基于環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的大洋河下游魚類多樣性研究

中圖分類號(hào)S932. 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 0517-6611（2025）12-0059-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.12.015

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Fish Diversity in the Downstream of Dayang River Based on Environmental DNA Metabarcoding Technology ZHUChun-yue，YANGPei-min，LIUZhong-hangetal（LiaoningItituteofFreshwaterFisheries/LiaoningKeyLaboratoryofquatic Animal Diseases Control，Liaoyang，Liaoning111000）

AbstractInodetounderstandthspecicompositooftifisspecisommunitisandprotectheirdiversityintedowsteamof DayangRiverviroetalDmetabarodinehgasusdtoaletespisdvesityofsiedostreaoagi er.Throughthecolletionandhigh-troughputsequencingaalysisofDA（eDNA）samplesfromthedownstreamenvironentoftheDayang River，atotalofsiesofsectediplsfrotreaftaoitga，， 9orders.Amongtherders，Cypriniforeshdthelgestspeiesumber34speies）folowdbyGobfos（1Ospecies）llfs speciesHophalmchorinlematocesdilssdgheratiedaethotaleatiea 83.85% .Overall，thediversiyandabundanceoffshatestuarinesites（K）werelowerhilethoseinLingdongsection（S）wereighr.Comparedwithtradioalsiods，oealetabarodinhdthdaagofstigssiivitydiou beusedaasupnttodalsysouesuryTsdyouldeichtesructuraladfucioaloaoofsoucs inthlowerrachsofthengRivendproidesicfaiosuprtsforthsteatcaagentdesatoofishc in this water area.

KeyWordsEnvironmental DNA（eDNA） technology;Fish diversity;Dayang River

大洋河發(fā)源于遼寧省岫巖縣偏嶺鄉(xiāng)一棵樹嶺南側(cè)，流經(jīng)岫巖縣，至東港市黃土坎入黃海[1]。干流全長 230km ，流域面積 6504km² ，是遼河與鴨綠江之間最大的河流，多年平均徑流量為31億 m^3[2] 。大洋河水生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)較好，大部分河段為沙礫底質(zhì)[。該流域內(nèi)無污染，且干流沒有大型水庫[3]，魚類資源較為豐富[4]。目前關(guān)于大洋河的研究多集中在單一物種生物學(xué)研究[1，5-6]、水質(zhì)資源評估與保護(hù)[7-9]、洪水分析與預(yù)報(bào)技術(shù)方面[10-I]。迄今為止關(guān)于魚類資源多樣性的研究較少，僅在1980年對大洋河進(jìn)行了魚類資源的調(diào)查。由于近年來大洋河流域內(nèi)環(huán)境的變化和支流水壩的建設(shè)[3]，及時(shí)準(zhǔn)確掌握水域內(nèi)的魚類生物量和時(shí)空動(dòng)態(tài)分布有助于開展魚類資源的保護(hù)、開發(fā)和合理利用。

環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)（eDNAmetabarcoding）是一種利用DNA 條形碼和高通量測序（high throughput sequencing，HTS）相結(jié)合，對環(huán)境樣本中的eDNA進(jìn)行快速檢測，從而獲取環(huán)境樣本中DNA所屬物種的分類學(xué)信息和基因功能信息的研究方法[12-13]。其原理是收集物種通過細(xì)胞脫落、尿液/糞便排泄等方式殘留在環(huán)境中的DNA，然后利用特定的引物擴(kuò)增出物種（或生物群落）特定DNA序列，并通過高通量測序確定物種種類組成和多樣性特征[14-15]。與傳統(tǒng)檢測方法相比，eDNA具有較高的靈敏度，可以檢測到少量DNA拷貝，采樣方案相對簡單，即采樣 0.5～3.0L 水即可對水域中的生物進(jìn)行檢測[16-17]。最初，eDNA 技術(shù)被用于分析土壤環(huán)境中微生物的多樣性以及物種鑒定[18-19]，后來被應(yīng)用于檢測評估淡水環(huán)境中生物的多樣性和種類[20-22]，現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于海洋和河口等不同生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性檢測、評估[23-24]該研究利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)對大洋河下游開展魚類資源調(diào)查，分析了大洋河下游魚類組成、生物量和多樣性指數(shù)，以客觀評估大洋河下游魚類資源現(xiàn)狀，以期為大洋河的生態(tài)修復(fù)效果評估與方案優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支撐。

1材料與方法

1.1采樣時(shí)間及采樣地點(diǎn)試驗(yàn)所用環(huán)境樣本為2023年10月20—23日采自大洋河下游的水域樣本，此次調(diào)查按離海遠(yuǎn)近在河流下游選取3個(gè)地點(diǎn)，即河口（K）、黃土坎段（H）和嶺東段（S）。為了檢測到整個(gè)區(qū)域，分別在每個(gè)地點(diǎn)河流的斷截面取3個(gè)點(diǎn)，包括河流兩岸和中間段，共9個(gè)位點(diǎn)，具體采樣位點(diǎn)信息見圖1。

1.2環(huán)境DNA樣本采集、處理及提取每個(gè)采樣位點(diǎn)采集表層、中層和底層水樣各 3L ，混勻。為了避免樣品交叉感染，取樣品和手套均為一次性，采樣后丟棄。各位點(diǎn)水樣在采集后 24h 內(nèi)處理完畢，使用 0.22μm 無菌濾膜真空抽濾，抽濾前用84消毒液對抽濾裝置進(jìn)行浸泡消毒處理，得到濾膜（各點(diǎn)位5＼～7個(gè)平行），放置在無菌無酶的 2mL 離心管中保存至 -80°C 冰箱中。在DNA提取前，先在無菌管中將每個(gè)濾膜剪成小塊，再利用DNeasyPowerWaterKit試劑盒（QIAGEN）對濾膜進(jìn)行基因組DNA提取。最后，利用 1% 瓊脂糖凝膠電泳對提取的基因組DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測。

1.3PCR擴(kuò)增及高通量測序使用已報(bào)道的魚類eDNA通用引物Tele02-F（AAACTCGTGCCAGCCACC）和Tele02-R（GGGTATCTAATCCCAGTTTG）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增[25]。PCR 擴(kuò)增體系為 5×Fast Pfu Buffer 4μL，2.5 mmol/L dNTPs 2μL 正反引物（ 5μmol/L ）各 0.8μL 、FastPfu DNA Polymerase0.4μL 、模板DNA 10ng ，補(bǔ)雙蒸水至 20μL 。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 個(gè)循環(huán);72^°C 延伸 10min 。參照電泳初步定量結(jié)果，使用QuantiFlu-orT-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega 公司）進(jìn)行檢測定量，檢測完成后利用IlluminaPE250進(jìn)行文庫構(gòu)建。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析使用USEARCH軟件（version10，ht-tp：//www.drive5.com/usearch/）和 GOLD 數(shù)據(jù)庫（https：//gold.jgi.doe.gov/），采用denovo和reference相結(jié)合的方式去除嵌合體，按照 97% 相似性對OTU（operational taxonomic u-nits）進(jìn)行聚類分析，得到OTU的代表序列，生成OTU表格。采用UCLUST 算法（https：//www.drive5.com/usearch/manual/uclust_algo.html）對序列相似性 97% 的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)各樣本在各個(gè)分類水平的群落組成。使用Mothur 軟件[26-27]（version v.1.30.1，http：//www.mothur.org/wi-ki/Schloss_SOP#Alpha_diversity）進(jìn)行 ∝ 多樣性分析，再使用在線分析軟件（http：//www.cloud.biomicroclass.com/Cloud-Platform/SoftPage/FLO）繪制OTU花瓣圖[28]?；诟鞑蓸狱c(diǎn)物種序列豐度，利用R語言vegan包繪制物種相對豐度圖[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1環(huán)境DNA測序結(jié)果對來自大洋河下游的9個(gè)水樣進(jìn)行了分析，共獲得9740369個(gè)原始序列，其中9732280個(gè)高質(zhì)量序列，平均長度為 171bp 。在序列相似性 ?97% 的情況下，通過聚類共獲得963個(gè)OTU。eDNA樣品的高通量測序統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如表1所示。

2.2魚類物種組成將 OTU與GenBank數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）進(jìn)行比較，對注釋序列的OTU進(jìn)行分類。共檢測到61種魚類，隸屬于9目21科52屬，其中以鯉形目（Cypriniformes）最多，有34種（占檢測物種數(shù)的 56% ）；其次為蝦虎魚目（Gobiiformes），有10種（占檢測物種數(shù)的 16% ）。不同采樣位點(diǎn)魚類屬水平相對豐度如圖2所示。整體來看，各采樣位點(diǎn)相對豐度排名前3位的屬為鰱鰱屬 Hypophthalmichthys 鯽屬Carassius鯪屬Planiliza 棘蝦虎魚屬Acanthogobius屬Coilia 副泥鰍屬Paramisgurnus未分類Unclassified 屬 Hemibaarbus原鯉屬Procypris 小鉤屬M(fèi)icrophysogobio鲇屬Silurus 其他Other縞虎魚屬Tridentiger100Hrrraageeeiaaree 80604020】H-1 H2H-3K-1K-2K-3S-1S-2 S-3樣本編號(hào) Sample number屬（Hypophthalmichthys）鮫屬（Planiliza）和屬（Coilia），鰱屬和鮫屬在K（河口）采樣位點(diǎn)相對豐度較高，屬在H（黃土坎段）采樣位點(diǎn)相對豐度較高?；诃h(huán)境DNA檢測結(jié)果的大洋河下游優(yōu)勢魚類物種統(tǒng)計(jì)見表2。

2.3魚類多樣性分析此次測序得到的魚類樣本稀釋曲線如圖3所示，9個(gè)采樣位點(diǎn)測序深度均達(dá)到平臺(tái)期，證實(shí)了后續(xù)多樣性分析的可行性。由表3可知，在大洋河下游魚類物種的多樣性指標(biāo)中，Chao指數(shù)的變化范圍為 2 059.667～ 3116.824，物種豐富度指數(shù)的變化范圍為 1 397～2 451 。Shannon多樣性指數(shù)的變化范圍為 3.198 1～5.302 3， Simpson多樣性指數(shù)的變化范圍為 0.1011～0.2710 。ACE指數(shù)的變化范圍為2126.576＼～3234.492，Pielou均勻度指數(shù)的變化范圍為 0.301394～0.470934. 。盡管各采樣位點(diǎn)的魚類物種多樣性指標(biāo)略有差異，但K-2的Simpson多樣性指數(shù)最高，其余指標(biāo)均為S-1最高。

2.4魚類物種差異分析利用在線分析軟件，根據(jù)獲得的樣本OTU統(tǒng)計(jì)表，繪制9個(gè)采樣位點(diǎn)樣本的OTU花瓣圖。各樣本共有和特有OTU如圖4a所示。由圖4a可知，9個(gè)采樣位點(diǎn)樣本共有OTU占比較高，且S-1和S-2這2個(gè)采樣位點(diǎn)具有較多的特有OTU。為了比較大洋河下游不同區(qū)域魚類物種的組成，對S、H、K3個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行了分析，各地共有和特有OTU如圖4b所示。嶺東段（S）的特有OTU數(shù)量最多，黃土坎段（H）次之，河口（K）最少。

3討論

3.1大洋河下游魚類物種組成及多樣性大洋河處于遼河多雨區(qū)，魚類種類繁多[4]，河口連接黃渤海，一些廣鹽性魚類容易進(jìn)入大洋河繁殖生存[30]。近年來，由于環(huán)境破壞和水利工程建設(shè)等原因，漁業(yè)資源呈逐年減少趨勢[31]，因此了解大洋河流域魚類群落的組成和結(jié)構(gòu)有利于稀有瀕危魚類的研究、保護(hù)和可持續(xù)開發(fā)利用。目前針對大洋河魚類研究方法主要為傳統(tǒng)捕撈法，該方法對魚類種群群落具有破壞性，實(shí)施過程較為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且需要專業(yè)研究人員進(jìn)行分類、鑒定[32]。該研究利用eDNA技術(shù)分析了大洋河下游3個(gè)區(qū)域共9個(gè)位點(diǎn)的魚類組成，共檢測到61種魚類，隸屬于9目21科52屬。其中，鰱屬的相對豐度較高，其次為鮫屬和屬。

Fig.4Petal map of OTU of fish species at different sampling sites in the downstream of Dayang River

該研究采用多樣性指標(biāo)來表征大洋河下游水域的魚類物種多樣性。多樣性指標(biāo)的大小可以反映物種群落的豐度和多樣性[33]，包括物種豐富度指數(shù)、Shannon 多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)等。其中，Chao指數(shù)和物種豐富度指數(shù)表征物種豐度;Shannon多樣性指數(shù)、Simpson多樣性指數(shù)、ACE指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)表征物種的豐富度。9個(gè)采樣位點(diǎn)中S-1位點(diǎn)具有較高的Chao指數(shù)、物種豐富度指數(shù)、Shan-non多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)，表明相較于其他位點(diǎn)，S-1具有較高的魚類物種豐度和多樣性。除Simpson多樣性指數(shù)外，各地點(diǎn)3個(gè)位點(diǎn)所有指標(biāo)的平均值均表現(xiàn)為 K。

10月大洋河水溫呈上升趨勢，而溫度的升高有利于多種喜溫浮游動(dòng)植物的生長和繁殖，生物多樣性增加，初級(jí)生產(chǎn)力提高，有利于魚類的繁衍聚集，因此魚類的多樣性更高[34]。

3.2傳統(tǒng)捕撈法與eDNA技術(shù)檢測結(jié)果的比較傳統(tǒng)捕撈法與eDNA技術(shù)在魚類資源調(diào)查中存在一定差異。凌嵐馨等[32]通過環(huán)境DNA技術(shù)與傳統(tǒng)捕撈法對崇明島內(nèi)河魚類多樣性進(jìn)行了調(diào)查研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)eDNA技術(shù)檢測到的魚類物種數(shù)量多于傳統(tǒng)捕獲法所獲得的物種數(shù)量，且檢測的物種多樣性明顯高于傳統(tǒng)捕獲法。根據(jù)歷史文獻(xiàn)[4記載，采用傳統(tǒng)捕撈法在大洋河下游共監(jiān)測到魚類47種，隸屬于22科。與該研究結(jié)果相比，相同種類有16種，包括花棒魚（Abbottinarivularis）鯽魚（Carassiuscuvieri）長吻魚骨（Hemibarbuslon-girostris）白鰱（Hypophthalmichthysmolitrix）等;新增了烏原鯉（Procyprismera）異育銀鯽（Carassiusgibelio）矛形蝦虎魚（Acanthogobius hasta）、副鰍（Paramisgurnus dabryanus）等 45種魚類；在歷史文獻(xiàn)中有記載而此次沒有調(diào)查到的魚類種類有31種，包括彈涂魚（Periophthalmuscantonensis）、香魚（Plecoglossusaltivelis）黃顙魚（Pelteobagrusfulvidraco姑魚（Johnius belangeri）、烏（Ophiocephalusargus）、日本鰻（Anguillajaponica）和鯰魚（Parasilurusasotus）等（表4）。利用eDNA技術(shù)檢測到的魚類種數(shù)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)捕撈法獲得的魚類種數(shù)，造成這種差異的原因可能包含以下方面： ① eDNA技術(shù)具有較高的靈敏性，可以檢測到生物量較低的物種[33]； ② 采樣時(shí)間間隔較長，大洋河下游的優(yōu)勢魚類物種和群落組成發(fā)生了變化[35]； ③ 魚類習(xí)性和環(huán)境因素的變化可能影響了魚類多樣性[36]； ④ 由于eDNA測定選擇的引物特異性不強(qiáng)，造成數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果存在一定差異，從而導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確[32]； ⑤ 比對數(shù)據(jù)庫不夠完整，使測得的序列無法進(jìn)行比對。該研究發(fā)現(xiàn)有7.46% 的物種未能進(jìn)行分類，這種現(xiàn)象在eDNA技術(shù)被廣泛應(yīng)用于魚類資源調(diào)查前就有出現(xiàn)[37]。此外，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中還存在大量的錯(cuò)誤信息，這也影響了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性[7]。

3.3魚類生物量分析凌建忠等[38]研究表明生態(tài)系統(tǒng)中生物的eDNA豐度與生物量密切相關(guān)，可用于生物量的評估。Tillotson等[39利用eDNA技術(shù)評估不同河流中鮭魚的生物量，證實(shí)了eDNA技術(shù)用于物種生物量評估的可行性。該研究eDNA檢測結(jié)果表明，大洋河下游10月魚類的優(yōu)勢種為鰱屬、鮫屬和屬，其中魴屬主要為刀（C.nasus），相對豐度為 16.08% 。作為一種中小型洄游魚類，刀原產(chǎn)于我國長江地區(qū)，與河豚、魚并稱“長江三鮮”。據(jù)歷史資料記載我國野生刀資源豐富[40，但近年來由于水利建設(shè)、環(huán)境污染和過度捕撈等原因，我國野生刀資源銳減，2018年被世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）列為瀕危魚類[4I]。遼寧是北方地區(qū)刀的主要洄游區(qū)域，主要包括遼河、大洋河和鴨綠江[42]。目前，僅在大洋河發(fā)現(xiàn)小規(guī)模刀漁汛[5.43]。刀作為我國重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一，近年來對其開展了大規(guī)模的放流活動(dòng)，用來恢復(fù)刀魚類資源。該研究在大洋河下游3個(gè)地點(diǎn)均檢測到刀魴，并發(fā)現(xiàn)其為調(diào)查區(qū)域的優(yōu)勢種，表明大洋河水域的刀資源恢復(fù)良好。

4結(jié)論

該研究利用eDNA宏條形碼技術(shù)分析了大洋河下游魚類物種的多樣性，獲得了較為豐富的魚類物種信息，共鑒定出61種魚類，隸屬9目21科52屬。與歷史調(diào)查數(shù)據(jù)相比，該研究發(fā)現(xiàn)通過eDNA技術(shù)獲得的魚類多樣性高于傳統(tǒng)捕撈法，證實(shí)了eDNA技術(shù)應(yīng)用于魚類資源調(diào)查的可行性。下一步將繼續(xù)擴(kuò)大采樣范圍和采樣時(shí)間，從時(shí)間和空間上開展更加全面的大洋河魚類多樣性調(diào)查，為大洋河魚類資源的保護(hù)、開發(fā)和合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

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