頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法結合自動解卷積技術分析葛根中的揮發(fā)性成分

張鵬云，李 蓉*，陳麗斯，林淑綿，楊 芳，張 峰

（1.中山出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東 中山 528400；2.廣東藥科大學公共衛(wèi)生學院，廣東 中山 528458；3.中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所，北京 100176）

葛根（Pueraria Radix）是豆科植物野葛（P. lobata Willd. Ohwi）的干燥根，主要種植于我國河南、河北、湖南、遼寧、廣東、浙江等地[1]。葛根含有豐富的淀粉、膳食纖維、糖類等物質(zhì)，還含有多種黃酮類化合物，如大豆素、葛根素、黃豆苷、葛根素木糖苷等[2-3]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載其味甘、辛，涼。歸脾、胃、肺經(jīng)。有解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽止瀉，通經(jīng)活絡，解酒毒等功效[4]。現(xiàn)代藥理學研究表明，葛根具有改善心腦血管疾病、降血糖、降血脂、抗腫瘤、解酒等作用，在臨床上可用于治療高血壓、心絞痛、冠心病、偏頭疼、糖尿病、腸道病變等疾病[5-6]。

目前國內(nèi)外對葛根的研究與開發(fā)主要集中在葛根多糖[7]、葛根素[8]、異黃酮類化合物提取[9]等方面，而對其揮發(fā)性化學成分的研究鮮有報道。為更好開發(fā)利用葛根，本研究采用頂空固相微萃取的方式，直接萃取葛根樣品中的揮發(fā)性成分，然后利用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測分析。與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法相比，頂空固相微萃取技術具有簡單便捷、靈敏度高、節(jié)約成本、無需溶劑等優(yōu)點[10]，能夠更加真實地反映出樣品中的揮發(fā)性成分，在揮發(fā)性物質(zhì)分析中具有顯著優(yōu)勢。由于色譜的分離能力有限，一些結構、極性相似的組分色譜峰會發(fā)生部分或完全重疊，此時按照常用的NIST譜庫檢索方法無法得到準確的匹配結果[11]。而自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)（automated mass spectral deconvolution and identification system，AMDIS）能夠對揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖進行自動解卷積處理，可以提取未知組分更“純凈”的質(zhì)譜圖，此時再通過譜庫檢索結合保留指數(shù)來匹配化合物[12-13]，使定性結果更加準確。

本研究以葛根為研究對象，采用頂空固相微萃取技術結合氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜對其揮發(fā)性成分進行檢測，并對其萃取條件進行優(yōu)化，并利用AMDIS和保留指數(shù)對各組分進行定性分析。該方法自動化程度高、操作簡單、快速、結果準確可靠，可為葛根的進一步研究與開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根干藥材（產(chǎn)自廣西） 中山市中智大藥房連鎖有限公司；正構烷烴混合標準品（C7～C40） 美國O2si公司。

1.2 儀器與設備

TSQ 8000氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（配電子電離源及Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）、TRIPLUS RSH自動進樣器、20 mL頂空樣品瓶、固相微萃取自動進樣手柄美國Thermo公司；50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）固相微萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 頂空固相微萃取

準確稱取葛根碎塊3.0 g置于20 mL頂空瓶中（配有聚四氟乙烯墊的螺紋密封蓋），自動進樣器將頂空瓶放在具有一定溫度的孵化爐中平衡數(shù)分鐘后，將已老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭迅速插入樣品瓶頂空部分進行熱吸附，然后將吸附后的萃取頭插入氣相色譜進樣口，在250 ℃條件下進行解吸，進入氣相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)進行分離檢測。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜檢測條件

色譜條件：TR-PESTICIDE彈性石英毛細柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持1.0 min，然后以5 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min的速率升溫至250 ℃并保持2.0 min；分流比10∶1；進樣口溫度250 ℃；載氣為99.999%高純度氦氣；流速1.2 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子電離源；離子源溫度280 ℃；傳輸線溫度280 ℃；電子能量70 eV；掃描方式為全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～400。

1.3.3 揮發(fā)性成分計算

在單因素試驗和正交試驗中，扣除總離子流圖中的雜質(zhì)和柱流失的峰后，對揮發(fā)性物質(zhì)的峰進行積分，再利用軟件導出到Excel表格中，得到各條件下的葛根揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積和峰數(shù)目。

應用AMDIS對葛根中揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖自動進行反卷積處理，所分辨的質(zhì)譜在NIST 2.2標準譜庫中檢索，根據(jù)匹配度、保留指數(shù)和文獻已報道物質(zhì)進行核對，只選擇正匹配和反匹配均大于800的物質(zhì)，并用峰面積歸一化法計算葛根各揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量。

保留指數(shù)是C7～C40正構烷烴混標在和葛根樣品相同的分析條件下進樣后，AMDIS根據(jù)正構烷烴的保留時間，自動計算出各揮發(fā)性組分的保留指數(shù)。

1.3.4 單因素試驗

頂空固相微萃取法的萃取效果受萃取時間、萃取溫度、平衡時間、解吸時間、樣品體積等條件的影響[14]，本研究在預實驗基礎上，選取揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積和峰數(shù)目為考察指標，比較不同萃取溫度、平衡時間、萃取時間、解吸時間對葛根揮發(fā)性物質(zhì)萃取效果的影響，并確定優(yōu)化參數(shù)。

在預實驗的基礎上，稱取葛根碎塊3.0 g，放入20 mL頂空瓶中，并使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在萃取時間30 min、平衡時間10 min、解吸時間5 min的條件下，考察不同萃取溫度（50、60、70、80、90 ℃）的萃取效果，每個樣品重復3 次；在確定萃取溫度的基礎上，研究不同平衡時間（4、7、10、13、16 min）的萃取效果，其余條件不變，每個樣品重復3 次；在確定萃取溫度、平衡時間的基礎上，研究不同萃取時間（30、40、50、60 min）的萃取效果，其余條件不變，每個樣品重復3 次；在最佳條件下，研究不同解吸時間（3、5、7、9 min）的萃取效果，其余條件不變，每個樣品重復測定3 次。

1.3.5 正交試驗設計

在單因素試驗結果基礎上，平衡時間固定為13 min，選擇萃取溫度、萃取時間和解吸時間3 個影響因素，利用SPSS 19.0設計3因素3水平正交試驗，優(yōu)化試驗參數(shù)，L9（34）正交試驗設計如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and coded levels used in orthogonal array design

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖像處理采用Microsoft Excel軟件完成。根據(jù)1.3.3節(jié)得到各條件下葛根揮發(fā)性組分的總峰面積和峰數(shù)目，計算各條件下3 次平行實驗結果的總峰面積，結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 萃取溫度對萃取效果的影響

圖1 萃取溫度對葛根揮發(fā)性成分萃取效果的影響Fig. 1 Effect of extraction temperature on the recovery of volatile compounds from Pueraria Radix

如圖1所示，隨著萃取溫度的升高，葛根揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積和峰數(shù)目都不斷增加。當溫度超過70 ℃時，總峰面積先急劇升高后緩慢增加；而峰數(shù)目在50～70 ℃時上升趨勢顯著，超過70 ℃時，變化不大。這說明，當萃取溫度到達80 ℃時，葛根中的絕大部分揮發(fā)性物質(zhì)已經(jīng)揮發(fā)出來，并被萃取頭吸附。這是因為揮發(fā)性物質(zhì)在低溫條件下?lián)]發(fā)速度慢，達到動態(tài)平衡所需時間長；而當溫度升高時加快了揮發(fā)性組分的運動速率，促進了萃取頭對目標物的富集吸附[15-16]。但是高溫下低沸點組分在與高沸點化合物的競爭吸附中處于劣勢地位，使得部分低沸點化合物流失[17]。另外，高溫還可能使部分揮發(fā)性化合物發(fā)生變性或裂解[16]。綜合考慮，本研究選擇萃取溫度為80 ℃。

2.1.2 平衡時間對萃取效果的影響

圖2 平衡時間對葛根揮發(fā)性成分萃取效果的影響Fig. 2 Effect of equilibration time on the extraction of volatile compounds from Pueraria Radix

葛根中的揮發(fā)性物質(zhì)在氣相中達到平衡所需要的時間即為平衡時間[18]。如圖2所示，隨著平衡時間的延長，揮發(fā)性成分的總峰面積先不斷增大后減小，在13 min時達到了最大值。當延長平衡時間時，揮發(fā)性組分的數(shù)目先緩慢增加后略有減少，在13 min時達到最高值，總體差異不明顯。由此表明，當平衡時間為13 min時，揮發(fā)性物質(zhì)在氣相中達到了較平衡的狀態(tài)，萃取效果穩(wěn)定，有利于萃取頭吸附。所以本研究將平衡時間設定為13 min。

2.1.3 萃取時間對萃取效果的影響

圖3 萃取時間對葛根揮發(fā)性成分萃取效果的影響Fig. 3 Effect of extraction time on the recovery of volatile compounds from Pueraria Radix

頂空固相微萃取是一個動態(tài)平衡過程，當分析物在萃取頭、頂空和樣品3 相中達到平衡時的萃取效果最好，所需時間即為萃取時間[19]。由圖3可知，隨著萃取時間的延長，總峰面積呈先增加后降低的趨勢，而峰數(shù)目變化不大。當萃取時間達到50 min時，總峰面積和峰數(shù)目均達到最大值，說明此時揮發(fā)性物質(zhì)達到較平衡狀態(tài)，萃取頭處于飽和吸附狀態(tài)；當萃取時間超過50 min時，總峰面積和峰數(shù)目均有減小的趨勢，萃取效果降低。這是由于隨著萃取時間的延長，揮發(fā)性物質(zhì)逐漸在3 相中達到平衡狀態(tài)，然后被萃取頭吸附。萃取時間過短時，揮發(fā)性化合物被吸附不充分；萃取時間過長時，已經(jīng)被萃取頭吸附的組分可能逸出，出現(xiàn)解吸附現(xiàn)象，大大降低了萃取效果[20]。綜合考慮，本研究選擇萃取時間為50 min。

圖4 解吸時間對葛根揮發(fā)性成分萃取效果的影響Fig. 4 Effect of desorption time on the recovery of volatile compounds from Pueraria Radix

2.1.4 解吸時間對萃取效果的影響

在同一解吸溫度下，解吸時間的長短與揮發(fā)性物質(zhì)從萃取頭固定相中的解吸程度直接相關。當解吸時間短，揮發(fā)性組分解吸不完全時，不但影響方法的靈敏度，還會使后續(xù)樣品分析受到污染[21]；反之，當解吸時間過長時，雖然待測組分能夠完全解吸，但是會導致峰形變寬，高溫下部分組分發(fā)生氧化，并且影響萃取頭的使用

壽命[15-16,22]。從圖4可以看出，隨著解吸時間的延長，揮發(fā)性組分的總峰面積和峰數(shù)目均呈先增加后減小的趨勢，且在5 min時均達到最大值。說明此時，揮發(fā)性組分已解吸完全，再延長時間反而會因為損害萃取頭、峰形寬等原因降低萃取效率。因此，本研究選擇解吸時間為5 min。

2.2 正交試驗結果

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Results and analysis of orthogonal array experiments

如表2所示，由直接觀察分析可知最佳組合參數(shù)為4號方案即A3B2C2，而從極差結果來看，當以總峰面積作為萃取效果的考察指標時，3 個因素對萃取效果的影響程度為A＞B＞C，即萃取溫度影響最大，萃取時間和解吸時間影響次之，較優(yōu)組合為A3B2C2；當以峰數(shù)目為指標時，較優(yōu)組合同樣為A3B2C2，因素主次為A＞B＞C。因此，在本研究中，對于不同的考察指標，3 個因素對萃取效果的影響大小順序相同，均為A＞B＞C，且直接分析與極差分析結果一致。因此，最終確定頂空固相微萃取法萃取葛根揮發(fā)性成分的較優(yōu)條件為：萃取溫度90 ℃、平衡時間13 min、萃取時間50 min、解吸時間5 min。

2.3 較優(yōu)條件下葛根揮發(fā)性成分分析

根據(jù)正交試驗優(yōu)化后的頂空固相微萃取條件，對葛根揮發(fā)性成分進行萃取并檢測分析，其揮發(fā)性物質(zhì)成分的總離子流圖見圖5，揮發(fā)性組分及相對含量如表3所示。

圖5 葛根揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖Fig. 5 Total ion chromatogram of volatile compounds in Pueraria Radix

表3 葛根的揮發(fā)性成分Table 3 Volatile components identification from Pueraria Radix

續(xù)表3

由表3可知，在較佳條件下葛根揮發(fā)性成分總離子流圖共分離得到91 種組分，并鑒定出其中67 種成分，占揮發(fā)性物質(zhì)總量的88.91%，包括烯烴類、醛類、酯類、醇類、酮類及其他類化合物。其中，相對含量最高的為酯類，有11 種，占揮發(fā)性物質(zhì)總量的26.05%；其次為醛類22 種（22.16%），醇類9 種（13.85%），酮類5 種（5.59%），萜烯類8 種（2.88%）。另外相對含量從高到底排名前10的依次為廣藿香醇（9.72%）、十六酸乙酯（7.63%）、大茴香腦（6.61%）、糠醛（5.93%）、亞油酸乙酯（4.80%）、醋酸（4.28%）、7,10-十八碳二烯酸甲酯（3.70%）、十六酸甲酯（3.64%）、己醛（3.60%）和2-正戊基呋喃（3.58%），占揮發(fā)性成分總量的53.49%。

從表3可以看出，酯類化合物是葛根的主要香氣成分，其中十六酸乙酯的相對含量最高（7.63%），呈微弱蠟香、果爵和奶油香氣；其次為亞油酸乙酯（4.80%），具有臘腸風味。

醛類化合物一般具有良好的風味，也是本研究中葛根樣品的主要呈香物質(zhì)。其中，壬醛、己醛、苯甲醛、癸醛、庚醛等化合物具有青草香、花香和水果的甜味[23]；反-2-辛烯醛、正辛醛等呈黃瓜和柑橘樣香氣[24]；而2-甲基丁醛具有獨特的可可和咖啡香氣[24]。這些酮類物質(zhì)可能來源于氨基酸與葡萄糖發(fā)生降解反應所產(chǎn)生。

葛根中的醇類呈香物質(zhì)主要為廣藿香醇（9.72%），具有較淡的廣藿香香氣；而苯乙醇具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣[16]，相對含量為0.37%；1-辛烯-3-醇和α-松油醇分別呈現(xiàn)出蘑菇香味和樟腦氣味[21]，相對含量分別為0.15%和0.09%。

酮類物質(zhì)具有令人愉快的檸檬草香、奶香、果香等氣味，少數(shù)具有油脂氣息[23]。而相對含量較高的醚類化合物大茴香腦（6.61%）具有茴香的特殊氣味，味甜。這些具有風味的化合物構成了葛根的主要揮發(fā)性成分，對這些芳香物質(zhì)進行檢測能夠反映葛根產(chǎn)品的品質(zhì)，并為葛根產(chǎn)品的鑒定和評價提供參考。

另外本研究檢測到的檸檬烯具有抗腫瘤、抗氧化應激、抗炎等生理活性，臨床上可以用于溶解膽結石、緩解胃灼熱等治療[25]；大茴香腦具有暖胃、健胃、驅寒、消炎、止痛等作用，還可當作增香劑用于糖果、牙膏、飲料等產(chǎn)品中[26]；據(jù)陳曉盈[27]研究報道β-廣藿香烯具有抗炎、抗急性肺損傷的作用；廣藿香醇具有抗炎、抑制多種真菌無性繁殖的作用[28]；α-松油醇對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌等常見病原菌具有一定的殺滅作用[29]，還具有抗痙攣[30]、抗炎[31]等作用。

本研究鑒定出葛根揮發(fā)性組分與其他文獻報道有一定差異。李耀華等[32]采用水蒸氣蒸餾法提取四川、湖南、廣西3 個產(chǎn)地葛根中揮發(fā)油，并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測各產(chǎn)地葛根揮發(fā)油組分，結果顯示3 個產(chǎn)地葛根揮發(fā)油分別鑒定出20、24、21 種組分且含量最高的均為亞油酸。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，本研究鑒定出的葛根揮發(fā)性成分遠多于上述文獻報道，說明該檢測方法和定性分析手段具有顯著的優(yōu)越性。

3 結 論

本研究通過單因素試驗和正交試驗確定頂空固相微萃取法提取葛根揮發(fā)性成分的較佳參數(shù)為：稱取葛根碎塊3.0 g，放入20 mL頂空瓶中，并使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在90 ℃條件下平衡13 min，萃取50 min，最后在進樣口解吸5 min。

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對較佳條件下萃取的葛根揮發(fā)性物質(zhì)進行檢測，并利用AMDIS和保留指數(shù)對其組分進行定性分析，最終鑒定出67 種化合物。其中，相對含量最高的為酯類（26.05%），其次為醛類（22.16%）、醇類（13.85%）、酮類（5.59%）、萜烯類（2.88%）等，對這些揮發(fā)性化合物進行檢測能夠反映葛根產(chǎn)品的品質(zhì)。該方法自動化程度高、操作簡單、定性更加準確、結果更加可靠，為葛根品質(zhì)的鑒定和評價提供了有力支持，也為葛根產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了理論基礎。該方法也可以應用到其他藥食同源植物揮發(fā)性成分檢測分析中，為控制藥食同源產(chǎn)品質(zhì)量，促進藥食同源產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了科學支持。