高效液相色譜法測定干型葡萄酒中紐甜含量的方法優(yōu)化

Optimization of a Method for the Determination of Neotame Content in Dry Wine by High Performance Liquid Chromatography

LI Chunmei （Baoji Quality and Technology Inspection and Testing Center， Baoji 721ooo， China）

Abstract： Objective： To establish a method for determining the content of neotame in dry wine by high performance liquid chromatography by optimizing chromatographic conditions and sample pretreatment steps. Method： The samples were extracted with mixed extracts，concentrated and then analyzed by liquid chromatography. Result： Neotame showed a good linear relationship in the concentration range of 0.06μg?mL^-1 to 6.00μg?mL^-1 ，with a correlation coefficient of 0.999 6.The recoveries of neotame in dry wine at different spiked levels were 83.4% to 93.0% ，and the relative standard deviation （RSD） was lt;3% .Conclusion： This method is simple， rapid and accurate， suitable for large-scale sample detection，and has good practicality and promotion potential.

Keywords： food additives; high performance liquid chromatography; neotame; dry wine

隨著生活品質(zhì)的持續(xù)提升，人們對(duì)食品的訴求早已跨越單純的溫飽階段，轉(zhuǎn)而聚焦于健康與安全。這一深刻轉(zhuǎn)變，有力推動(dòng)了食品添加劑工業(yè)的蓬勃發(fā)展。食品添加劑功能多元，不僅能夠提升加工食品的營養(yǎng)價(jià)值，維持食品的新鮮度，還能優(yōu)化食品的色澤、香氣和口感，大幅改善食品的感官特性，同時(shí)滿足特殊消費(fèi)群體的個(gè)性化需求。在食品行業(yè)中，食品添加劑發(fā)揮著不可或缺的作用，成為推動(dòng)食品行業(yè)創(chuàng)新發(fā)展的重要力量。

紐甜，化學(xué)名稱為N-[N-（3，3-二甲基丁基）-L-α-天冬氨酰]-L-苯丙氨酸-1-甲酯[1]，是一種白色結(jié)晶性粉末，約含 4.5% 的結(jié)晶水，易溶于水，屬于功能性甜味劑。紐甜甜味純正，清新自然，甜度為蔗糖的 8000～12000 倍，阿斯巴甜的40倍以上[2]。紐甜不會(huì)引發(fā)蛀牙，在酸性條件下能保持甜味不變，但在水溶液中，其受溫度、pH值、時(shí)間等因素影響，甜度會(huì)有一定程度的下降。

目前，食品工業(yè)常用的甜味劑包括紐甜、安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖和阿斯巴甜等。這些甜味劑都有相應(yīng)的檢測方法，使用量必須遵循《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760—2024）的要求。GB2760—2024對(duì)酒類產(chǎn)品中紐甜的使用量有嚴(yán)格限制，僅允許在發(fā)酵酒（葡萄酒除外）中使用，允許最大使用量為 0.033g?kg^-1 ，蒸餾酒和葡萄酒中不得添加。然而，部分不良商家為追求經(jīng)濟(jì)利益，通過非法添加紐甜來提高產(chǎn)品的口感，此舉嚴(yán)重?cái)_亂了市場秩序，損害了消費(fèi)者的權(quán)益本研究對(duì)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中紐甜的測定》（GB5009.247—2016）中方法進(jìn)行優(yōu)化，旨在提供一種高效、快速的紐甜檢測方法。

1材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

SPD-20A高效液相色譜儀（配有紫外檢測器），日本島津公司；超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；恒溫電熱板，中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司；渦旋振蕩器，無錫沃信儀器制造有限公司。

1.2材料與試劑

干型葡萄酒，煙臺(tái)凱富葡萄酒有限公司。

甲醇，月旭科技公司；辛烷磺酸鈉，迪馬科技公司；磷酸（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；紐甜標(biāo)準(zhǔn)品（ 1 000μg?mL^-1 ），編號(hào)為BW902596-1000-L，壇墨質(zhì)檢科技產(chǎn)品；超純水。

混合提取液：分別吸取 0.80mL 甲酸和 2.50mL 三乙胺，加水定容至 1000mL ，pH值約為4.5。

離子對(duì)試劑緩沖液：稱取 2.00g 辛烷磺酸鈉用 500mL 水溶解，加入 1.0mL 磷酸，加水定容至1000mL^[3] C

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確吸取 2.50mL 紐甜標(biāo)準(zhǔn)品（ 1 000μg?mL^-1 ）于 50mL 容量瓶中，用混合提取液定容，配制成濃度為 50μg?mL^-1 的紐甜標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別吸取0.012、0.040、0.200、0.400、0.600、0.800、 1.000mL 和1.200mL 紐甜標(biāo)準(zhǔn)工作液（ 50μgmL^-1 ）于 10mL 容量瓶中用混合提取液定容，配制成濃度分別為0.06、0.20、1.00、2.00、3.00、4.00、 5.00μg?mL^-1 和 6.00μg?mL^-1 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品處理

稱取約 10g 混勻試樣于 50mL 具塞塑料離心管中，加入 30mL 混合提取液，振蕩混勻。超聲 15min 后，轉(zhuǎn)移至 50mL 容量瓶中，用混合提取液定容，混勻后待用。

吸取 10.0mL 上述樣液于小燒杯中，置于恒溫電熱板上 110^°C 濃縮至近干，用 1.00mL 混合提取液溶解，渦旋混勻，經(jīng) 0.45μm 濾頭過濾后作為待測液供液相色譜分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱： C₁₈ 色譜柱（ 250mm×4.6mm ， 5μm ）；柱溫： 35°C ；流動(dòng)相：A相為離子對(duì)試劑緩沖液，B相為甲醇；等度洗脫： _A+B=35+65 ；流速：1.0mL?min^-1 ；波長： 210nm ；進(jìn)樣量： 50μL 。

2 結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

與國標(biāo)方法相比，本文在以下幾個(gè)方面進(jìn)行了優(yōu)化： ① 采用等度洗脫替代梯度洗脫，縮短了檢測時(shí)間（約 50% ）； ② 將乙腈替換為甲醇，以減少對(duì)檢驗(yàn)人員、色譜柱和儀器的損傷； ③ 通過實(shí)驗(yàn)確定流動(dòng)相比例為離子對(duì)試劑緩沖液 + 甲醇 =35+65 時(shí)，目標(biāo)峰分離效果最佳； ④ 將檢測波長從 218nm 優(yōu)化至210nm ，以提高目標(biāo)峰響應(yīng)。經(jīng)過優(yōu)化后，色譜條件顯著提高了效率，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

2.2 樣品處理方法優(yōu)化

本研究以干紅葡萄酒作為基質(zhì)，向樣品中添加適量紐甜標(biāo)準(zhǔn)工作液對(duì)樣品進(jìn)行污染。按照1.3.2樣品處理流程對(duì)污染樣品進(jìn)行前處理，分別考察了樣品定容后的取樣體積（10、15、 20mL ）和恒溫電熱板加熱溫度（40、50、60、70、80、90、100、110‰ 和 120°C ）、加熱時(shí)間等因素對(duì)檢測結(jié)果的影響。經(jīng)系統(tǒng)優(yōu)化與分析，最終確定最佳前處理?xiàng)l件為取樣體積 10mL 、加熱溫度 110^qC 、加熱時(shí)間30min （加熱至近干狀態(tài)）。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

對(duì)1.3.1配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為 y=1.37×10^-5x+9.15×10^-3 ，相關(guān)系數(shù)為0.9996，可見紐甜在 0.06～6.00μg?mL^-1 內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)見表 1^[4]

2.4方法的重復(fù)性

稱取 10g 干型葡萄酒空白樣品，分別加入0.2、0.4、 2.0mg?kg^-13 個(gè)水平的紐甜標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)前處理后進(jìn)行測定，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RelativeStandardDeviation，RSD）。如表2所示，3種不同濃度檢測結(jié)果的RSD均小于 3% ，表明方法的重復(fù)性良好[5]。

2.5方法的準(zhǔn)確度

稱取 10g 干型葡萄酒空白樣品，進(jìn)行0.2、0.4、2.0mg^.kg^-1 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。該方法回收率在 83.4%～93.0% ，說明方法準(zhǔn)確度良好。樣品加標(biāo)回收?qǐng)D譜如圖2所示[]

3結(jié)論

本研究通過優(yōu)化高效液相色譜分析條件，建立了高效、準(zhǔn)確檢測干型葡萄酒中紐甜含量的方法。通過選擇適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相（離子對(duì)試劑緩沖液 + 甲醇 =35+65 ）并采用等度洗脫，實(shí)驗(yàn)中獲得了較為理想的出峰時(shí)間、峰形及分離度。選擇 210nm 作為檢測波長，不僅能獲得較好的響應(yīng)值，還能有效提升分離度。同時(shí)，本方法顯著降低了對(duì) C₁₈ 色譜柱和高效液相色譜儀的損害，從而延長了色譜柱和單向閥的使用壽命。在樣品前處理方面，采用超聲振蕩萃取，并通過電熱板加熱濃縮。與國家標(biāo)準(zhǔn)方法相比，本研究建立的分析方法在試劑消耗、實(shí)驗(yàn)時(shí)間、毒性減少及對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的身體傷害等方面均表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。該方法結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性良好，且適用于大批量樣品的檢測，具有較高的推廣應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

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[3]國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中紐甜的測定：GB5009.247—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

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