靈芝中17 種農(nóng)藥的QuEChERS-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用快速檢測技術(shù)

崔麗麗，閆梅霞，逄世峰，周春元，王英平*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112）

靈芝屬于擔(dān)子菌綱、多孔菌科、靈芝屬，是一種非常名貴的食藥用大型真菌，具有重要經(jīng)濟和藥用價值，在我國應(yīng)用已有2 000多年的歷史。全世界已報道種類200余種[1]，中國藥典中收錄入藥為赤芝（Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.)）或紫芝（Ganoderma sinense Zhao(Xu et Zhang)）干燥子實體[2]。在我國東北地區(qū)靈芝種類分布減少，松杉靈芝（Ganoderma tsugae）是東北地區(qū)最常見種類[1]。隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，靈芝需求量增加。目前，栽培靈芝逐漸成為靈芝的主要來源。靈芝的栽培方式有袋料栽培、段木栽培、仿野生林下栽培等[3]。靈芝在制種期和栽培期有多種病菌和雜菌導(dǎo)致病害發(fā)生，侵染性病害主要為青霉菌污染率高達80%～90%，靈芝害蟲也多達16 種[4-12]。為降低病蟲害穩(wěn)定產(chǎn)量提高經(jīng)濟產(chǎn)值，藥劑防治是必要措施之一。引起食用菌農(nóng)藥殘留的因素有病蟲害防治過程中化學(xué)農(nóng)藥的使用，也有水土中殘留農(nóng)藥的污染，或是栽培料中殘留[13-17]。目前主要研究集中于靈芝栽培技術(shù)和有效成分研究，在農(nóng)藥檢測上報道有限。隨著國際貿(mào)易增加和對食品安全關(guān)注，重金屬和農(nóng)藥殘留已成為必檢項目，GB 2763—2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定我國食用菌農(nóng)藥殘留指標(biāo)有21 項，涉及26 種農(nóng)藥，其中有19 項為最大殘留限量，有2 項為臨時限量[18]。我國是世界食用菌產(chǎn)量大國，我國食藥用菌類產(chǎn)品出口美國、日本、韓國和歐盟等發(fā)達國家地區(qū)，由于生產(chǎn)方式和標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)差異等原因，食藥用菌出口貿(mào)易原因受到扣留或召回，2011—2016年被召回或扣留595 批次，其中農(nóng)殘超標(biāo)引起的有219 批次，占37%[19-20]。而且已有研究發(fā)現(xiàn)靈芝等食用菌對農(nóng)藥具有富集性[21-23]，農(nóng)藥檢測結(jié)果極易存在假陰性。因此，加強農(nóng)藥殘留檢測方法和農(nóng)藥合理使用技術(shù)研究，這不僅有利于食用菌產(chǎn)品的出口貿(mào)易，更關(guān)乎我國的食品安全和環(huán)境保護。

食用菌農(nóng)藥提取凈化的前處理方法常見的有均質(zhì)提取、超聲提取、加速溶劑萃取、固相萃取凈化、凝膠滲透色譜凈化及QuEChERS技術(shù)，常用分析技術(shù)有氣相色譜法、高效液相色譜法及串聯(lián)質(zhì)譜法[24]。靈芝的農(nóng)藥殘留限量和檢測方法國內(nèi)外均沒有明確的規(guī)定，已報道相關(guān)研究：陸繼偉等[25]采用冰浴超聲提取、凝膠滲透色譜凈化、氣相色譜法測定靈芝中24 種有機磷農(nóng)藥殘留，王懷豫等[26]用中國藥典方法檢測靈芝中有機氯類農(nóng)藥，劉志風(fēng)等[27]采用高速分散提取、弗羅里硅土層析柱石油醚洗脫凈化、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用法檢測15 種農(nóng)藥。QuEChERS是農(nóng)藥殘留檢測的AOAC官方方法和英國國家標(biāo)準(zhǔn)方法EN 15662-2008[28-29]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在蔬果[30]、食用菌[31]及中草藥[32]等各類食品藥品中的農(nóng)藥殘留檢測中。本研究利用QuEChERS方法原理建立集萃取和凈化為一體的新型前處理方法，結(jié)合GC-MS檢測系統(tǒng)，用于靈芝中農(nóng)藥多種殘留快速提取檢測，不僅能夠有效縮短前處理時間，提高檢測效率，而且有機溶劑用量顯著降低，使得農(nóng)殘分析更環(huán)保，保障了檢測人員身體健康。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試樣品靈芝子實體由延邊大陽參業(yè)有限公司提供，經(jīng)過自然干燥后取不少于200 g試樣，置于高速粉碎機中粉碎、混勻，裝入聚乙烯塑料袋中保存。

乙腈、丙酮、正己烷（均為色譜純） 美國Fisher公司；水為GB/T 6682規(guī)定的一級水；0.22 μm有機相微孔濾膜、凈化試劑盒64501、64504、64512（N-丙基乙二胺（primary secondaryamine，PSA））、MgSO4、C18填料） 北京迪馬科技有限公司。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：α-六六六（C6H6Cl6，純度99.5%，CAS No.319-84-6），β-六六六（C6H6Cl6，純度99.5%，CAS No.319-85-7），γ-六六六（C6H6Cl6，純度99.5%，CAS No.58-89-9），δ-六六六（C6H6Cl6，純度98.1%，CAS No.319-84-6），六氯苯（C6Cl6，純度99.5%，CAS No.118-74-1），p,p’-DDD（C14H10Cl4，純度98.1%，CAS No.72-54-8），o,p’-DDT（C14H9Cl54，純度99.5%，CAS No.789-02-6），p,p’-DDT（C14H9Cl5，純度98.9%，CAS No.50-29-3），p,p’-DDE（C14H8Cl4，純度99.5%，CAS No.72-55-9），嘧菌環(huán)胺（C14H15N3，純度100%，CAS No.121552-61-2），腐霉利（C13H11Cl2NO2，純度100%，CAS No.32809-16-8），五氯硝基苯（C6Cl5NO2，純度99.5%，CAS No.82-68-8），二嗪磷（C12H21N2O3PS，純度100%，CAS No.333-41-5），醚菌酯（C18H19NO4，純度99%，CAS No.143390-89-0），異菌脲（C13H13Cl2N3O3，純度98.6%，CAS No.36734-19-7），丙環(huán)唑（C18H19NO4，純度99.5%，CAS No.60207-90-1），嘧菌酯（C22H17N3O5，純度99.5%，CAS No.131860-33-8），乙霉威（C14H21NO4，純度99.5%，CAS No.87130-20-9），苯醚甲環(huán)唑（C19H17Cl2N3O3，純度99.5%，CAS No.119446-68-3），甲霜靈（C15H2NO4，純度99.5%，CAS No.57837-19-11）。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C型GC-MS聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司；天平（感量為0.001 g和0.000 1 g） 梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；TGL-16M高速離心機 湖南湘儀離心機有限公司；T25均質(zhì)器德國IKA公司；Vortex-Genie渦旋混合器 美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：HP-5石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）或相當(dāng)者；程序升溫：初始柱溫120 ℃保持1 min，10 ℃/min升到260 ℃，保持10 min；載氣為氦氣（純度≥99.999%），流速1.0 mL/min，尾吹氣流量20 mL/min，不分流進樣，進樣體積為1 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃，離子源溫度200 ℃；單離子掃描模式（single ion monitoring，SIM）；溶劑延遲時間10 min。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取50 mg各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)丙酮溶解配制成質(zhì)量濃度500 μg/mL儲備液，貯存于－20 ℃。

精密吸取適量的儲備液于25 mL容量瓶中正己烷定容，配成1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.4 樣品液制備

稱取粉碎均勻試樣1.0 g（精確到1 mg），加入10 mL純水浸泡30 min，加入20 mL乙腈，高速勻漿均質(zhì)提取2 min（10 000 r/min），加入6 g NaCl高速渦旋振蕩混勻1 min，以5 000 r/min離心5 min，取上清液4 mL，加入含有150 mg PSA、900 mg MgSO4凈化包（No.64504），高速渦旋1 min混勻，以5 000 r/min離心5 min，取上清液上機檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過色譜分析儀器GC-MS獲得數(shù)據(jù)使用Excel 2006進行數(shù)據(jù)分析和圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜質(zhì)譜條件確定

選擇對弱極性化合物分離較好的毛細(xì)管柱色譜柱HP-5，通過Scan模式掃描，確定農(nóng)藥的保留時間，選擇定性定量離子，建立SIM離子監(jiān)測方法，每種農(nóng)藥選擇一個定量離子，2 個定性離子，按照保留時間順序分段檢測。每種農(nóng)藥的保留時間及定量、定性離子見表1。

表1 農(nóng)藥的質(zhì)量分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for pesticides

續(xù)表1

2.2 樣品前處理條件優(yōu)化2.2.1 提取條件確定

表2 靈芝樣品不同前處理的回收率Table 2 Recoveries of pesticides from G. tsugae with different pretreatments

QuEChERS法中常用的提取溶劑有乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等，乙腈因其最適宜于萃取極性范圍較寬的多種農(nóng)藥，且萃出物中雜質(zhì)含量較低[33]，因此是目前使用最廣泛的提取溶劑。根據(jù)農(nóng)藥的溶解性和穩(wěn)定性，同時參照EN15662[28]和AOAC[29]的QuEChERS方法，也選擇乙腈作為提取溶劑。本實驗提取方法主要考察振蕩提取和高速均質(zhì)提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分農(nóng)藥均質(zhì)提取效果好于振蕩提取。前處理包括提取和凈化兩個步驟，實驗中加入萃取鹽包（4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g TSCD和0.5 g DHS）和凈化包64507，但是添加回收率很低，分析可能原因：一是加入萃取鹽產(chǎn)生大量熱量造成熱不穩(wěn)定農(nóng)藥的分解，二是凈化包64507中含有C18，C18主要用于去除非極性雜質(zhì)效果良好[34]，然而有機氯農(nóng)藥正是屬于非極性較強的化合物，因此C18吸附對回收率產(chǎn)生很大影響。均質(zhì)提取時改加氯化鈉促進分層，凈化使用不含C18的64501，半數(shù)農(nóng)藥回收率提高至70%～120%范圍內(nèi)（表2），由此可見在靈芝中農(nóng)藥檢測前處理時盡量減少對農(nóng)藥的分解和吸附，靈芝本身對農(nóng)藥和重金屬的富集特性[15-16]，極易導(dǎo)致農(nóng)藥提取不充分而影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。

2.2.2 凈化條件篩選

2.2.2.1 凈化劑篩選

QuEChERS方法中常用的凈化劑有PSA、十八烷基硅烷（C18）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）、無水MgSO4等[35]。農(nóng)殘檢測時凈化效果極大地影響檢測儀器和檢測結(jié)果，考察64501、64504、64512和64565四種凈化試劑盒的凈化效果（圖1）。隨著PSA和MgSO4量提高，如有機氯類α-六六六、β/γ-六六六、δ-六六六、p,p’-DDT、腐霉利、五氯硝基苯等多數(shù)農(nóng)藥的回收率明顯提高，而含有Carb和C18會吸附部分農(nóng)藥導(dǎo)致收率有所降低。本實驗選擇凈化試劑盒64504作凈化劑，回收率相對較高，在農(nóng)殘檢測規(guī)定的70%～120%之間農(nóng)藥17 種，異菌脲、乙霉威和苯醚甲環(huán)唑的回收率高于120%，分析原因可能是靈芝的基質(zhì)增強效應(yīng)所致，可以采用靈芝基質(zhì)液配制農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液。

圖1 不同凈化試劑盒處理后靈芝中農(nóng)藥回收率Fig. 1 Recoveries of pesticides from G. tsugae with different purification kits

2.2.2.2 提取液凈化體積篩選

固定量的凈化劑對不同體積提取液的凈化效果不同，因此要確定提取液的最佳上樣凈化體積，比較2、4、8 mL提取液上樣凈化效果。按照設(shè)想體積越小凈化效果越好，農(nóng)藥回收率也高，然而實驗結(jié)果（圖2）表明隨著凈化的提取液體積增加大部分農(nóng)藥回收率增加，但是凈化后溶液顏色隨上樣體積增加而加深，說明凈化劑的含量雖然能保證凈化效果，對儀器的污染也在增加。因此本實驗選擇吸取4 mL提取液凈化，既能夠保證凈化效果，又最大程度地降低對儀器污染。

圖2 不同凈化液體積對靈芝中農(nóng)藥回收率影響Fig. 2 Recoveries of pesticides from Ganoderma tsugae with different volumes of extract sample

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

表3 17 種農(nóng)藥線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Calibration equations, linearity ranges and correlation coefficients for 17 pesticides

分別精密吸取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按選定的實驗方法進行測試，經(jīng)選擇離子定量掃描，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各農(nóng)藥的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以定量離子信噪比RSN為3為樣品檢出限，RSN為10為定量限。表3表明，17 種殺菌劑線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.98，方法檢出限在0.002～0.022 mg/kg之間，定量限在0.007～0.072 mg/kg之間。

2.3.2 儀器精密度實驗結(jié)果

添加農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液使之添加量為0.5 mg/kg的靈芝樣品，經(jīng)過前處理后，GC-MS上樣，每個樣品連續(xù)測試5 針，提取定量離子獲得每種農(nóng)藥的峰面積，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，實驗設(shè)置2 個平行。結(jié)果表明儀器精密度良好，90%農(nóng)藥相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在1.06%～7.53%之間，嘧菌酯、丙環(huán)唑稍高，在10.26%～19.70%之間（圖3）。

圖3 GC-MS儀器精密度實驗結(jié)果Fig. 3 Results of instrumental precision of GC-MS

2.3.3 方法的準(zhǔn)確性

表4 松杉靈芝中農(nóng)藥的添加回收率和RSD（n= 3）Table 4 Recoveries and RSDs of pesticides from spiked G. tsugae (n= 3)

樣品中準(zhǔn)確加入一定量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加量分別為0.05、0.1、0.5 mg/kg，按最優(yōu)條件進行測定，每個添加實驗設(shè)定3 個平行和1 個對照，計算加標(biāo)平均回收率和3 次測定的RSD。結(jié)果（表4）表明方法準(zhǔn)確可行，17 種農(nóng)藥回收率范圍在71.10%～119.55%，RSD范圍為0.47%～20.05%。陸繼偉等[25]采用冰浴超聲提取靈芝中二嗪磷平均回收率86%，而本實驗建立的QuEChERS-GCMS方法二嗪磷平均回收率為94.04%。

3 結(jié)論與討論

QuEChERS法是基于基質(zhì)固相分散而開發(fā)的，主要包括以下步驟：1）待測樣品的粉碎和均質(zhì)處理。2）待測組分的提?。菏褂糜袡C溶劑和水的混合溶劑溶解樣品中的待測組分，并通過液液分配使待測組分集中于上層有機溶劑中。3）待測樣品的凈化：通過添加凈化劑去除待測樣品中的脂肪酸、色素、糖類等雜質(zhì)。靈芝子實體因木質(zhì)化程度高，使用中藥粉碎機粉碎后成絮狀，有研究表明普通粉碎靈芝多糖等有效成分提取效率低[36]。本實驗通過勻漿機刀頭上萬轉(zhuǎn)的高速旋轉(zhuǎn)進行均質(zhì)，充分粉碎木質(zhì)化的靈芝子實體的組織和細(xì)胞使待測組分在樣品中的分布更均勻，同時提取時加入鹽析劑NaCl，調(diào)節(jié)極性、減少極性雜質(zhì)的干擾，利于乙腈對農(nóng)藥的充分提取，并促進液液分配。

常規(guī)農(nóng)殘檢測方法索氏提取、磺化法凈化中國藥典規(guī)定方法超聲波提取、溶劑萃取凈化相比，索氏提取的提取效率高于藥典超聲法[37]，但索氏提取熱回流耗時較長一般需要數(shù)小時[38]。本研究采用改進的QuChERS方法提取和凈化樣品，利用GC-MS的SIM模式快速檢測靈芝中農(nóng)藥多殘留，操作簡單、檢出限低。該方法的平均回收率為71.10%～119.55%，RSD基本小于20%，完全符合農(nóng)藥殘留分析的要求，且在40 min內(nèi)即可完成17 種農(nóng)藥多殘留分析，整個檢測只需20 mL乙腈，具有快速、準(zhǔn)確、環(huán)保的優(yōu)點，極大地提高了檢測效率，也減少了對環(huán)境的污染，保障了檢驗人員的健康。但最初的實驗設(shè)計是預(yù)建立六六六、DDT、五氯硝基苯、甲霜靈、嘧菌酯、嘧菌環(huán)胺等20 種農(nóng)藥多殘留同時檢測方法，但在實驗中異菌脲、苯醚甲環(huán)唑和乙霉威3 種農(nóng)藥的添加回收率高于120%，分析原因可能與靈芝基質(zhì)效應(yīng)有關(guān)。課題組擬開展靈芝基質(zhì)效應(yīng)在農(nóng)藥殘留檢測中影響研究。