象草PHR家族基因的鑒定及表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S54 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2025）07-2099-15

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2025.07.006

引用格式：，等.象草PHR家族基因的鑒定及表達(dá)分析[J].草地學(xué)報(bào)，2025，33（7）：2099—2113 FANG Ting，LUO Jia-jia， ZHANG Yu-ge，et al. Identification and Expression Analysis of the PHR GeneFamily in Pennisetum Purpureum[J].Acta Agrestia Sinica，2025，33（7） ：2099-2113

Identification and Expression Analysis of the PHR Gene Family in Pennisetum Purpureum

FANG Tingl#，LUO Jia-jia ^1，2#_. ， ZHANG Yu-ge1，MAO Yu-ye1，GUO Yu-tong1， DONG Rong-shu2， CAI Ze-ping1* （1.SchooloficalAgiclureandFestryanUvesityo，inrovie28a;oicalCoetic Resources Institute，Chinese AcademyofTropical Agriculture Sciences，KeyLaboratoryofCropGeneResourcesand Germplasm EnhancementinSouthernChina，MinstryofAgricultureandRuralAfairs，Haikou，HainanProvince57o，China）

Abstract：The phosphate starvation response （PHR） factor plays a pivotal role in regulating phosphorus homeo stasis in plants，yet the PHRs in Pennisetum purpureum （elephant grass）remain unreported. This study analyzed the efects of low phosphorus （P）stress on the growth of elephant grass，identified the members of PHR family in elephant grass，and examined their transcription expression levels.Furthermore，the two key genes P/PHR/13 were cloned，and their expression patterns and subcellular localization were analyzed. The results demonstrated that low P stress significantly inhibited the growth of elephant grassA total of 42 PpPHRs were identified from the elephant grassgenome，with colliear gene pairs originating from whole-genome duplication or segmental duplication events. Transcriptome showed that 1 5PρPHRs were significantly upregulated by low P stress in elephant grass leaves（and/or roots），with P/PHR/13 exhibiting relatively high expression levels. Additionally， tissue-specific expression analysis revealed that P/PHR/13 had the highest expression levels in roots and stems，respectively. Quantitative PCR confirmed that low P treatment enhanced the expression of

P/PHR/1/3 in both roots and leaves. Subcellular localization indicated that both P/PPHRδ andPpPHR13pro teins were localized in the nucleus. This study provides candidate gene resources for elucidating the mechanisms underlying elephant grass's response to phosphorus deficiency.

Key Words：Pennisetum purpureum;Low phosphorus stress ;Phosphate starvation response factor;Gene expres sion;Subcellular localization

磷（Phosphorus，P）是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素之一，是生物大分子（如核酸、磷脂和三磷酸腺苷ATP等）的基本結(jié)構(gòu)組分，主要通過磷酸化和去磷酸化作用參與光合作用、能量代謝和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種重要生物過程[1]。雖然土壤中磷含量豐富，但大部分以有機(jī)磷和無機(jī)難溶性磷酸鹽的形式存在，而植物能直接吸收利用的無機(jī)磷酸鹽（ H₂PO^4- ，Phosphate inorganic，Pi）含量不足 1% 。為緩解磷有效性低的問題，農(nóng)民主要通過大量施用磷肥以期提高作物產(chǎn)量，但磷在土中容易被固定為不可直接吸收的磷復(fù)合物形式（如在酸性土壤中容易被固定為鐵磷和鋁磷，在堿性土壤中容易被固定為鈣磷），且大部分容易隨土壤淋溶進(jìn)入江河，以引起水體富營養(yǎng)化的環(huán)境污染，實(shí)質(zhì)上作物的磷利用效率普遍偏低[2]。全世界范圍內(nèi)，約 40%～60% 可耕地的作物都受到低磷有效性的限制[3]。因此，有效提高作物的磷利用效率（Phosphorusutilizationeffi-ciency，PUE）已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的重要問題，而闡明植物對(duì)低磷的適應(yīng)機(jī)制是前提。在有效磷（Pi）不足的環(huán)境中，植物已經(jīng)進(jìn)化出一系列復(fù)雜而精細(xì)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以加快外部磷的攝?。椎奈眨┖驮鰪?qiáng)內(nèi)部磷的循環(huán)（磷的利用），其中PHR（Phosphate starvationresponse）蛋白被一致認(rèn)為是磷信號(hào)通路的核心調(diào)控因子，參與調(diào)控磷穩(wěn)態(tài)[4]。

擬南芥（Arabidopsisthaliana）AtPHR1是第一個(gè)被鑒定出的參與磷代謝的重要調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)AtPHR1超量表達(dá)能提高擬南芥葉片中的磷含量[5]。隨后，在擬南芥中鑒定到多個(gè)AtPHR1的同源基因，包括轉(zhuǎn)錄因子AtPHL1（PHRlike1），AtPHL2，AtPHL3和AtPHL4，這些同源基因同樣也被證實(shí)參與調(diào)控磷酸鹽缺乏響應(yīng)[5]。目前，已對(duì)多個(gè)物種的PHRs基因進(jìn)行了全基因組鑒定，如擬南芥有15個(gè)，水稻（Oryzasatiue）有16個(gè)[6]，玉米（Zeamays）有18個(gè)[7]，大豆（Glycinemax）有35個(gè)PHRs 基因[8]，這些PHRs蛋白典型的特征是含有一個(gè)結(jié)合DNA的MYB結(jié)構(gòu)域（PF00249）和一個(gè)參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的卷曲螺旋（CC）結(jié)構(gòu)域（PF14379）。PHRs是磷信號(hào)通路中的核心轉(zhuǎn)錄因子，其主要通過與基因啟動(dòng)子序列的P1BS（PHR1binding sequence）順式作用元件結(jié)合以調(diào)控下游磷饑餓響應(yīng)（phosphate starvation response，PSR）基因的表達(dá)，以激活磷信號(hào)來維持磷穩(wěn)態(tài)，P1BS元件是一個(gè)不完整的回文序列 5^′ -GNATATNC-3'[9]。在植物直接吸收根際土壤中的磷酸鹽途徑中，PHRs可激活調(diào)控下游PSR基因的表達(dá)，包括蛋白激酶（如叢枝發(fā)育激酶ADK），參與磷信號(hào)途徑調(diào)控的microRNAs（如miR399），以及參與磷吸收（如磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）同化（如磷脂酶和硫脂酶）和再分配（如核糖核酸酶和磷酸酶）的基因[2]。在低磷條件下，Zhang等人分析了高粱（Sorghumbicolor）的phrl或phll突變體轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)PHR1基因不僅調(diào)控PSR基因的表達(dá)，還參與了植物激素乙烯、茉莉酸和水楊酸代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。植物除了直接吸收Pi的途徑以外， 80% 的植物能與叢枝菌根真菌（Arbuscularmycorrhiza fungi，AMF）形成互惠共生體以增加Pi的獲取[1]。近期的大量研究發(fā)現(xiàn)，PHRs 參與調(diào)控多種植物的AMF共生體的形成，包括水稻和百脈根（Lotusjaponicus）等，其主要通過調(diào)控植物中菌根共生體形成相關(guān)基因的表達(dá)（包括RAMI，PTII ，WRI5A和 AMT3 ；1等）以影響AMF在植物中的定殖，同時(shí)還調(diào)控特異在含叢枝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白水解酶基因，以影響叢枝的降解[11-13]。PHRs蛋白的活性受磷酸鹽感應(yīng)的SPX蛋白的調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞中Pi充足時(shí)，SPX蛋白與PHR結(jié)合，以抑制PHR的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制了下游的磷酸鹽饑餓響應(yīng)；當(dāng)細(xì)胞中Pi不足時(shí)，SPX蛋白被降解，進(jìn)而解除了對(duì)PHRs的抑制作用，啟動(dòng)了磷饑餓的級(jí)聯(lián)信號(hào)應(yīng)答[14]。其中，SPX蛋白是以SYG1（酵母GPA1抑制子）、Pho81（酵母PHO途徑中的CDK抑制子）和XPR1（異嗜性和多嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒受體）而命名。因此，PHRs轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物磷饑餓響應(yīng)，維持內(nèi)源磷穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

象草（Pennisetumpurpureum）是禾本科（Poaceae）狼尾草屬（Pennisetum）典型的 C₄ 植物，起源于非洲、亞洲和美洲等的熱帶和亞熱帶地區(qū)，其不僅是經(jīng)濟(jì)上重要的熱帶牧草作物和觀賞植物，還是生產(chǎn)酒精、生物炭、甲烷和紙等的優(yōu)良原料[15]，可用于生態(tài)保護(hù)以提高土壤肥力和防止土壤侵蝕[16]。象草具有耐貧瘠土壤和高溫、抗干旱、生長迅速和高生物量等優(yōu)良特征，在水肥供應(yīng)充足的條件下，象草可長至 2～6m 高，生物量產(chǎn)量約為 45t?hm^-2 ，每年可收割 3～4 次[17]。因象草種植于熱帶亞熱帶地區(qū)，而這些地區(qū)也是酸性土壤主要分布區(qū)域，表明象草對(duì)磷低效的酸性土壤具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，同時(shí)象草的快速生長需要大量的水和肥，因此解析象草高效利用磷素的調(diào)控機(jī)理，可為磷高效象草新品種的培育提供候選基因和奠定理論基礎(chǔ)。在植物適應(yīng)低磷環(huán)境中，PHRs轉(zhuǎn)錄因子起著核心調(diào)控作用[18]。然而，迄今為止，未有對(duì)象草 P/pPHRs 基因進(jìn)行鑒定、克隆及分析的報(bào)道， P/pPHRs 參與調(diào)控象草適應(yīng)低磷脅迫的分子機(jī)制仍不清楚。因此，本研究對(duì)象草 P/pPHRs 基因進(jìn)行了全基因組鑒定、生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析，并對(duì)兩個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行了克隆和亞細(xì)胞定位分析，為深入研究 P/pPHRs 基因調(diào)控低磷環(huán)境下象草利用磷素的分子功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)及處理

本研究所用象草（Pennisetumpurpureum）材料由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所“國家熱帶牧草中期備份庫\"（熱帶牧草庫）提供。本研究參照Luo等人方法[19]，利用Magnavaca營養(yǎng)液進(jìn)行水培，其實(shí)驗(yàn)流程簡述為：取象草健壯的種莖進(jìn)行催芽，待種芽長至 10cm 左右，選取均一的幼苗在含有 600μmol?L^-1KH₂PO₄ 的正常供磷營養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)10d，隨后選取長勢(shì)良好且一致的幼苗，分別進(jìn)行正常供磷（HP，添加 600μmol?L^-1KH₂PO₄） 和低磷脅迫（LP，添加 5μmol?L^-1KH₂PO₄） 處理，培養(yǎng)液 pH 值為 5.8～6.0 ，每隔5天更換一次。處理培養(yǎng)15d后，分別收取地上部、葉片和根系樣品，檢測(cè)其干重和全磷含量。同時(shí)，分別在處理培養(yǎng)5，10，15，20d收取不同位置的混合葉片和根系樣品，立即凍存于液氮中，并保存在一 80^°C 冰箱中，用于后期分析基因的相對(duì)表達(dá)水平。象草生物量測(cè)定是將收取的地上部和根系樣品在 105^°C 殺青 30min，70^°C 恒溫烘干后稱量干重。象草全磷含量的測(cè)定是將收取的葉片和根系樣品烘干粉碎后，分別稱取約

0.02g用濃硫酸消煮至無色后，冷卻并定容，采用鉬銻抗比色法，測(cè)定 OD₇₀₀ 的吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算全磷濃度。

1.2象草PHR家族基因的鑒定、生物信息學(xué)及共線性分析

首先，分別以擬南芥（Arabidopsisthaliana）的15個(gè)和水稻（Oryzasatiua）的12個(gè)PHR轉(zhuǎn)錄因子家族成員氨基酸序列為參考，利用Blastp（版本2.5.O）進(jìn)行同源比對(duì)，鑒定象草PHR家族成員。隨后，在Pfam數(shù)據(jù)庫（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/text/）獲取PHR轉(zhuǎn)錄因子的典型保守結(jié)構(gòu)域序列，包括Myb_DNAbinding（PFOO249）和Myb_CC_LHEQLE（PF14379）結(jié)構(gòu)域，利用Hmmsearch搜索象草蛋白序列以鑒定保守結(jié)構(gòu)域。最后，將同源比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域鑒定兩種方法鑒定到的可能PHR轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行合并，再利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線軟件進(jìn)一步確定上述鑒定到的PHR保守結(jié)構(gòu)域。

首先，利用在線軟件Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/預(yù)測(cè)蛋白理化性質(zhì)，包括蛋白氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)、平均疏水指數(shù)。對(duì)于篩選的關(guān)鍵候選基因PpPHR8和PpPHR13，利用在線軟件GSDS（https：//gsds.gao-lab.org/預(yù)測(cè)基因的內(nèi)含子、外顯子結(jié)構(gòu)以及在染色體上的分布；利用在線工具HMMER（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan）預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域Pfam的具體位點(diǎn)；參考Esfahani等人報(bào)道的磷響應(yīng)相關(guān)順式作用元件，選取 P/PPHRδ 和PpPHR13起始密碼子ATG上游 2.0kb 作為啟動(dòng)子序列，結(jié)合PlantCARE數(shù)據(jù)庫（http：//www.dna.affrc.go. jp/PLACE/），預(yù)測(cè)到了三個(gè)磷相關(guān)的順式作用元件，包括P1BS、CACGTG-motif 和PHO element[20]。此外，利用MCScanX工具分析象草 P/pPHRs 的復(fù)制方式，利用Circos軟件繪制了全基因組復(fù)制（wholegenomeduplication，WGD）或片段復(fù)制基因?qū)Φ娜旧w定位共線性圖，并利用Ks_KaCalculator（http：//www.bork.emblde/pal2nal/#Download）計(jì)算共線性基因?qū)Φ姆峭x突變率（Ka，non-synony-moussubstitutions）和同義突變率（Ks，synonymoussubstitutions），參考Zhang等方法估算分化時(shí)間 t= （Ks/2r）×10^-7 （百萬年前），中性突變率 _r=8.12× 10^-9 ，其中 Ka/Ks=1 表示中性選擇， 表示正向選擇， Ka/Kslt;1 表示純化選擇[21]。

1.3象草PHR家族基因的轉(zhuǎn)錄組分析

下載前期轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)，NCBI中SequenceReadArchive（SRA）數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)PRJNA854591[19]。以Zhang等研究中象草基因組序列為參考，在Figshare數(shù)據(jù)庫中（https：//figshare. com/articles/dataset/elepant_grass_genome_fasta/15058173）下載組裝的基因組和基因組注釋信息[21]。利用hisat2軟件，將轉(zhuǎn)錄組fasta序列比對(duì)到參考基因組，并利用FeaturesCounts軟件計(jì)算基因的表達(dá)量，最后運(yùn)用DESeq2軟件基于樣本的原始Reads數(shù)計(jì)算基因的表達(dá)量，并將差異倍數(shù) gt;2 ，校正后的 Plt;0.05 的基因判定為顯著差異表達(dá)基因（Differentiallyexpressedgenes，DEGs）。此外，我們還下載了象草成熟期（生長120d）的根系、不同位置莖和葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，同樣以象草（登錄號(hào)CIAT6263）的基因組為參考，分析了兩個(gè)關(guān)鍵基因PpPHR8和PpPHR13的組織表達(dá)模式。

1.4象草RNA的提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR （qRT-PCR）分析

分別取保存于一 80^°C 的象草根系和葉片樣品約0.1g ，用液氮研磨成粉末后，加入 1mL TRIzol UniversalRNA提取試劑（Tiangen，中國）提取總RNA。隨后，用HiScriptII1stStrandcDNASynthesisKitC +gDNA wiper）（Vazyme，中國）逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，并將cDNA保存于一 20^°C 備用。使用QuantStiduoTMReal-timePCR（Thermofisher，美國）儀器和SYBRqPCRMasterMix（Vazyme，中國）定量試劑盒進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系為 0μL2×i SYBRqPCRMastermix 0.8μL 引物 （10μmol?L^-1） 、 2μL 稀釋10倍的cDNA模板， 6.4μL 至 20μL 。反應(yīng)條件為 95^°C30s，94^°C10s，60^°C30s，72^°C30s，40 次循環(huán)。定量引物見表1，用 2^-ΔΔCT 法計(jì)算基因表達(dá)量，其中基因的相對(duì)表達(dá)量 = 目的基因表達(dá)量/內(nèi)參基因 （PpACTI） 表達(dá)量。

1.5PpPHR8和 PpPHR13 基因的全長克隆和蛋白亞細(xì)胞定位分析

參考Zhang等人測(cè)序象草基因組[21]，獲得P/PHRδ 和 P/PHR13 基因的全長序列，利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)全長度克隆引物（表1）。以上述提取的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：4μL cDNA模板， 1.6μL 引物 （10μmol?L^-1） ，Phanta MaxMaster Mix 10μL（Vazyme ，中國），補(bǔ)充dd H₂O 至 20μL 。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?95^°C5min，95^°C 15s，58^°C15s，72^°C1.5min，72^°C5min，35 次循環(huán)。

設(shè)計(jì)同源克隆引物（表1），以擴(kuò)增好的基因全長片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用一步克隆ClonExpressUltra One Step Cloning試劑盒（Vazyme，中國）連接雙元載體 ?CXSN-GFP ，通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α ，將菌液涂布到LB固體培養(yǎng)基上，37^°C 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12h 后，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定陽性克隆，并送公司測(cè)序鑒定陽性克隆，再擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，參考說明書轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞（上海唯地生物技術(shù)有限公司，中國）。隨后，進(jìn)行煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)的亞細(xì)胞定位分析，大致流程是將農(nóng)桿菌陽性單克隆接種到含有卡那霉素和利福平抗生素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁增殖，當(dāng)菌液 OD₆₀₀=2，5000r?min^-1 離心 5min 收集菌體并重懸后，將 和 分別與mCherry-Nucleus侵染液等體積混合，用不加針頭的注射器將侵染液注射至 6～8 周大小的本氏煙草葉片，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，注射后 48～72h ，利用激光共聚焦顯微鏡NikonC2（Nikon，日本）進(jìn)行熒光觀察并拍照，綠色熒光蛋白激發(fā)波長為 488nm ，mCherry紅色熒光蛋白激發(fā)波長為 587nm 。

1. 6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究相關(guān)數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel2013（MicrosoftCompany，美國）進(jìn)行整理和可視化作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）表示，利用SPSS2O.0軟件（IBM-SPSS，美國）對(duì)相同象草組織的不同磷源處理（高磷HP和低磷LP）下的指標(biāo)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，分析其差異顯著性。

表1基因克隆 RT-qPCR 和亞細(xì)胞定位引物

Table1 Primers used for gene cloning，RT qPCR and subcellular localization analysis

2 結(jié)果與分析

2.1低磷脅迫對(duì)象草生長的影響

低磷脅迫下，象草植株生長矮小，葉片相對(duì)窄短（圖1A）。與高磷處理相比，低磷脅迫處理下象草的根系生物量顯著提高24. 58%（Plt;0.05 ；圖1B），而地上部生物量顯著降低51. 72%（Plt;0.05 圖1C），而總生物量顯著降低38. 70% 。此外，低磷脅迫下根系和地上部的全磷含量和全磷濃度均顯著降低 （Plt;0.05 ；圖1D-1G），而磷利用效率均顯著升高 （Plt;0.05 ；圖1H-1D。結(jié)果表明，低磷脅迫顯著抑制象草生長，降低象草生物量和植株體內(nèi)磷含量，提高了對(duì)磷的利用效率。

2.2象草PHR家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

在象草基因組中，共鑒定到42個(gè) P/pPHRs 基因，依據(jù)象草PHR家族成員在染色體以及Scaffold上的位置依次命名為 P/pPHRI 至 P/PHR42 ，這42個(gè) P/pPHRs 基因不均勻地分布在10條染色體和一條Scaffold上（圖2）。其中，在這10條染色體上，分別分布著2個(gè)（染色體chrA2，chrB3）至7個(gè)（染色體chrA3）PpPHRs 基因（圖2）。這42個(gè) P/pPHRs 基因預(yù)測(cè)長度介于 834～4577bp ；預(yù)測(cè)的氨基酸數(shù)介于133～1032 個(gè)；蛋白分子量介于 14.67～111.91 ；蛋白理論等電點(diǎn)介于 5.34～9.90 ，平均值為7.61，包括18個(gè) （42.86%） 等電點(diǎn)小于7.00的酸性蛋白和24個(gè) （57.14%） 等電點(diǎn)大于7.00的堿性蛋白；所有成員的總平均疏水指數(shù)（GRAVY）均為負(fù)數(shù)，表明42個(gè)PpPHRs蛋白均具有親水性（表2）。

2.3象草PHR家族基因的共線性分析

在象草42個(gè)PpPHRs基因中，無串聯(lián)復(fù)制基因?qū)?，但發(fā)現(xiàn)了32對(duì)起源于WGD或片段復(fù)制的基因?qū)Γ@些共線性基因主要分布在除了chrA4，chrA6，chrB2和chrB6以外的其余10條染色體上，其中染色體chrA3上分布最多的WGD或片段復(fù)制基因（5個(gè)，包括 和PpPHR13（圖2）。此外，這32對(duì)共線性蛋白的相似性介于 42.86% （PpPHR16 vs. PpPHR4O;PpPHR36vs.PpPHR4O）與 98.67% （PpPHR33vs.PpPHR34）之間;平均非同義突變率（Ka）和同義突變率（Ks）分別為0.19和0.90;所有 P/pPHRs 基因?qū)Φ腒a/Ks小于1，表明存在純化選擇，基因傾向于保持其原有功能，非同義突變受到抑制；有10對(duì)基因分化時(shí)間小于1O百萬年前（Million years ago，MYA），包括PpPHR1Ovs.PpPHR31（9.79MYA），PpPHR11vs.PpPHR12（1.23MYA），PpPHR11vs.PpPHR27（8.29MYA），PpPHR12vs.PpPHR27（7.O2MYA），PpPHR15vs.PpPHR35（5.14MYA），PpPHR16vs.PpPHR36（6.07MYA），PpPHR17 vs.PpPHR34（9.24MYA），PpPHR20vs. PpPHR38（6.54MYA），PpPHR22vs. PpPHR41（9.88MYA）和PpPHR33vs.PpPHR34（2.72MYA）（表3）。以上結(jié)果表明，象草 P/pPHRs 基因的擴(kuò)張主要來自WGD或片段復(fù)制，且所有共線性基因受到純化選擇。

注：（A）生長表型；（B）根系干重；（C）地上部干重；（D）根系全磷濃度；（E）地上部全磷濃度；（F）根系全磷含量；（G）地上部全磷含量;（H）根系磷利用效率；（I）地上部磷利用效率。高磷：添加 600μmol?L^{-1 1}KH₂PO₄ 處理，低磷：添加 5μmol?L^{-1 -1}KH₂PO₄ 處理。數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤，每個(gè)處理包括三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。星號(hào)，表示不同供磷水平之間差異顯著，其中 ^?*，Plt;0.05;^**，0.001***，Plt;0.001; ns，差異不顯著。獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，下同

Note：（A）Growthphenotype;（B）otsdrweigt;（C）shotsdryweight;（D）totalPoncentratiosofrot;（E）totalcocentratiost;（F）totalPsotalsfso;ulin）ls.otindicated 250μmol?L^-1KH₂PO₄ added treatment，low phosphate indicated 5μmol?L^-1KH₂PO₄ added treatment. The data are displayed as mean andstandardoE）achtretosstedftlocalatesstesettireogditament，thereinto * Plt;0.05 ^** 0.001

2.4低磷脅迫下象草PHR基因的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析

依據(jù)課題組前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了42個(gè)P/pPHRs 基因的相對(duì)表達(dá)量。依據(jù)基因在不同供磷水平的象草葉片和根系中的相對(duì)表達(dá)水平，我們將基因分為了四組，其中I組17個(gè)PpPHRs基因在高磷和低磷處理的葉片和根系中相對(duì)表達(dá)水平較低；I組16個(gè) P/PHRs 基因在高磷和低磷處理的葉片和根系中相對(duì)表達(dá)水平較高；II組4個(gè) PρPHRs 基因在高磷和低磷處理的葉片中相對(duì)表達(dá)水平較高，而在高磷和低磷處理的根系中相對(duì)表達(dá)水平較低；IV組5個(gè) P/pPHRs 基因僅在低磷處理的葉片中相對(duì)表達(dá)水平較高，而在高磷處理的葉片和根系以及低磷處理的根系中相對(duì)表達(dá)水平較低（圖3）。在低磷脅迫下，有11個(gè) P/pPHRs 基因僅在葉片中顯著上調(diào)表達(dá)，有4個(gè) P/PHRs 基因同時(shí)在葉片和根系中顯著上調(diào)表達(dá)，包括 P/PPHRδ ，PpPHR13，PpPHR17和 P/PHR=ρ ，且 P/PHRδ 和 P/PHR13 分別屬于II組（基因在所有供磷水平和組織中相對(duì)表達(dá)量較高）和I組（基因在所有供磷水平的葉片中相對(duì)表達(dá)量較高）（圖3）。因此，后續(xù)篩選PpPHR8和P/PHR=I3 作為響應(yīng)低磷脅迫的關(guān)鍵候選基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖2象草PHR家族成員共線性分析

Fig.2Synteny analysisof PHR familymembers in elephantgrass

注：圖中黑色曲線表示共線性基因?qū)?；外圍灰色環(huán)形帶表示14條染色體及1條Scaffold

Note：Theblackcuresintediagamconectcolinargenepairs，theutergayiularandsrepresent14cromosomesandofold

2.5象草 PpPHRδ 和 PpPHR13 基因的組織表達(dá)和qRT-PCR分析

依據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組，我們篩選了本底表達(dá)量相對(duì)較高，且在低磷處理的象草葉片和根系中同時(shí)上調(diào)表達(dá)的關(guān)鍵基因 P?PHRS 和 P/PHR13 ，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析。比較 P/PHRS 和 P/PHR13 基因在象草根系、不同位置的葉片和不同生長時(shí)期的莖中相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn) P/PHRδ 和 P?PHR13 分別在根系和莖中相對(duì)表達(dá)量較高，表明PpPHR8和PpPHR13可能分別主要在根系和莖中發(fā)揮功能（圖4）。此外，利用qRT-PCR檢測(cè)了PpPHR8和PpPHR13基因在低磷不同處理時(shí)間的象草根系和葉片中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)PpPHR8在低磷處理5d的葉片和低磷處理10d、20d的根系中顯著上調(diào)表達(dá)，同時(shí)在低磷處理15d的葉片和根系中顯著上調(diào)表達(dá)且上調(diào)最高； P/PHR13 在低磷處理5d的葉片中顯著上調(diào)，同時(shí)在低磷處理15d和20d的葉片和根系中顯著上調(diào)且在低磷處理15d時(shí)上調(diào)最高（圖5）。

2.6象草PpPHR8和 PpPHRI3 的基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子磷響應(yīng)順式作用元件分析

PpPHR8基因編碼序列（Codingsequence，CDS）包含942bp的核苷酸，含有6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子；該基因編碼的蛋白含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即Myb_DNAbindingdomain（靠近氮端的第23＼～74位氨基酸）和Myb_CC_LHEQLEdomain（第118＼～165位氨基酸）（圖6A）。PpPHR13基因CDS包含828bp的核苷酸，含有6個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子；該蛋白同樣包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即Myb_DNAbindingdomain（靠近氮端的第 19～70 位氨基酸）和Myb_CC_LHEQLEdomain（第115～162位氨基酸）（圖6B）。此外，截取了 和 P/PHR13 基因CDS的上游200Obp作為基因的啟動(dòng)子序列，在PpPHR8啟動(dòng)子序列分別預(yù)測(cè)到了5，1和2個(gè)磷響應(yīng)順式作用元件P1BS，CACGTG-motif和PHOelement，在PpPHR13基因啟動(dòng)子序列預(yù)測(cè)到2個(gè)磷響應(yīng)順式作用元件P1BS（表4），結(jié)果表明PpPHR8和

PpPHR13基因均具有磷響應(yīng)功能。

2.7象草PpPHR8和PpPHR13基因序列的克隆

依據(jù)象草 P/PHRδ 和 P/PHR13 基因CDS序列設(shè)計(jì)全長克隆引物（表1），以象草cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PpPHR8和PpPHR13基因全長片段。DNA凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)基因的PCR產(chǎn)物片段均在 750～1000bp 之間（圖7A），經(jīng)過測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，PpPHR8和PpPHR13基因的CDS全長分別為942bp和 828bp 。隨后，以象草的PpPHR8和PpPHR13蛋白序列與11個(gè)雙子葉植物和2個(gè)單子葉植物的PHR蛋白作進(jìn)化樹，結(jié)果顯示雙子葉植物和單子葉植物的PHR蛋白分為兩組，象草的PpPHR8和PpPHR13與水稻OsPHR3、玉米ZmPHR1-Like3最近緣，它們可能具有相似的生物學(xué)功能（圖7B）。

圖3象草 PpPHRs 基因響應(yīng)低磷脅迫的表達(dá)模式分析

Fig.3Expression pattern ol P/PHRs genesin elephantgrassunderlowphosphorus stress

注：HPL-1/2/3，高磷（ 600μmol?L^-1 KH₂PO₄） 處理下三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的葉片樣品；LPL-1/2/3，低磷（ 5μmol?L^-1 KH₂PO₄） 處理下的三個(gè)生物 學(xué)重復(fù)的葉片樣品;HPR-1/2/3，高磷處理下三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的根系樣品;LPR-1/2/3：低磷處理下三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的根系樣品

Note：HPL-1/2/3，Leaves under HP （600μmol?L^-1KH₂PO₄） treatment with three biological replicates;LPL-1/2/3，Leaves underLP 5μmol?L^-1 （20 KH₂PO₄） treatmentwiththreebiologicalreplicates；HPR-1/2/3，RotsunderHPtreatmentwiththreebiologicalreplicates；LPR-1/2/，oots underLP treatmentwith three biological replicates

圖4象草 PpPHRδ 和 PpPHRI3 基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平

Fig.4Relative expression of PpPHR8 and PpPHR13 in different tissues of elephant grass

注：R表示生長120天象草苗的根系；L1/L2分別表示生長120天象草苗的幼嫩葉片和成熟葉片;S1/S2/S3/S4/S5分別表示生長120天象草苗從根到尖端數(shù)的莖的第1/3/5/7/9個(gè)節(jié);H表示葉片的尖端;M表示葉片的中部；T表示葉片的基部；不同顏色表示同一基因在不同組織中TPM的Z評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)化值

Note：Rrepresentste2Odaysoldofelephantgrassrots;L/L2representstedaysoldofelephantgrassyoungandmatureleavsespec tively;S1/2//S/Srepresestedasodoflepantgrassteadtest3d/tththodefroottoetispctivel; Hrepresentsthetipofleaves；Mrepresentsthemiddleofleaves；TrepresentsthebaseoflavesDiferentcolorsrepresentthestandaized z 1 score valves of TPM（transcripts per million） for same gene in different tissues

圖5象草PpPHR8和 PpPHRI3 基因響應(yīng)低磷脅迫的相對(duì)表達(dá)水平。（A）在葉片中的相對(duì)表達(dá)；（B）在根系中的相對(duì)表達(dá)

Fig.5Relative expression levels of P/PHRS and P/PHR13 genes in response to P deficiency in elephant grass.（A）Relativeexpression levels in leaves;（B） Relative expression levels in roots

注：HP，添加 600μmol?L^-1KH₂PO₄ 處理;LP，添加 5μmol?L^-1KH₂PO₄ 處理。R，根系樣品;L，葉片樣品。 5d，10d，15d，20 d分別表示象草分別處理培養(yǎng)5，10，15和20天。HPL，高磷處理下的葉片;LPL，低磷處理下的葉片;HPR，高磷處理下的根系;LPR，低磷處理下的根系。數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤，每個(gè)處理包括三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。柱狀圖表示基因的相對(duì)表達(dá)量，圓圈表示 Log₂ （差異倍數(shù)）

Note：HP indicated 600μmol?L^-1KH₂PO₄ added treatment，LP indicated 5μmol?L^-1KH₂PO₄ added treatment.R，Root samples，L，Leafsamples. 5 d， 10d ， 15d ，and indicate the elephant grass being cultivated and treated for5，1o，15，and 2Odays respectively.HPL，LeavesunderHPtreatment;LPL，LeavesunderLPtreatment；HPR，RotsunderHPtreatment;LPR，RootsunderLPreatmentThedataaredisplayedasmeaandtadardror（SE）achtreatmentcosistedofteeiologicareplicatesTebarhartsowedtheelativeexpionofgenes，and the circle showed Log₂ （Fold change）

2.8象草PpPHR8和PpPHR13蛋白亞細(xì)胞定位分析

在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)PpPHR8和PpPHR13蛋白，分析這兩個(gè)蛋白的亞細(xì)胞定位情況（圖8）。空載體對(duì)照（35S：GFP）的熒光信號(hào)在整個(gè)細(xì)胞中均可觀察到，包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)膜等，而PpPHR8蛋白（35S：PpPHR8-GFP）和PpPHR13蛋白（35S：PpPHR13-GFP）的熒光信號(hào)定位在細(xì)胞核中，表明PpPHR8和PpPHR13均可能在細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能。

3討論

3.1低磷脅迫下象草的生長受到抑制

象草主要在我國南方多個(gè)省份栽培，這些地區(qū)的土壤主要偏酸性，速效磷含量偏低，屬于典型的缺磷土壤類型。在低磷環(huán)境中，植物生長緩慢、植株矮小瘦弱，并且生育期延遲，嚴(yán)重抑制作物產(chǎn)量。一致地，在本研究中，低磷脅迫下，象草表現(xiàn)為株形矮小瘦弱、基部葉片大量衰老（圖1A），并且地上部生物量顯著降低（圖1C），植株的全磷濃度和全磷含量也顯著降低（圖1D-1G）。相反，與正常供磷相比較，低磷環(huán)境下的象草根系生物量顯著升高（圖1B），植株磷利用率顯著提高（圖1H，1I，這與課題組前期研究結(jié)果一致[19]。大量研究證實(shí)，在低磷脅迫下，植物會(huì)通過調(diào)整根系結(jié)構(gòu)以加強(qiáng)磷的獲取，通常表現(xiàn)為分配大量的碳水化合物給根系，促進(jìn)根系的生長，改變側(cè)根、根毛和排根等的數(shù)量和長度，增強(qiáng)根系表面積等[22]，這在多個(gè)物種中均有報(bào)道，包括柱花草（Stylosanthes guianensias）[23]、白羽扇豆（Lupinusalbus）[24]和假地豆（Desmodiumheterophyllum）[25]等。同樣，在不同基因型玉米中，發(fā)現(xiàn)磷高效基因型玉米比磷低效基因型玉米具有更發(fā)達(dá)的根系[26]。因此，磷素的缺乏導(dǎo)致象草磷含量不足，嚴(yán)重抑制其生長，降低其生物量，其會(huì)通過促進(jìn)根系的生長，以緩解和適應(yīng)低磷脅迫。

3.2象草 PpPHRs 的鑒定及可能參與調(diào)控低磷脅迫適應(yīng)過程

在低磷脅迫環(huán)境中，植物進(jìn)化出了一系列的生理、生化和表型策略，以增強(qiáng)磷的吸收和利用緩解低磷脅迫，包括改變根系形態(tài)和構(gòu)型、分泌酸性磷酸酶（有機(jī)酸、核糖核酸酶和質(zhì)子等）提高磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因（PHT1和PHO1的表達(dá)以及與菌根真菌互惠共生等[22.27]。在這些響應(yīng)低磷脅迫的生理生化策略的磷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能基因中，磷饑餓響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子PHR起著核心調(diào)控作用[9]。隨著大量植物基因組測(cè)序的完成，多種植物的PHR家族基因在全基因組范圍內(nèi)被鑒定，包括擬南芥、水稻、玉米和大豆，其中大豆數(shù)目最多為35個(gè)[8]。在本研究中，象草基因組中共鑒定到42個(gè) PHRs 基因，其數(shù)目相對(duì)較多（圖2）。象草PHR家族基因成員較多，可能與其基因組較大（異源四倍體，大小約2.0Gb）和耐逆境脅迫（耐貧瘠土壤、耐熱和抗干旱）的環(huán)境進(jìn)化適應(yīng)密切相關(guān)[21.28]。此外，我們對(duì)象草PHRs的共線性分析發(fā)現(xiàn)，其成員內(nèi)部無串聯(lián)復(fù)制，有32對(duì)基因存在WGD或片段復(fù)制（圖2），其中10對(duì)基因?qū)俳诜只ㄐ∮?0MYA），所有共線性基因均受到純化選擇（表3）。象草基因組復(fù)制研究表明象草主要發(fā)生了三次全基因組多倍化事件，包括約100MYA的象草祖先二倍化，約5OMYA的禾本科植物共有的WGD以及較近期約15MYA的象草特有四倍化事件，推測(cè)象草PHRs基因的擴(kuò)張可能主要來自以上多倍化[21.29]。前期，PHR家族基因被報(bào)道參與多種生物過程，包括影響植物免疫相關(guān)基因30、調(diào)控植物體內(nèi)硫酸鹽和氮素的穩(wěn)態(tài)[31]和調(diào)節(jié)與叢枝菌根真菌的共生11等，但以上過程與磷饑餓響應(yīng)均有一定的直接或間接相關(guān)性[32]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥的AtPHR1（以及其同源基因AtPHL1/2/3/4）、水稻的OsPHR1/2/3和大豆的GmPHR14/32等均受到低磷誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，且其生物學(xué)功能已經(jīng)被證實(shí)參與低磷脅迫的適應(yīng)[8.18]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)有15個(gè) P/pPHRs 基因在低磷脅迫的象草根系和葉片中顯著上調(diào)表達(dá)（圖4），這些基因具有潛在參與調(diào)控象草適應(yīng)低磷脅迫的生物功能，但需進(jìn)一步深人解析。以上結(jié)果顯示，象草 P/pPHRs 基因的擴(kuò)張主要來自WGD或片段復(fù)制，且所有共線性基因受到純化選擇，鑒定到的15個(gè)受低磷誘導(dǎo)顯著上調(diào)P/pPHRs 可能在調(diào)控象草適應(yīng)低磷脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。

3.3象草 和 PpPHRI3 可能在低磷適應(yīng)中發(fā)揮作用

在低磷脅迫的轉(zhuǎn)錄組中，42個(gè) P/pPHRs 基因在象草葉片和根系中的相對(duì)表達(dá)量分為四組，其中我們篩選了分別屬于ⅡI組（相對(duì)表達(dá)量較高）和II（葉片中相對(duì)表達(dá)量較高）且同時(shí)在低磷葉片和根系中顯著上調(diào)的PpPHR8和 P/PHR13 為關(guān)鍵候選基因（圖3）。隨后，組織表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)PpPHR8和PpPHR13分別在根系和莖中的相對(duì)表達(dá)量較高（圖4）。此外，不同低磷脅迫處理時(shí)間的表達(dá)模式顯示， P/PHRδ 和 P?PHR13 在處理15d的葉片和根系中相對(duì)表達(dá)量和上調(diào)倍數(shù)最高，但 P/PHR13 在低磷根系中的相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PpPHR8（圖5）。以上結(jié)果顯示，PpPHR8和 P/PHR13 可能參與象草磷穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。低磷脅迫下，植物會(huì)通過加強(qiáng)根系磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PHT1的表達(dá)以促進(jìn)磷的吸收，同時(shí)提高磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PHO1的活性以加強(qiáng)磷素由根系到莖的轉(zhuǎn)運(yùn)，這可能是由不同的PHR成員參與調(diào)控[18]。磷饑餓響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子PHR屬于MYB-CC型轉(zhuǎn)錄因子，其特征是含有一個(gè)保守的MYBDNA結(jié)合域和一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域[33]，與此一致的是PpPHR8和PpPHR13蛋白在N端均存在這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖6）。共線性分析顯示PpPHR8和PpPHR13可能是由WGD或片段復(fù)制產(chǎn)生的一對(duì)旁系同源基因，預(yù)測(cè)其在78.47MYA發(fā)生分化（圖2；表3）;基因結(jié)構(gòu)顯示PpPHR8和PpPHR13基因分別含有7個(gè)和6個(gè)外顯子（圖6），推測(cè)PpPHR13的第6個(gè)外顯子相對(duì)于PpPHR8可能發(fā)生了外顯子融合或者內(nèi)含子刪除事件。研究表明，內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)分化在重復(fù)基因分化中具有普遍性和重要性，其主要機(jī)制主要包括三類（即插人/缺失、外顯子化/假外顯子化和外顯子/內(nèi)含子獲得/丟失）[34]。前期研究顯示，CACGTG-motif，TATAboxlike，TCelement，NIT2-like，PHOelement和PiBS是參與磷饑餓響應(yīng)的順式作用元件，其中P1BS是PHR轉(zhuǎn)錄因子的綁定位點(diǎn)[20]。在本研究中，PpPHR8和PpPHR13的啟動(dòng)子序列分別含有5個(gè)和2個(gè)P1BS元件，且PHR8啟動(dòng)子序列還含有1個(gè)CACGTG-motif和2個(gè)PHOelement（表4），這與兩個(gè)基因受低磷誘導(dǎo)差異表達(dá)的結(jié)果一致。蛋白進(jìn)化樹分析表明，象草的PpPHR8/13與水稻的OsPHR3和玉米的ZmPHR1-like3最近緣（圖7），他們可能具有相似的功能。前期研究顯示，水稻OsPHR3在轉(zhuǎn)錄水平受低磷脅迫誘導(dǎo)，不僅直接參與調(diào)控低磷環(huán)境中的植物氮磷利用，還參與調(diào)控AM的共生[11.35]。此外，煙草亞細(xì)胞定位分析顯示，PpPHR8和PpPHR13蛋白均定位于細(xì)胞核（圖8），這與轉(zhuǎn)錄因子的功能定位特征完全一致。綜上所述，象草PpPHR8和PpPHR13可能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能，在象草中參與調(diào)控象草的磷饑餓響應(yīng)，但其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖8PpPHR8和PpPHR13蛋白亞細(xì)胞定位分析

Fig.8Subcelluar location of PpPHR8 and PpPHRl3 protein

注：35S：GFP，GFP空載對(duì)照；GFP，綠色熒光蛋白信號(hào);mCherryNucleus，細(xì)胞核定位的mCherry（紅色）熒光信號(hào)；DIC，明場(chǎng)細(xì)胞 圖；Merge，融合GFP，Mecherry-Nucleus和DIC的圖

Note：35S：GFP，GFPemptyvector；GFP，signal ofGFP fusion protein；mCherry-Nucleus，signal ofmCherry（red）fusion nuclear localization sequenceprotein；DIC，bright-field images；Merge，the merged images

4結(jié)論

低磷脅迫下，象草生物量和全磷含量顯著降低，象草生長受到抑制。隨后，在象草基因組中共鑒定到42個(gè) P/pPHRs 基因，生物信息學(xué)分析表明象草PpPHRs基因的擴(kuò)張來自WGD或片段復(fù)制，其中旁系同源基因在進(jìn)化中受到純化選擇。象草低磷脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)15個(gè) P/pPHRs 受低磷誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)。隨后，篩選了兩個(gè)關(guān)鍵候選基因P/PIIRδ 和 P?PHR13 ，對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)模式分析、基因和啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)分析、基因序列克隆和蛋白亞細(xì)胞定位分析，表明PpPHR8和PpPHR13可能在細(xì)胞核中參與調(diào)控象草響應(yīng)低磷脅迫。本研究為深入解析 P/pPHRs 參與象草適應(yīng)低磷脅迫的生物學(xué)功能提供理論參考。

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（責(zé)任編輯劉婷婷）