新疆馬鈴薯黑痣病病原菌的分離及鑒定

摘 要：【目的】分離鑒定引起新疆馬鈴薯黑痣病病原菌，為篩選防治該病藥劑奠定基礎(chǔ)。

【方法】從新疆吉木薩爾縣、奇臺縣、烏魯木齊市達(dá)坂城區(qū)和昭蘇縣等馬鈴薯種植區(qū)采集馬鈴薯塊莖，通過組織分離法從帶有馬鈴薯黑痣病的塊莖分離病原菌，利用電子顯微鏡觀察病原菌的形態(tài)特征，進(jìn)行對峙培養(yǎng)和ITS序列分析，鑒定融合群。

【結(jié)果】從新疆吉木薩爾縣、奇臺縣、烏魯木齊市達(dá)坂城區(qū)和昭蘇縣分離的4株病原菌均能使馬鈴薯塊莖出現(xiàn)馬鈴薯黑痣病癥狀，分離菌株均為AG3融合群。

【結(jié)論】AG3融合群是新疆馬鈴薯黑痣病的主要致病群。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯黑痣?。环蛛x鑒定；融合群

中圖分類號：S436.32"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"" 文章編號：1001-4330（2024）07-1766-06

0 引 言

【研究意義】馬鈴薯是繼水稻、小麥和玉米之后的第4大主糧作物，馬鈴薯營養(yǎng)豐富且適應(yīng)強(qiáng)［1］。馬鈴薯耐蔭喜冷涼、產(chǎn)量高，在新疆溫?zé)崞皆瓍^(qū)二季栽培或林果套作種植，可增加土地復(fù)種指數(shù)。馬鈴薯的生產(chǎn)和營養(yǎng)品質(zhì)均受到生物和非生物脅迫的威脅［2］。新疆北疆馬鈴薯黑痣病發(fā)病率20%～50%，對其產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大。分離與鑒定新疆馬鈴薯黑痣病病原菌對防治該病有實(shí)際意義。【前人研究進(jìn)展】新疆北部沿天山一帶馬鈴薯種植區(qū)病害類型主要包括假單胞菌（Pseudomonas lactis）引起的青枯病、致病性尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的枯萎病、茄病鐮刀菌（Fusarium solani）引起的干腐病、鏈格孢菌（Alternaria sp）引起的早疫病、細(xì)級鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）黑斑病及赤星病菌（Alternaria alternata）引起的赤星病和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的黑痣病等［3］。馬鈴薯黑痣病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的一種土壤傳播和種薯帶菌傳播的真菌病害，通常以菌絲和菌核的形態(tài)習(xí)居于土壤，可侵染包括馬鈴薯在內(nèi)的多種作物，影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)［4］。立枯絲核菌被分為AG1-AG13和AG-BI等14個(gè)融合群，各融合群在形態(tài)、生理、生態(tài)、致病性和寄主等方面均存在一定的差別［5， 6］。關(guān)于引起馬鈴薯黑痣病病原菌（R.solani）的分離鑒定方法包括菌絲融合法、同工酶法和基于核糖體RNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）法。菌絲融合法可以劃分不同融合群，但不能準(zhǔn)確反映融合群種內(nèi)及種間遺傳與變異之間的關(guān)系。rDNA-ITS標(biāo)記法能在分子水平上揭示立枯絲核菌的遺傳變化及多樣性［4］。通過rDNA-ITS標(biāo)記法對立枯絲核菌ITS靶標(biāo)區(qū)域進(jìn)行檢測，是馬鈴薯黑痣病病原菌檢測和遺傳多樣性分析的主要手段［7］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于新疆馬鈴薯黑痣病病原菌融合群種類及生物學(xué)特性等研究的報(bào)道較少。需分離鑒定引起新疆馬鈴薯黑痣病的病原菌。

【擬解決的關(guān)鍵問題】

利用組織分離法、rDNA-ITS標(biāo)記法及融合群鑒定等手段，鑒定新疆馬鈴薯黑痣病病原種類，分析新疆馬鈴薯黑痣病的病原菌類型，為防治新疆馬鈴薯黑痣病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試馬鈴薯樣品及菌株

2020年馬鈴薯收獲期從新疆吉木薩爾縣（ 88°95′E，43°84′N ）、奇臺縣（ 89°79′E， 43°82′N）、達(dá)坂城區(qū)（88°32′E，43°43′N）和昭蘇縣（ 80°55′E，43°62′N）采集薯塊表面長有菌核，感染馬鈴薯黑痣病的病薯樣品，品種為希森6號、冀張薯12號。

中薯3號試管苗、中薯3號原種來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，用于馬鈴薯黑痣病病原菌的回接驗(yàn)證。

立枯絲核菌融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株AG3-PT來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳學(xué)宏老師課題組。

1.1.2 儀器和和試劑

試劑：24∶1氯仿-異戊醇混合液：96 mL氯仿中加入4 mL異戊醇。CTAB溶液：65℃預(yù)熱CTAB溶液后，加入1 mL還原劑。

儀器：離心機(jī)（Eppendorf）、恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、

冷凍混合球研磨儀（RETSCH MM400）、PCR擴(kuò)增儀（BIO-RAD）、

超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）、凝膠成像儀（天能）、

高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅YXQ-100SII）、

電子顯微鏡（日本奧林巴斯Olympus）、pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基及配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：新鮮馬鈴薯（去皮）200 g切成小塊，煮沸15 min，用紗布過濾，加入葡萄糖20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。根據(jù)15或7.5 g/L加入瓊脂，配制成1.5% PDA培養(yǎng)基或0.75% PDA培養(yǎng)基，用于病原菌分離純化和菌株活化培養(yǎng)。

水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：稱取15 g瓊脂，加蒸餾水定容至1 000 mL，121℃滅菌15 min，用于病原菌的分離和融合群鑒定。

SM培養(yǎng)基：稱取100 g麥粒用水浸泡8 h，并與蛭石、黑土、草炭（1∶2∶2）混勻后分裝至錐形瓶，121℃滅菌30 min，用于制備毒土和致病性鑒定。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離及形態(tài)特征的測定

采用組織分離法進(jìn)行黑痣病病原菌的分離。

（1）將馬鈴薯用清水洗凈，放入75％酒精中進(jìn)行組織表面消毒，再用無菌水沖洗3次。用消毒滅菌的鑷子取馬鈴薯塊莖表面菌核，放入WA平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。

（2）當(dāng)WA平板培養(yǎng)的菌核周圍長出白色菌絲，在無菌條件下挑取白色尖端菌絲至新的PDA平板純化培養(yǎng)，純化培養(yǎng)3次后保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）將純化培養(yǎng)的病原菌用5 mm打孔器，沿菌落邊緣切取5 mm的菌餅，接種到PDA平板上，在25℃恒溫條件下培養(yǎng)，第3 d時(shí)挑取菌絲觀察菌絲形態(tài)及觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。第3、7和14 d，觀察菌核在培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)、菌核大小、顏色和外部形態(tài)。

1.2.2 病原菌致病性的測定

（1）土壤接種法：將分離的供試病原菌菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上培養(yǎng)3 d后，用直徑9 mm打孔器，沿菌落邊緣切取菌餅，用滅菌牙簽挑取6個(gè)菌餅至裝有300 g的SM麥粒培養(yǎng)基中，25℃恒溫箱中暗培養(yǎng)20～30 d，產(chǎn)生大量菌核后將麥粒培養(yǎng)基打碎備用。按1∶5的比例將帶菌核SM麥粒培養(yǎng)基與栽培用土混合均勻，制成帶有病原菌的土壤，并接種至栽培有中薯3號試管苗的育苗盆中（馬鈴薯處于苗期）。將接種帶菌土壤的育苗馬鈴薯盆繼續(xù)放置在溫度25～28℃溫室中培養(yǎng)，以不接菌做對照，于馬鈴薯成熟期取樣觀察塊莖上的菌核形態(tài)，并記錄發(fā)病情況。

（2）致病菌的再分離：利用組織分離方法從接種病土并發(fā)病的馬鈴薯塊莖處再次分離致病菌。方法同1.2.1。鑒定PDA平板上生長的致病菌和接種菌株的培養(yǎng)形態(tài)特征是否一致，若一致，可確定分離的菌株為馬鈴薯黑痣病致病菌。

1.2.3 病原菌的鑒定

采用CTAB法提取病原菌基因組DNA。具體方法：收集菌絲到2 mL離心管中，液氮研磨，研磨后離心管中加入以混入還原劑的CTAB溶液700 μL，置于65℃水浴或金屬浴30～60 min，其間每10min晃動離心管，水浴完成后冷卻至室溫。加入0.5 mL氯仿-異戊醇混合液，劇烈震蕩混勻，10 000 r/min離心5 min，吸取上清液于新離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，置于-18℃沉淀30 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清后用75%乙醇洗滌1次，12 000 r/min離心3min，沉淀自然干燥后溶于50 μL去離子水或TE中備用。以通用引物ITS1和ITS4（由生工公司合成）對rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增參照文獻(xiàn)［8］方法。

PCR反應(yīng)體系：引物各1 μL，buffer 10 μL，dNTP 4 μL，酶1 μL，模板DNA 1 μL，以ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火60 s，72℃延伸60 s，循環(huán)30次；72℃補(bǔ)充延伸10 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，30 min）檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物由生工生物科技有限公司測序。用DNAMAN軟件將供試菌株的核糖體DNA-ITS序列與GenBank中的相關(guān)序列ITS區(qū)進(jìn)行比對。表1

1.2.4 融合群的鑒定

采用對峙培養(yǎng)法并參照文獻(xiàn)［3， 9， 10］方法：將待測菌株在PDA平板活化培養(yǎng)3 d，用打孔器沿菌落邊緣打孔生長速度一致的5 mm菌餅。將融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株置于滅菌載玻片的中央，待測菌株菌餅置于距離中央2～3 cm的兩端位置，接種后的培養(yǎng)皿在25℃恒溫生化培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d。當(dāng)待測菌株菌絲與融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株菌絲重疊時(shí)，將菌絲盤輕微移開，在20×放大倍數(shù)下觀察，找到菌絲融合的位置，并在更高的放大倍數(shù)下確認(rèn)（100×和400×）。所有配對重復(fù)3次，并分析至少10個(gè)融合位置。吻合反應(yīng)分為C0：無相互作用；C1：菌絲接觸，無融合，2個(gè)菌株不親和，不屬于同一個(gè)菌絲融合群；C2：細(xì)胞壁在吻合時(shí)融合，相鄰細(xì)胞死亡；C3：細(xì)胞壁和細(xì)胞膜融合無細(xì)胞死亡。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆馬鈴薯黑痣病病薯樣品中病原菌的分離

研究表明，4株分離菌株均具有立枯絲核菌特征，菌絲分枝處多呈直角或銳角，不產(chǎn)生分生孢子。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h左右，菌落直徑達(dá)到8.5 cm，菌絲體初期無色，棉絮狀或絲狀，氣生菌絲較多，隨后逐漸縮短變粗為淺褐色，老熟菌絲有明顯分隔。病原菌生長96 h形成菌核，菌核橢圓形和米粒形，初期白色，老熟菌核呈褐色，內(nèi)外顏色一致，表面粗糙，單個(gè)分散或多個(gè)聚集產(chǎn)生于培養(yǎng)基表面或培養(yǎng)皿壁上。將分離菌株采用液體石蠟保藏法保存?zhèn)溆?。圖1

2.2 病原菌致病性的鑒定

研究表明，將分離獲得的4株病原菌分別轉(zhuǎn)接至SM培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d，制成帶病原菌的毒土，并將制備的帶菌毒土與盆栽基質(zhì)（基質(zhì)：毒土5∶1）混合均勻后回接到健康的中薯3號馬鈴薯植株，以回接無病原菌的SM培養(yǎng)基為對照，將馬鈴薯置于溫室繼續(xù)培養(yǎng)直至收獲。接種病原菌的馬鈴薯塊莖表面形成堅(jiān)硬的黑褐色或暗褐色的黑色菌核，不易沖洗掉，菌核下邊的組織完好，而不接種病原菌的馬鈴薯塊莖表面無菌核，分離的4株病原菌均能引起馬鈴薯塊莖表現(xiàn)出馬鈴薯黑痣病癥狀，并且回接后馬鈴薯塊莖發(fā)病癥狀與從自然發(fā)病薯塊表皮癥狀一致。

從感病馬鈴薯塊莖的病健交界的病斑處再次分離純化出病原菌，與初始接種菌株的形態(tài)一致，分離的4株菌株（編號XJ1-4）均是新疆馬鈴薯黑痣病的致病菌株。圖2

2.3 病原菌種屬及融合群的鑒定

研究表明，分離的4株病原菌均能擴(kuò)增出700 bp大小的條帶。4個(gè)菌株ITS序列與GenBank上已知立枯絲核菌AG3的序列相似度達(dá)到99%以上。

4個(gè)分離菌株均能與AG3標(biāo)準(zhǔn)菌產(chǎn)生點(diǎn)融合或面融合，均屬于AG3融合群。同時(shí)，利用特異性引物AG-2-1-F/R和Rs1F2/AG-3PR2進(jìn)行輔助驗(yàn)證，不加模板及AG2融合群特異性引物AG-2-1-F/R均未擴(kuò)增出條帶，而AG3融合群特異性引物Rs1F2/AG-3PR2的PCR擴(kuò)增均獲得400～500 bp陽性目的片段。

引起新疆馬鈴薯黑痣病病原菌的主要融合群為AG3。圖3，圖4

3 討 論

對峙培養(yǎng)法是測定融合群的有效方法。完全融合分為點(diǎn)融合或面融合，即兩個(gè)菌絲之間產(chǎn)生連接點(diǎn)連接到一起或兩個(gè)菌絲全部緊貼融合在一起［9］。馬鈴薯黑痣病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的土傳和種傳真菌病害。黑痣病病原菌侵染幼芽導(dǎo)致幼芽壞死，侵害地下莖和匍匐莖形成潰瘍斑，在薯塊表皮形成菌核（黑色或褐色顆粒）［11］，嚴(yán)重發(fā)病時(shí)馬鈴薯黑痣病可造成馬鈴薯的產(chǎn)量損失達(dá)50%以上。目前在種植中缺乏抗馬鈴薯黑痣病的品種，尚未發(fā)現(xiàn)免疫或高抗馬鈴薯黑痣病的品種［12］。

立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）融合群類群的分布在不同地區(qū)間存在較大差異。研究分離到的新疆馬鈴薯黑痣病病原菌的菌絲生長速度快，分枝處多呈直角或銳角，不產(chǎn)生分生孢子，菌絲體初期白色為棉絮狀或絲狀，后逐漸縮短變粗為淺褐色，老熟菌絲有明顯分隔，與報(bào)道的馬鈴薯黑痣病病原菌的形態(tài)特征一致［13］。通過對峙培養(yǎng)和特異性引物驗(yàn)證，確定了從新疆馬鈴薯塊莖上分離的病原菌均為AG3融合群，與文獻(xiàn)報(bào)道的馬鈴薯黑痣病病菌優(yōu)勢融合群為AG3相一致［8， 14］。Yang等［15］從新疆馬鈴薯塊莖上分離了AG-3和AG-4-HG-1，植株上分離了AG2-1、AG-3和AG-4-HGⅠ、AG-4-HGⅡ和AG5 ，而研究中僅從塊莖樣本中分離到AG3融合群，是因?yàn)椴訕?biāo)本的來源或發(fā)生地不同，馬鈴薯黑痣病病原菌種類構(gòu)成存在一定的差異性，且某些融合群主要侵染馬鈴薯的植株［14， 16］。

AG1‐IB、AG2‐1、AG‐3、AG4‐HG‐Ⅰ、AG4‐HG‐Ⅱ、AG4‐HG‐Ⅲ、AG‐5、AG‐7、AG‐9和AG11等10個(gè)融合群及其亞群均能引起馬鈴薯黑痣病［15，17］，不同地區(qū)分布規(guī)律有差異且遺傳變異性大，抗逆性強(qiáng)，給該病害的防治增加了難度。通過早期識別和提前防控對提高馬鈴薯產(chǎn)量具有重要的作用［20-21］。通過rDNA-ITS標(biāo)記法及融合群鑒定明確不同馬鈴薯種植區(qū)馬鈴薯黑痣病病原菌融合群種類，并有針對性地開展病原菌的生物學(xué)特性研究，將有助于闡明優(yōu)勢致病融合群的生長條件與環(huán)境的關(guān)系，從而針對性地選擇有效殺菌劑［5， 12］。

4 結(jié) 論

從新疆吉木薩爾縣、奇臺縣、達(dá)坂城區(qū)和昭蘇縣等4個(gè)馬鈴薯種植區(qū)感染了馬鈴薯黑痣病的塊莖上分離病原菌，分離菌株菌絲分枝處多呈直角或銳角，不產(chǎn)生分生孢子，菌絲體初期無色，棉絮狀或絲狀，生長96 h形成菌核，菌核橢圓形和米粒形，初期白色，老熟菌核呈褐色；AG3融合群為當(dāng)?shù)伛R鈴薯主要的致病融合群。

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Isolation and identification of the pathogen for

potato black scurf in Xinjiang

SHEN Hongfei1，2， JIA Fenglian1， LIU Yi2， WU Yan2， YANG Ruwei2， SUN Hui2， LI Guangyue1

（1.Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China; 2.Xinjiang Academy of Agricultural Sciences Comprehensive Test Farm， Urumqi 830000， China）

Abstract：【Objective】 To isolate and identify the pathogen causing potato black scurf in Xinjiang in the hope of providing a foundation for screening of control agents and establishment of control technology.

【Methods】" Potato tubers were collected from Jimsar， Qitai， Dabancheng and Zhaosu in Xinjiang， and Rhizoctonia solaniwere isolated from tubers with potato black scurf by tissue separation method. Anastomosis groups of Rhizoctonia solaniwere identified by paired culture and ITS sequence analysis.

【Results】" The four strains isolated from Jimsar， Qitai， Dabancheng and Zhaosu were all able to cause the symptoms of potato black scurf on potato tubers. The isolated strains were Anastomosis groups AG3.

【Conclusion】 Anastomosis Groups AG3 is the main pathogenic group of potato black scurf in Xinjiang.

Key words：potato black scurf； isolation and identification; anastomosis groups

Fund projects：Regional Collaborative Project of Xinjiang Uyghur Autonomous Region（S amp; T Assisting Xinjiang Project） （2021E02024）; Natural Science Foundation of Xinjiang Autonomous Region （2022D01F69）; China Agriculture Research System- -National Potato Industry Technology System （CARS-09-ES36）; Key Ramp;D Program of Xinjiang Autonomous Region （Linkage between departments and departments） （2022B02044）.

Correspondence author： LI Guangyue （1983-）， male， from Cangzhou， Hebei， research fellow， doctoral supervisor，research direction： biological control of plant diseases， （E-mail）liguangyue@caas.cn

YANG Ruwei （1984-）， female， from Lingwu， Ningxia， senior agronomist， research direction： plant protection， （E-mail）617950493@qq.com

收稿日期（Received）：

2024-01-05

基金項(xiàng)目：

新疆維吾爾自治區(qū)區(qū)域協(xié)同創(chuàng)新專項(xiàng)（科技援疆計(jì)劃）（2021E02024）；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（地州科學(xué)基金）項(xiàng)目（2022D01F69）；國家馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-09-ES36）；新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（廳廳聯(lián)動） （2022B02044）

作者簡介：

沈洪飛（1989-），男，云南昆明人，助理研究員，研究方向?yàn)轳R鈴薯育種及病害防治，（E-mail）hongfeiscience@163.com

通訊作者：

李廣悅（1983-），男，河北滄州人，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锊『ι锓乐?，（E-mail）liguangyue@caas.cn

楊茹薇（1984-），女，寧夏靈武人，碩士，正高級農(nóng)藝師，研究方向?yàn)橹参锉Ｗo(hù)，（E-mail）617950493@qq.com