基于PI3K/Akt/NF-kB信號(hào)通路探討黃連素對(duì)特應(yīng)性皮炎大鼠皮膚病理變化的治療作用

The therapeutic efect of berberine on pathological changes of skin in rats with atopic dermatitis based on the Pl3K/Akt/NF- Π_κB signaling pathway

JIANG Su，LI Dongxia，LYU Xinxiang， CUI Yanhong，LYULiting

Departmentof Dermatologyand Venereology，Afliated HospitalofInerMongolia Medical University， Hohhot O050，Chi

Abstract：ObjectiveTo explore the therapeutic mechanismof berberine inatopic dermatitis （AD）rats basedon PI3K/ Akt/NF-kappa B signaling pathway.MethodsSixty adult male Wistarrats were randomlydivided into the blank group （normal rats）， the control group （AD model， 50mg/kg berberine treatment） and the experimental group （AD model， 200mg/kg berberinetreatment），with2Orats ineachgroup.Thelevelsof interleukin-4（IL-4），interleukin-13（IL-13）andtumor necrosis factor- α （TNF- α ）were determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） at1d，7 dand14d of intervention. The protein levels of PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt and NF- κI 3p65 were detected by Western blot assay. Pathologicalchangesofratskintissue wereanalyzedbyHEstaining.ResultsAfterinterventionfor1d，7dand14d， serum levels of IL-4，IL-13，TNF- ∝ and PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt and NF-kappa B p65 were higherin the control group than those intheblank group（ Plt;0.05 ）.Afterinterventionfor7dand14d，thelevelsof theabove indicatorswerelower in the experimental group than those in the control group （ Plt;0.05 ）.After14 days of intervention，compared with the blank group，theskintissue ofrats inthecontrol groupand theexperimental groupshowedobvious pathologicalchanges，including thickening of epidermis layer，excesive keratinization of the stratum corneum，thickening of spinous layer anda large infiltrationof inflammatorycelsindermis.Thepathologicaldamageofratskin tissue was significantlyallviated inthe experimental group.ConclusionBerberinecan inhibittheactivationof PI3K/Akt/NF-kappa Bsignaling pathway，reduce serum level of inflammatory factors and reduce pathological damage of skin tissue in AD rats.

Keywords：dermatitis，atopic;berberine;phosphatidylinositol3-kinases;protooncogeneproteinsc-akt;NF-kappaB; cytokines; skin tissue

特應(yīng)性皮炎（atopicdermatitis，AD）是一種以皮膚干燥、慢性瘙癢和復(fù)發(fā)性炎癥為特征的慢性炎癥性皮膚病1。隨著環(huán)境因素變化及生活方式改變，AD全球發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)[2]。當(dāng)前臨床主要采用藥物治療（如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑），物理治療（紫外線療法），中醫(yī)藥治療（口服中藥、針灸）等綜合干預(yù)措施，但仍具有治療抵抗率高、易復(fù)發(fā)等問題。黃連素（Berberine）是從黃連、黃柏等藥用植物中提取的異喹啉類生物堿。既往研究證實(shí)其具有抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等多重藥理作用[3]，在銀屑病、濕疹等炎癥性皮膚病治療中展現(xiàn)出潛在價(jià)值，但其對(duì)AD的具體作用機(jī)制尚未完全闡明。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/核因子 κB 中 [NF-κB 信號(hào)通路作為調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、調(diào)亡及炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵通路[4，其異常激活與AD皮膚屏障破壞、Th2型免疫偏移等病理過(guò)程密切相關(guān)[5]。本研究通過(guò)構(gòu)建AD大鼠模型，探討黃連素對(duì)AD大鼠的治療作用，并基于 PI3K/Akt/NF-κB 信號(hào)通路揭示其潛在的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)成年雄性Wistar大鼠60只，11＼～12周齡，體質(zhì)量 210～254g ，購(gòu)自上海懿尚生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2022-0011，使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2022-0029。大鼠均在溫度 （22±2）^°C 、相對(duì)濕度50%～60% ，人工光照黑暗循環(huán) 12h/12h 的SPF級(jí)環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)，大鼠自由攝取食水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[編號(hào)：（2024）倫審第（35）號(hào)]。

1.1.2主要試劑與儀器黃連素（溶于 0.5% 羥甲基纖維素鈉溶液，北京索萊寶科技有限公司）；卵清蛋白（OVA，美國(guó)Sigma-Aldrich）；氫氧化鋁凝膠（杭州萬(wàn)景新材料有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H33021601，規(guī)格 100g） ;白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-13、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；抗體試劑包括PI3K抗體（美國(guó)CST）、 -PI3K抗體（英國(guó)Abcam）、Akt抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology） ??p-Akt 抗體（美國(guó)BDBiosciences）和NI 抗體（美國(guó)CST）。Westernblot電泳儀（美國(guó)伯樂生物醫(yī)學(xué)有限公司）；光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯）；低溫高速離心機(jī)（山東博科保育科技股份有限公司，TGL-16E）；質(zhì)譜流式儀（美國(guó)富魯達(dá)公司，PLR-386）；紫外可見分光光度計(jì)（南京貝登醫(yī)療股份有限公司，UV-5100型）；自動(dòng)脫水機(jī)（德國(guó)徠卡公司，ASP300S）；石蠟包埋機(jī)（德國(guó)徠卡公司，HistoCoreAcadiH）;恒溫培養(yǎng)箱（上海?，敼荆珼PX.9082）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1構(gòu)建AD模型（1）制備OVA混懸液： 100μg 0VA 粉末與 2mg 氫氧化鋁凝膠混合，加入無(wú)菌生理鹽水或?qū)Ｓ镁彌_液，經(jīng)渦旋震蕩制備成均質(zhì)穩(wěn)定混懸液。（2）腹腔注射致敏：取40只大鼠進(jìn)行建模，將大鼠腹部朝上固定，腹腔注射100μg0VA 混懸液，觀察大鼠的反應(yīng)，若出現(xiàn)嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)或其他異常情況，及時(shí)給予抗過(guò)敏藥物或進(jìn)行急救。（3）制備 1% OVA溶液：取適量OVA粉末，用無(wú)菌生理鹽水或特定的溶劑充分溶解后制成 1% 的OVA溶液。（4）背部涂抹激發(fā)：

于首次致敏后的第15天暴露大鼠背部皮膚并使用無(wú)菌棉簽均勻涂抹 1%OVA 溶液 （50μL/cm²） ，每日1次，連續(xù)7d。（5）實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)與評(píng)估：記錄每日進(jìn)食量、飲水量及搔抓頻率，致敏24h 后檢測(cè)血清IgE水平，處死大鼠后取其皮膚組織進(jìn)行HE染色，觀察真皮層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及淋巴濾泡壞死等病理特征。建模成功需同時(shí)滿足如下3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)： 10min 持續(xù)搔抓超過(guò)25次、血清 IgEgtrsim200μg/L 和組織病理學(xué)典型改變。

1.2.2分組與給藥方法采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，每組20只。空白組僅予以適應(yīng)性喂養(yǎng)，不做任何處理；對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組大鼠在成功構(gòu)建AD模型后分別給予低（ 50mg/kg 高 200mg/kg） 劑量黃連素灌胃治療，7d內(nèi)給藥3次，干預(yù)14d，共給藥6次。

1.2.3ELISA法檢測(cè)血清IL-4、IL-13、TNF- σ_?∝ 水平分別于干預(yù)1d、7d和14d時(shí)，采集大鼠空腹尾靜脈血，以 3200r/min 離心 10min （半徑 10cm 后獲取血清，采用ELISA法測(cè)定血清IL-4、IL-13、TNF- α_∝α_∝ 水平，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.4Westernblot 檢測(cè) PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、 NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平于干預(yù)1d、7d和14d時(shí)，按照1.2.3中的方法分別獲取血清，提取血清中蛋白，使用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)量。蛋白樣本經(jīng)過(guò) 10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，按凝膠面積以 0.65mA/cm² 恒流電轉(zhuǎn)移 1.5h ，將蛋白自凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用 5% 脫脂奶粉封閉膜，2h后在膜上加入1：1000 稀釋的兔抗人PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF- κB p65，4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后加入 1：2000 稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，孵育 1.5h ，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)膜進(jìn)行顯影，并分析蛋白灰度值，以 β -actin作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5HE染色觀察大鼠皮膚組織病理變化干預(yù)14d后，分別對(duì)各組大鼠背部皮膚進(jìn)行圖像采集以觀察皮膚狀態(tài)，并切取皮膚病變組織樣本。樣本經(jīng) 10% 中性福爾馬林緩沖液固定 24～48h 后，依次進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明及石蠟包埋處理，制備 3～5μm 厚切片。采用HE染色法進(jìn)行病理分析，具體流程包括：切片脫蠟復(fù)水、蘇木精染色 5min 、鹽酸乙醇分化、伊紅復(fù)染 2min ，最后經(jīng)梯度乙醇脫水及二甲苯透明處理，置于光學(xué)顯微鏡下（ ×200 觀察組織病理學(xué)變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差 表示，不同時(shí)點(diǎn)多組間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.13組血清炎性因子水平比較3組大鼠干預(yù)不同時(shí)點(diǎn)血清IL-4、IL-13、TNF- σ?α∝ 水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且組間與干預(yù)時(shí)間存在交互效應(yīng)（ （Plt; 0.05）。干預(yù) 1d，7d，14d 時(shí)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組血清IL-4、IL-13、TNF- ∝ 水平均高于空白組 （Plt;0.05） 。干預(yù)1d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組血清IL-4、IL-13、TNF- 水平與對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ （Pgt;0.05 ；干預(yù) 7d 、14d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組血清IL-4、IL-13、TNF- σ_∝ 水平均低于對(duì)照組 （Plt;0.05 ，見表1。

2.23組大鼠PI3K ?p? -PI3K、Akt、p-Akt、NF- κB p65蛋白表達(dá)水平比較建模后干預(yù)不同時(shí)點(diǎn)3組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF- κB p65蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且組間與干預(yù)時(shí)間存在交互效應(yīng) （Plt;0.05 ）。干預(yù)1d時(shí)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、 蛋白表達(dá)水平均高于空白組 （Plt;0.05 ，實(shí)驗(yàn)組各蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 。干預(yù)7d、14d時(shí)，對(duì)照組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均高于空白組 （Plt;0.05） ；實(shí)驗(yàn)組除干預(yù)7d時(shí)Akt及干預(yù) 14d 時(shí) -PI3K、NF- κB p65蛋白表達(dá)水平與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余蛋白表達(dá)水平均高于空白組 （Plt;0.05） ；實(shí)驗(yàn)組各蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組 （Plt;0.05 ，見表2。

2.33組大鼠皮膚組織的病理變化治療14d時(shí)，皮膚組織病理檢查結(jié)果顯示，空白組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，表皮層薄，角質(zhì)層正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠皮膚組織出現(xiàn)明顯的病理改變，表皮層增厚，角質(zhì)層過(guò)度角化，棘層肥厚，真皮層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠皮膚組織的病理?yè)p傷明顯減輕，表皮層厚度、角質(zhì)層角化程度、棘層肥厚程度以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度均有所改善，見圖1、2。

3討論

AD作為一種慢性炎癥性皮膚病，其病理機(jī)制與免疫系統(tǒng)異?；罨芮邢嚓P(guān)[6]。PI3K/Akt/NF- σ_κB 信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及炎癥反應(yīng)，在AD病理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此被視為潛在治療靶點(diǎn)[]。黃連素可通過(guò)抑制PI3K/Akt/NF- σ_κB 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用，如一些AD動(dòng)物模型的研究結(jié)果表明，黃連素能夠顯著減輕皮膚炎癥反應(yīng)，降低促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平，并改善皮膚病理改變；其作用機(jī)制可能包括直接抑制PI3K活性，進(jìn)而阻斷Akt磷酸化及 NF-κB 核轉(zhuǎn)位，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[8-9]。此外，黃連素還可能通過(guò)抑制Th2細(xì)胞活化、調(diào)控細(xì)胞因子釋放等其他信號(hào)通路，在AD治療中呈現(xiàn)多靶點(diǎn)作用特性[10]。目前關(guān)于黃連素治療AD的研究仍處于探索階段，其臨床療效和安全性尚需通過(guò)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究與臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，相關(guān)分子機(jī)制也有待深入闡明。

有研究表明，AD的發(fā)生與多種炎性因子相關(guān)，其中血清IL-4、IL-13和TNF- α_?∝ 水平升高是其重要特征[]。本研究結(jié)果顯示，，黃連素能夠顯著改善AD大鼠的皮膚癥狀，降低血清炎性因子IL-4、IL-13和TNF- α_?∝ 水平，減輕皮膚組織病理?yè)p傷，與既往研究結(jié)果一致。IL-4和IL-13主要由Th2細(xì)胞分泌，可通過(guò)促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE介導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)和炎癥進(jìn)程[12];TNF- σ?α∝ 則作為關(guān)鍵促炎因子，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。黃連素能夠顯著降低這些炎性因子的水平，其機(jī)制可能包括：抑制炎性細(xì)胞活化及炎性因子釋放，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，并減少Th2細(xì)胞分化與IL-4、IL-13的分泌[13-14]

PI3K/Akt/NF- κB 信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組AD大鼠PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF- σ_κB p65蛋白表達(dá)水平均高于空白組，而實(shí)驗(yàn)組經(jīng)黃連素干預(yù)14d后，PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF- κB p65蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。提示在AD中，PI3K/Akt/NF- κB 信號(hào)通路被異常激活，PI3K激活后可磷酸化Akt并促使其活化，活化的Akt進(jìn)一步激活下游 NF-κB ，最終促進(jìn)炎性因子表達(dá)及炎癥反應(yīng)增強(qiáng)[15]。而黃連素可通過(guò)抑制PI3K活性，減少Akt磷酸化，從而阻斷NF-κB 的激活過(guò)程[16]。 NF-κB 是調(diào)控炎性因子基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，黃連素通過(guò)降低 NF-κB p65表達(dá)水平，可直接減少炎性因子的產(chǎn)生[17-18]。此外，黃連素對(duì)AD大鼠皮膚癥狀的顯著改善及組織病理?yè)p傷的減輕作用，可能與其調(diào)節(jié)血清炎性因子水平和PI3K/Akt/NF- κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)[19]。血清炎性因子水平的降低可有效緩解皮膚瘙癢、紅斑、丘疹等炎癥癥狀；而抑制PI3K/Akt/NF- σ_κB 信號(hào)通路的激活可減少炎性因子基因表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)程度，從而減輕皮膚組織的病理?yè)p傷。另有研究表明，黃連素可能通過(guò)清除氧自由基、緩解氧化應(yīng)激進(jìn)一步改善皮膚組織的損傷[20]

綜上所述，黃連素對(duì)AD具有一定治療作用，其可降低血清IL-4、IL-13、TNF- ∝ 水平及PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF- σ_κB p65蛋白表達(dá)水平，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制 PI3K/Akt/NF-κB 信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用的。黃連素具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，為AD的治療提供了新的思路和方法，未來(lái)的研究可以進(jìn)一步深入探討黃連素的作用機(jī)制，優(yōu)化給藥方案，提高治療效果。

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