂解液、氯仿、冰乙醇等提取細(xì)胞總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBRgreen試劑進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄PCR分析。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件： 95°C 預(yù)變性60s ， 95^°C 變性 10s ， 60^°C 退火延伸 30s ，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH蛋白作為內(nèi)參，采用 2^-ΔΔCt 法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS26.0軟件，經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本 χ_t 檢驗(yàn)，不同時(shí)間點(diǎn)多組間比較采用重復(fù)測量方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法檢驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。雙側(cè) Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 YTHDF2蛋白LLPS表征

亞砷酸鈉處理4周前，YTHDF2-wt與YTHDF2-mut細(xì)胞的YTHDF2蛋白均勻分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。亞砷酸鈉處理4周后，YTHDF2-wt細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)YTHDF2蛋白LLPS液滴，且液滴數(shù)隨著亞砷酸鈉處理時(shí)間的延長逐漸增多（ F=35.252 ， Plt;0.001 ）；而YTHDF2-mut細(xì)胞沒有觀察到LLPS液滴（圖1）。熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證亞砷酸鈉處理YTHDF2-wt細(xì)胞過程中形成的YTHDF2蛋白凝聚顆粒是否具有LLPS的特性，結(jié)果顯示，亞砷酸鈉處理4、8、22周的YTHDF2-wt細(xì)胞內(nèi)的YTHDF2蛋白顆粒在經(jīng)過激光漂白處理后，熒光強(qiáng)度在200s 內(nèi)恢復(fù)至漂白前熒光強(qiáng)度的 20% 以上（圖2）。

2.2YTHDF2蛋白LLPS在亞砷酸鈉誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中對(duì)細(xì)胞惡性表型的影響

2.2.1YTHDF2蛋白LLPS對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，亞砷酸鈉處理0、1、4、8周時(shí)，YTHDF2-wt與YTHDF2-mut細(xì)胞的增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P 均 gt;0.05 ）；亞砷酸鈉處理22周時(shí)，YTHDF2-wt細(xì)胞在48（ t=3.654 ， P= 0.006）、 ^72h （ t=5.458 ， Plt;0.001 ）的增殖率顯著高于YTHDF2-mut細(xì)胞（圖3）。

表1PCR引物序列

注：PTEN：第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物

YTHDF2：YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白2；YTHDF2-wt：YTHDF2野生型 HaCaT細(xì)胞系；YTHDF2-mut：YTHDF2突變型 HaCaT細(xì)胞系 A．激光共聚焦圖像顯示YTHDF2-wt細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)YTHDF2蛋白液滴（箭頭）；B.YTHDF2蛋白液滴數(shù)的定量分析 圖1不同亞砷酸鈉處理時(shí)間對(duì)YTHDF2- Δ_wt 與YTHDF2-mut細(xì)胞YTHDF2蛋白的影響

A.激光共聚焦圖像顯示YTHDF2蛋白液滴漂白區(qū)域（紅框）；B.熒光強(qiáng)度的定量分析圖2不同亞砷酸鈉處理時(shí)間YTHDF2-wt細(xì)胞內(nèi)YTHDF2蛋白液滴漂白后熒光強(qiáng)度恢復(fù)情況

圖3不同亞砷酸鈉處理時(shí)間對(duì)YTHDF2-wt與YTHDF2-mut細(xì)胞增殖能力的影響

2.2.2 YTHDF2蛋白LLPS對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，亞砷酸鈉處理8、22周時(shí)，YTHDF2-wt細(xì)胞 36h 的劃痕愈合率分別是未進(jìn)行亞砷酸鈉處理的1.92倍和2.10倍，且顯著高于相應(yīng)處理時(shí)間的YTHDF2-mut細(xì)胞的劃痕愈合率（ t=12.137 ， Plt;0.001 ； t=4.484 ， P=0.011 ）（圖4）。

2.2.3YTHDF2蛋白LLPS對(duì)細(xì)胞克隆形成的影響

細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，亞砷酸鈉處理4（ t=3.365 ， P=0.027 ）、8（ t=5.580 ， P=0.005 ）、22周（ t=3.328 ， P=0.029 ）時(shí)的YTHDF2-wt細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著高于YTHDF2-mut細(xì)胞（圖5）。

A.不同亞砷酸鈉處理時(shí)間的劃痕愈合圖像；B.細(xì)胞劃痕愈合率的定量分析圖4不同亞砷酸鈉處理時(shí)間對(duì)YTHDF2- Δ_wt 與YTHDF2- 細(xì)胞遷移能力的影響

2.3YTHDF2蛋白LLPS在亞砷酸鈉誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中對(duì)PTEN表達(dá)的影響

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著亞砷酸鈉處理時(shí)間的延長，YTHDF2-wt細(xì)胞（ F=14.858 ， Plt;0.001 ）

和YTHDF2-mut細(xì)胞（ F=6.435 ， P=0.013 ）的PTEN表達(dá)均降低。亞砷酸鈉處理22周時(shí)，YTHDF2-wt細(xì)胞內(nèi)的PTEN表達(dá)顯著低于YTHDF2-mut細(xì)胞（ t= -3.119， P=0.036 ）（圖6）。

A.不同亞砷酸鈉處理時(shí)間的平板克隆圖像；B.克隆形成數(shù)的定量分析圖5不同亞砷酸鈉處理時(shí)間對(duì)YTHDF2-wt與YTHDF2- 細(xì)胞克隆形成能力的影響

A.蛋白免疫印跡圖；B.PTEN蛋白表達(dá)的定量分析圖6不同亞砷酸鈉處理時(shí)間對(duì)YTHDF2-wt與YTHDF2- 細(xì)胞PTEN表達(dá)的影響

Mr ：相對(duì)分子質(zhì)量

2.4YTHDF2蛋白LLPS在亞砷酸鈉誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中對(duì)PTENmRNA翻譯的影響

定量逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，亞砷酸鈉處理8、22周時(shí)，YTHDF2-wt細(xì)胞內(nèi)PTENmRNA起始密碼子（ATG）的翻譯率顯著低于YTHDF2-mut細(xì)胞（ t= 3.320， P=0.029 ； t=4.051 ， P=0.015 ）（圖7）。

圖7不同亞砷酸鈉處理時(shí)間對(duì)YTHDF2-wt與YTHDF2-mut細(xì)胞PTENmRNA翻譯的影響

2.5亞砷酸鈉誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中YTH-DF2蛋白LLPS液滴的定位

免疫熒光結(jié)果顯示，亞砷酸鈉處理4、8、22周時(shí)，YTHDF2-wt細(xì)胞中YTHDF2蛋白LLPS液滴與應(yīng)激顆粒的標(biāo)志蛋白G3BP1熒光強(qiáng)度分布曲線存在顯著相關(guān)性（ P 均 lt;0.001 ）（圖8）。

3討論

多項(xiàng)研究顯示，使用高濃度亞砷酸鈉（ ?0.5mmol/L ）處理后， m⁶A 修飾的mRNA驅(qū)動(dòng)YTHDF2蛋白快速（ 30～60min ）發(fā)生 LLPS[13，15-16]。但這些研究更關(guān)注亞砷酸鈉誘導(dǎo)YTHDF2蛋白LLPS的條件，并且采用的亞砷酸鈉濃度遠(yuǎn)高于地方性砷中毒病區(qū)人群的實(shí)際暴露水平，亞砷酸鈉處理時(shí)間也較短，不能反映人群實(shí)際暴露條件下YTHDF2蛋白是否發(fā)生LLPS、是否參與亞砷酸鈉誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化或皮膚癌的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，亞砷酸鈉持續(xù)處理4周后YTHDF2蛋白形成LLPS液滴，且隨著亞砷酸鈉處理時(shí)間的延長，YTHDF2蛋白LLPS液滴數(shù)也逐漸增多；此外，在干預(yù)YTHDF2蛋白LLPS后，逆轉(zhuǎn)了亞砷酸鈉誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞的惡性表型，提示YTHDF2蛋白LLPS參與了亞砷酸鈉誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程。

A.免疫熒光圖顯示YTHDF2-wt細(xì)胞內(nèi)YTHDF2蛋白（綠色熒光）、應(yīng)激顆粒標(biāo)志蛋白G3BPI（紅色熒光）與細(xì)胞核（藍(lán)色熒光）的定位情況；B.熒光強(qiáng)度的定量分析圖8不同亞砷酸鈉處理時(shí)間YTHDF2-wt細(xì)胞中YTHDF2蛋白與應(yīng)激顆粒的定位情況

生物大分子LLPS在細(xì)胞生命活動(dòng)的各個(gè)方面發(fā)揮著重要作用，LLPS具有在特定空間內(nèi)富集生化反應(yīng)的成分增加反應(yīng)效率[19]，隔離分子使其失活或抑制反應(yīng)及招募特定蛋白質(zhì)，RNA定位至已存在的LLPS顆?；驘o膜細(xì)胞器[8]等生物學(xué)作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠精子發(fā)生后期，脆性X相關(guān)家族的FXR1表達(dá)顯著增加，發(fā)生LLPS形成顆粒，富集EIF4G3等翻譯起始因子，激活mRNA翻譯，從而促進(jìn)精子形成所需蛋白的合成，保障精子發(fā)育[9]。本研究結(jié)果顯示，抑制YTHDF2蛋白LLPS可以有效阻止亞砷酸鈉誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中PTEN含量的降低，促進(jìn)PTENmRNA翻譯，并且YTHDF2蛋白LLPS液滴定位于與翻譯相關(guān)的無膜細(xì)胞器應(yīng)激顆粒中，提示YTH-DF2蛋白可能通過LLPS募集翻譯抑制因子抑制PTENmRNA的翻譯，并在轉(zhuǎn)錄后下調(diào)PTEN蛋白的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)在亞砷酸鈉誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，YTHDF2蛋白LLPS促進(jìn)了細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，并且由于LLPS凝聚物的形成是一個(gè)可逆的、受到多種小分子精準(zhǔn)調(diào)控的過程[20]，因此，通過小分子藥物干預(yù)YTHDF2蛋白LLPS有望成為防治亞砷酸鈉所致皮膚癌的新策略。LLPS過程依賴于生物大分子間的相互作用，在亞砷酸鈉的刺激下，mRNA上形成多個(gè) m⁶A 修飾位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)YTHDF2蛋白與發(fā)生 m⁶A 位點(diǎn)修飾的mRNA結(jié)合，發(fā)生 LLPS^[21] 。最新研究發(fā)現(xiàn)，小分子化合物DC-Y13可以阻斷YTHDF2蛋白與發(fā)生 m⁶A 修飾的RNA之間的特異性識(shí)別，進(jìn)而改善小鼠放療或放療/免疫聯(lián)合療法的抗腫瘤治療效果[22]。此外，一些小分子可以通過物理化學(xué)作用改變大分子疏水特性調(diào)控LLPS 發(fā)生[23]，具有一定的治療潛力。

本研究主要分析了YTHDF2蛋白的LLPS在亞碑酸鈉誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及致癌過程中的作用，在后續(xù)研究中，可以檢測亞砷酸鈉誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中PTENmRNA的水平及穩(wěn)定性，以驗(yàn)證YTH-DF2蛋白LLPS對(duì)PTENmRNA翻譯的抑制作用；其次，深人挖掘YTHDF2蛋白LLPS所募集的翻譯因子，明確其是否靶向調(diào)控PTEN表達(dá)來影響細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化；此外，還可以更廣泛地探索YTHDF2蛋白LLPS是否影響其他抑癌因子，進(jìn)而參與亞砷酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變及致癌過程。

綜上，本研究結(jié)果表明，YTHDF2蛋白LLPS抑制抑癌因子PTENmRNA翻譯，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PTEN含量，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移與克隆形成。本研究初步探索YTHDF2蛋白LLPS在亞砷酸鈉誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的生物學(xué)意義，為解讀亞砷酸鈉誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化與致癌的機(jī)制開辟了新思路。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明熊文曉：實(shí)施實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析、論文撰寫；趙田禾：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、論文修改；龍科言：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理、作圖；張遵真：研究指導(dǎo)、論文修改

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（收稿日期：2024-06-28）