棉花黃萎病高效拮抗細(xì)菌的篩選及其防治效果

摘要：以棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）為指示菌，采用對峙培養(yǎng)、代謝物抑菌試驗(yàn)篩選高活性生防菌株。通過盆栽試驗(yàn)明確供試菌株的防病效果。結(jié)果表明，從棉花根際土壤分離的1 000余株細(xì)菌中篩選到162株具有生防效果的菌株，采用平板對峙法進(jìn)行復(fù)篩，最終獲得4株綜合效果較好的菌株。其中菌株XJ5-6和XJ6-96的抑菌效果較好，抑菌帶寬度均超過5.0 mm，抑菌率分別達(dá)67.54%和66.86%。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株XJ5-6和XJ6-96混合接種對棉花黃萎病具有較好的防治作用，其防治效果在28 d和40 d分別為32.2%和29.9%，菌株XJ6-96能提高棉花種子的萌發(fā)率。

關(guān)鍵詞：棉花黃萎??； 根際細(xì)菌； 高效拮抗細(xì)菌； 抑菌活性

中圖分類號：S435.621.2；S476+.19" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）12-0067-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.012 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Screening and control effect of highly effective antagonistic bacteria against cotton verticillium wilt

ZHANG De-zheng1， NIE Tai-li1， YANG Jun2， KE Xing-sheng1， YAN De-peng1， NIE Zhang-qing3， ZHONG Min1

（1.Cash Crops Research Institute of Jiangxi Province， Nanchang" 330000，China；2.Jiangxi Jiangmian Technology Development Co.，Ltd.， Jiujiang 332000，Jiangxi，China；3.Jiangxi Agricultural Technology Promotion Center， Nanchang" 330000， China）

Abstract： Using Verticillium dahliae Kleb as indicator bacteria， the biocontrol strains with high activity were screened by confronation culture and metabolite inhibition test. The preventive effect of the tested strain was determined by pot experiment. The results showed that 162 strains of bacteria with biocontrol effect were screened from more than 1 000 strains isolated from cotton rhizosphere soil， and 4 strains with good comprehensive effect were obtained by using the plate face-off method. Strains XJ5-6 and XJ6-96 showed better inhibitory effects， with the band width exceeding 5.0 mm and the inhibitory rate reaching 67.54% and 66.86%， respectively. The results of pot experiment showed that XJ5-6 and XJ6-96 combined inoculation had a good control effect on verticillium wilt of cotton， and the control effect was 32.2% and 29.9% on 28 and 40 days， respectively. XJ6-96 could improve the germination rate of cotton seed.

Key words： cotton verticillium wilt； rhizosphere bacteria； highly effective antagonistic bacteria； antagonistic activity

收稿日期：2023-11-21

基金項(xiàng)目：江西省棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資金項(xiàng)目（JXRS-22）

作者簡介：張德政（1992-），男，河南太康人，助理研究員，碩士，主要從事土壤微生態(tài)研究，（電話）15690606791（電子信箱）zhangdezheng2016@163.com；通信作者，鐘 敏（1982-），男，副研究員，博士，（電話）15170290585（電子信箱）327071001@qq.com；聶樟清（1975-），江西豐城人，高級農(nóng)藝師，（電話）13870620741（電子信箱）nzq.nc@163.com。

棉花黃萎病是棉花生產(chǎn)中重要的土傳病害，可以在棉花整個(gè)生育期造成危害，能夠侵染400多種植物。黃萎病的發(fā)生不僅會(huì)降低棉花的產(chǎn)量而且對棉花的品質(zhì)也有很大的影響，如何防治棉花黃萎病成為當(dāng)前棉花產(chǎn)業(yè)所面臨的重大問題［1］。然而由于病原菌寄主范圍十分廣泛、傳播途徑的多樣化和致病機(jī)理相對復(fù)雜等原因，加上病原菌休眠結(jié)構(gòu)微菌核能夠在土壤中存活多年，抗性種質(zhì)資源以及防治藥劑的缺乏，都為黃萎病的防治工作增加了困難［2］。對黃萎病的防治主要是在抗病育種和農(nóng)業(yè)措施的基礎(chǔ)上利用化學(xué)防治和生物防治等手段。生物防治具有綠色、安全的特點(diǎn)，符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的需求，逐步成為當(dāng)今社會(huì)棉花黃萎病防治工作中的重要舉措，利用有益的拮抗微生物防治土傳病害在世界范圍內(nèi)已有成熟的應(yīng)用實(shí)踐［3］。用于棉花黃萎病防治研究的拮抗微生物主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌三大類［4］。

根際微生物在維持植株健康方面發(fā)揮著重要作用，在20世紀(jì)70年代早期，有研究發(fā)現(xiàn)根際微生物組構(gòu)成了土傳病原菌侵染的第一道防線［5］。根際微生物組的群落種類結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，從物種上而言，根際微生物包括細(xì)菌、真菌、古菌、放線菌、病毒、原生動(dòng)物等多種微生物；從數(shù)量上而言，細(xì)菌占絕對優(yōu)勢，放線菌次之，真菌與其他生物較少。根際細(xì)菌由于從植株的根際分離得到，所以一般都與植株的根有親和力，容易在植物根部定殖，此外根際處微生物活動(dòng)頻繁，更容易獲得拮抗性強(qiáng)的細(xì)菌，而且大多數(shù)細(xì)菌屬于非專性寄生物，能夠人工培養(yǎng)，便于以后在生產(chǎn)上的應(yīng)用。

棉花黃萎病菌的拮抗細(xì)菌主要有芽孢桿菌、棒狀桿菌、黃單胞桿菌、熒光假單胞桿菌、葉桿菌屬和伯克氏菌屬等，其中研究較多的是芽孢桿菌，包括枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌等。大多數(shù)拮抗細(xì)菌是通過產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)影響黃萎病菌菌絲生長來發(fā)揮抑制作用［6］。解淀粉芽孢桿菌41B-1分泌產(chǎn)生的伊枯草菌素可以作為抑菌物質(zhì)，對棉花黃萎病的防效達(dá)50%［7］。周京龍等［8］的研究發(fā)現(xiàn)對棉花接種植物內(nèi)生菌后，棉花植株體內(nèi)的POD和SOD活性均有所提高，進(jìn)而減輕了棉花黃萎病的發(fā)生。拮抗菌X4是從向日葵根際分離出的一種芽孢桿菌，它分泌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能夠?qū)е曼S萎病菌菌絲嚴(yán)重變形［9］。基于拮抗微生物的產(chǎn)品開發(fā)將為棉花黃萎病的防控提供有力保障。

1 材料與方法

1.1 材料

在棉花黃萎病的發(fā)病高峰期，以緊鄰的健康株與病株為研究對象，選取健康植株的根際土樣，用于分離根際細(xì)菌。

根際細(xì)菌分離培養(yǎng)基主要包括營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA），胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），TSA加10 mg/L多黏菌素B，TSA加5 mg/L多黏菌素B和" 10 mg/L萘啶酮酸鈉鹽，TSA加5 mg/L氯化鈉和" " "64 mg/L多黏菌素B，TSA加5 mg/L氯化鈉、64 mg /L多黏菌素B和10 mg/L慶大霉素，蛋白胨酵母瓊脂，R2A瓊脂，黃單胞菌選擇性培養(yǎng)基，寡養(yǎng)單胞菌選擇性培養(yǎng)基，金氏B培養(yǎng)基加13 mg/L氯霉素和40 mg/L氨芐青霉素，共計(jì)11種培養(yǎng)基。

大麗輪枝菌固體培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)采用Czapek液體培養(yǎng)基；供試棉花病原菌為大麗輪枝菌Vd080，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)安排在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，位于河南省安陽縣白璧鎮(zhèn)的試驗(yàn)農(nóng)場，棉花種植、管理與常規(guī)大田相同，試驗(yàn)過程中不進(jìn)行病害防治，不使用任何植物生長調(diào)節(jié)劑。

1.3 棉花根際可培養(yǎng)細(xì)菌的分離

健康根際土樣進(jìn)行混合后，為了盡可能多地培養(yǎng)根際細(xì)菌，梯度稀釋濃度為10-5、10-6、10-7，吸取150 μL懸浮液涂布于11種培養(yǎng)基，每個(gè)濃度各涂布4個(gè)平板，置于20 ℃培養(yǎng)箱，根據(jù)菌落顏色、大小的不同以及菌落邊緣形態(tài)的差異，經(jīng)過2、5、7 d后挑取不同的單菌落，平板劃線法于原培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，純化后的細(xì)菌接種于1/10 TSB培養(yǎng)基，于25 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)后，10 000g離心15 min，去除上清液，加入25%甘油，-80 ℃超低溫冰箱保存，待用。

1.4 根際細(xì)菌種類鑒定

細(xì)菌的DNA沒有太多的蛋白質(zhì)與之結(jié)合，易變性而參與PCR反應(yīng)。分離得到的細(xì)菌純培養(yǎng)以后不經(jīng)過基因組DNA的提取，稀釋以后采用細(xì)菌通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳對正確的條帶進(jìn)行切膠回收，送至北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行相似性比對分析，相似性最高的作為細(xì)菌物種分類的依據(jù)。

1.5 拮抗細(xì)菌的篩選

1.5.1 孢子萌發(fā)試驗(yàn) 大麗輪枝菌Vd080在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d進(jìn)行活化，用滅菌的牙簽在菌落的邊緣挑取少量菌絲，移入Czapeks液體培養(yǎng)基中，150 r/min室溫條件下振蕩，暗培養(yǎng)6～7 d，用4層無菌紗布過濾除去菌絲，將獲得的大麗輪枝菌孢子懸浮液用無菌水稀釋到濃度1×107 CFU/mL。

在PDA培養(yǎng)基上均勻涂布400 μL孢子懸浮液，于超凈工作臺內(nèi)風(fēng)干，在距離中心3 cm處滴加5 μL濃度為1×108 CFU/mL的待測細(xì)菌懸浮液，篩選產(chǎn)生抑菌圈的拮抗細(xì)菌。

1.5.2 平板對峙試驗(yàn) 采用對峙培養(yǎng)法對“1.5.1”中效果較好的拮抗細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步拮抗活性篩選，用7 mm的打孔器打取菌餅，將大麗輪枝菌接種于PDA培養(yǎng)基中央，在距離菌餅2 cm處劃線接種拮抗細(xì)菌，因黃萎病菌大麗輪枝菌Vd080生長較緩慢，試驗(yàn)提前6 d將Vd080轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上。以不接細(xì)菌為對照，每個(gè)處理3次重復(fù)，在28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，測量抑菌帶大小。

菌落直徑=測量菌落直徑平均值-7.0 mm

抑菌率=[對照組菌落直徑-處理組菌落直徑對照組菌落直徑]×100%

1.5.3 牛津杯法抑菌試驗(yàn) 將拮抗效果較好的細(xì)菌分別接種于含有TSB培養(yǎng)基的試管中，于25 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)36 h后，10 000g離心" " 15 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，在平板中倒入薄薄的一層PDA培養(yǎng)基，將滅過菌的牛津杯放入距平板中心2 cm的位置，再加入適當(dāng)PDA培養(yǎng)基，冷卻后接種大麗輪枝菌Vd080菌餅，25 ℃培養(yǎng)6 d，將上述的發(fā)酵液取150 μL加入牛津杯中，每個(gè)處理重復(fù)3次，培養(yǎng)7～8 d，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，計(jì)算抑菌率。

1.5.4 拮抗細(xì)菌對種子發(fā)芽的影響 發(fā)芽試驗(yàn)選用棉花品種新陸中37，種子提前用70%乙醇溶液浸泡1 min，用2%次氯酸鈉浸泡20 min消毒處理，選取" "2株拮抗效果較好的拮抗菌XJ6-96和XJ8-15，放入TSB培養(yǎng)基中搖培，使用其發(fā)酵培養(yǎng)液浸泡棉花種子，濃度調(diào)整為1×108 CFU/mL，考慮到發(fā)酵基質(zhì)對棉花種子發(fā)芽的影響，因此設(shè)置基質(zhì)空白對照，每個(gè)處理重復(fù)3次，每重復(fù)30粒種子，浸種5 h，無菌水將表面沖洗干凈后置于平皿催芽，36 h后調(diào)查棉花種子的發(fā)芽率。

1.5.5 灌根接種法 將2株生防效果較好的拮抗細(xì)菌接種于含有TSB培養(yǎng)基的錐形瓶中，于25 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)72 h后，7 000g離心15 min，然后將菌體懸浮于無菌2%的羧甲基纖維素鈉（CMC）中，接種前通過稀釋平板法調(diào)節(jié)菌液濃度為1×108 CFU/mL，備用。蛭石和曬干的河沙經(jīng)過滅菌后，按6∶4混合均勻，混合物裝入紙缽（直徑6 cm，高10 cm）中，裝至距上沿2 cm處。將滅完菌的新陸中37棉花種子浸泡在濃度為1×106 CFU/mL的拮抗細(xì)菌懸浮液4 h，晾干。每缽分散播種8粒種子，撫平即可，6缽為1個(gè)處理，每處理重復(fù)5次。待棉苗的1片真葉平展時(shí)進(jìn)行接種，接菌前進(jìn)行間苗，拔掉弱苗、小苗，每缽最終保留5株長勢一致的棉苗，接菌前1 d不再進(jìn)行澆水。接菌時(shí)將營養(yǎng)紙缽從塑料盆內(nèi)取出，放置在事先準(zhǔn)備好的干凈塑料布上，將6.5 cm的紙碟放入塑料盆內(nèi)，擺放整齊，紙碟內(nèi)加入10 mL的Vd080孢子懸浮液（1×107 CFU/mL），2 d后處理組分別加入拮抗菌懸浮液10 mL，處理組包括3組，分別是單獨(dú)接種2株拮抗細(xì)菌懸浮液、接種2株拮抗菌懸浮液的混合液、對照組加入10 mL的TSB培養(yǎng)液。

溫室濕度維持在60%～75%，環(huán)境溫度控制在（25±5） ℃，光照良好，澆水要均勻一致，接菌后28、40 d，參照趙麗紅等［10］5級分級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病情況。統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)并計(jì)算拮抗細(xì)菌對病原菌大麗輪枝菌的防治效果。

病情指數(shù)=Σ（各級病株數(shù)×相應(yīng)病級數(shù)值）/（調(diào)查總株數(shù)×4）×100" " （1）

防治效果=（空白對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/空白對照病情指數(shù)×100% " （2）

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel、SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際細(xì)菌的分離與鑒定

利用11種選擇性培養(yǎng)基通過稀釋涂布平板法，根據(jù)菌落大小以及菌落形態(tài)的不同，從2個(gè)品種棉花的健康根際分離獲得1 236株細(xì)菌，分離的細(xì)菌經(jīng)過擴(kuò)增16S rRNA基因后進(jìn)行序列比對，去除重復(fù)，共得到887種不同種類的細(xì)菌，分布在變形菌門、厚壁菌門和水菌門，其中變形菌門占大多數(shù)，占比為81.16%。變形菌門中的沙雷氏菌屬Serratia和腸桿菌屬Enterobacter為分離細(xì)菌中的優(yōu)勢屬。

2.2 分離細(xì)菌對病原菌孢子萌發(fā)的影響

通過測定是否有抑菌圈產(chǎn)生，共有162株有較明顯的抑菌圈產(chǎn)生，占總分離根際細(xì)菌的18.26%，其中有15株的抑菌圈在5 mm以上，能顯著抑制大麗輪枝菌孢子的萌發(fā)（圖1）；選取這15株再進(jìn)行對峙試驗(yàn)，結(jié)果（圖2）表明，有12株根際細(xì)菌有拮抗效果，其中4株抑菌效果極為明顯，抑菌率均在50%以上，分別為XJ3-101、XJ5-6、XJ6-96和XJ8-15，其中XJ5-6的抑菌率達(dá)58.66%。

2.3 離體抑菌試驗(yàn)結(jié)果

選取“2.2”中4株拮抗效果較好的菌株，利用牛津杯法測定其無菌發(fā)酵液對病原菌大麗輪枝菌的拮抗作用。結(jié)果（圖3、圖4）表明，4株菌株對大麗輪枝菌都有不同程度的抑制效果，其中，拮抗細(xì)菌XJ5-6、XJ6-96的無菌發(fā)酵液對病原菌大麗輪枝菌有較好的抑制作用，抑菌率在50%以上，XJ6-96的抑菌率最高，達(dá)66.86%。

2.4 拮抗細(xì)菌對棉花種子發(fā)芽的影響

從分離得到的拮抗細(xì)菌中選擇拮抗效果較好的2株XJ6-96和XJ8-15，研究拮抗菌對棉花種子發(fā)芽率和芽長的影響。從表1、圖5可以看出，與對照相比，拮抗菌XJ6-96顯著提高了棉花種子萌發(fā)率，對芽長也有促生長作用，促長率達(dá)40.30%，而拮抗菌XJ8-15能提高棉花種子的萌發(fā)率，但不具有明顯的促生長作用。

2.5 拮抗細(xì)菌對棉花黃萎病的防治

選取拮抗作用較明顯的XJ6-96和XJ5-6拮抗細(xì)菌，研究其對棉花黃萎病的防治效果。結(jié)果（表2）表明，2株拮抗菌單獨(dú)接種時(shí)，棉花的發(fā)病率和病情指數(shù)與對照之間無顯著差異，在接種后28 d與40 d的調(diào)查結(jié)果一致，單獨(dú)接種的防治效果都在10%以下，對病株率的影響不明顯，室內(nèi)有明顯拮抗作用的2株細(xì)菌對棉花黃萎病并不能發(fā)揮作用。

將2株拮抗菌混合接種處理后，與對照相比，棉花黃萎病的病株率和病情指數(shù)均明顯降低，接菌后28 d和40 d的病株率分別下降了16.9、16.5個(gè)百分點(diǎn)，對大麗輪枝菌的防治效果在2個(gè)時(shí)間段分別為32.2%和29.9%，2株拮抗菌混合接種對棉花黃萎病起到了較好的防治效果（表2）。盆栽試驗(yàn)結(jié)果（圖6）表明，與對照組相比，拮抗菌混合接種后，棉花植株長勢較強(qiáng)，病株數(shù)量和發(fā)病等級明顯下降。

2.6 拮抗細(xì)菌XJ5-6和XJ6-96的分子生物學(xué)鑒定

提取拮抗細(xì)菌基因組DNA，利用16S rRNA基因的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的擴(kuò)增片段交由華大基因科技股份有限公司（武漢）測序。

測序結(jié)果與EZ taxon中的序列比對后，拮抗細(xì)菌XJ5-6和XJ6-96與菌株Klebsiella aerogenes strain ATCC 13048（NR 118556.1）和Klebsiella oxytoca strain JCM 1665（NR 112010.1）的同源性分別達(dá)99.96%和99.98%，驗(yàn)證可信度分別達(dá)89%和94%，確定這2株拮抗細(xì)菌為克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.），記為拮抗菌XJ5-6和XJ6-96。

3 討論與小結(jié)

棉花黃萎病生物防治一直是研究的熱點(diǎn)，由微生物制成的菌劑或菌肥在大田應(yīng)用中受環(huán)境因素影響較大，病害的發(fā)生往往不是單獨(dú)幾種微生物相互作用的結(jié)果，僅引入某一種微生物，很難起到很好的效果。利用菌群的方法防治植物病害越來越引起人們的關(guān)注，最早在小麥上的研究發(fā)現(xiàn)，加入多個(gè)假單胞菌屬組成的菌群對小麥全蝕病的防治效果比菌株單獨(dú)使用更好［11］。擬南芥被病原菌侵染后，3株P(guān)GPR菌株單獨(dú)使用對植物無顯著影響，但混合使用可以激活一系列反應(yīng)來防御葉部霜霉病菌（Hyaloperonospora arabidopsidis），并且可以促進(jìn)植物生長［12］。有研究從煙草根上分離出5株細(xì)菌，將其作為混合菌群接種到煙草急性萎蔫病植株上，煙草植株的死亡率與對照相比顯著降低，減少了52%，只接種3株混合菌時(shí)死亡率減少了36%，但只接種2株混合菌時(shí)，對死亡率無影響，有益微生物菌群的引入更加有效地抑制了病害的發(fā)生［13］。有益菌群增強(qiáng)植物根際抑病功能的機(jī)制可能是微生物菌群的引入增加了可利用微生物資源，它們共同利用一個(gè)群落，可以提高生存率，在時(shí)間和空間上改善了根際環(huán)境［14］。此外，有益微生物存在競爭優(yōu)勢，加劇了與病原菌之間資源的競爭，引起植物免疫防衛(wèi)反應(yīng)［15］。再加上生態(tài)位寬度的提高可以幫助病原菌在根際定殖，最終起到抑制病原菌的作用［16］。

本研究從棉花植株根際分離得到可培養(yǎng)細(xì)菌887株，而大多數(shù)的根際細(xì)菌不能在現(xiàn)有培養(yǎng)基上生長，還有一部分可能因?yàn)樯L緩慢而被其他生長較快的菌株所掩蓋，從而未被分離，導(dǎo)致無法挖掘到對棉花黃萎病有拮抗作用的生防細(xì)菌。本研究結(jié)果表明，單獨(dú)接種1種拮抗菌，對棉花黃萎病的防治效果并不明顯，但2種拮抗菌混合接種能夠顯著降低棉花黃萎病的病株率和病情指數(shù)，對病害的防治有很好的效果。XJ5-6和XJ6-96均屬于克雷伯氏菌屬。克雷伯氏菌屬作為根際促生細(xì)菌（PGPR），2株克雷伯氏菌能夠促進(jìn)煙草根系對氮和磷的吸收，增加植株的干重，促進(jìn)了煙草植株的生長［17］；克雷伯氏菌屬用于生物防治的研究報(bào)道較少，有研究發(fā)現(xiàn)，克雷伯氏菌能夠誘導(dǎo)煙草植株產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性，其代謝產(chǎn)物對軟腐病病原菌有顯著的抑制作用［18］。

試驗(yàn)初步證明了不同菌株構(gòu)成的混合菌群在溫室條件下發(fā)揮作用的可行性，為以后多個(gè)微生物因子混合在大田環(huán)境中的實(shí)際應(yīng)用提供了依據(jù)。拮抗菌XJ5-6和XJ6-96菌株的作用機(jī)理尚不明確，根際的定殖能力、發(fā)酵培養(yǎng)條件也有待進(jìn)一步研究。

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