空間位阻凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定動(dòng)物源性食品中抗組胺類藥物殘留

王 京，葉佳明，王 瀟，鐘世歡，陳青俊

（1.贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州 310030；2.浙江省輕工業(yè)研究所，浙江 杭州 310009；3.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江 杭州 311305）

隨著膳食結(jié)構(gòu)的不斷改善和對(duì)動(dòng)物性蛋白質(zhì)需求的不斷增加，人們對(duì)肉制品、奶制品和魚(yú)制品等動(dòng)物性食品的質(zhì)量要求也就越來(lái)越高，對(duì)食品的獸藥殘留引起了普遍關(guān)注，并認(rèn)為獸藥殘留將是今后食品安全性中重要問(wèn)題之一[1-2]?？菇M胺類藥物，可用于鎮(zhèn)吐、抗暈眩、暈動(dòng)癥以及鎮(zhèn)靜催眠。其在獸醫(yī)臨床上的藥理作用廣泛，飼料中添加此類藥物，能興奮攝食中樞，不法商人在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中對(duì)其非法使用，從而達(dá)到增加動(dòng)物采食和促進(jìn)生長(zhǎng)增加體重等作用[3]；另外，使用抗組胺類藥物可降低動(dòng)物運(yùn)輸過(guò)程中的死亡率。因該類藥物脂溶性高，易蓄積于脂肪組織，停藥數(shù)周乃至半年后，尿中仍可檢出其代謝物，且部分代謝物仍具有藥物活性；例如氯丙嗪、異丙嗪等藥物經(jīng)肝臟代謝，在細(xì)胞色素P450酶催化下被氧化為亞砜結(jié)構(gòu)物質(zhì)，會(huì)引起白細(xì)胞減少和粒細(xì)胞缺乏癥，從而引起人體肝臟、腎臟的病變，還會(huì)引起眼部并發(fā)癥等[4]?？菇M胺類藥物在養(yǎng)殖業(yè)中的使用已經(jīng)引起了美國(guó)、歐盟和日本等國(guó)家的高度重視。

目前有關(guān)動(dòng)物源性食品中多種抗組胺類藥物的測(cè)定方法還較少，鮮見(jiàn)對(duì)同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中19 種抗組胺類藥物及其代謝物的研究。相關(guān)文獻(xiàn)主要僅檢測(cè)氯丙嗪、異丙嗪及其代謝物[5-7]，大部分研究局限于法醫(yī)學(xué)方面[8-10]。國(guó)內(nèi)外檢測(cè)低濃度水平的獸藥殘留通常采用的方法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-15]和氣相色譜-質(zhì)譜法[16-17]，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法數(shù)據(jù)通量大，無(wú)需衍生化且定性能力強(qiáng)，是一種靈敏度和選擇性極高的檢測(cè)手段。由于動(dòng)物源性食品種類多、基質(zhì)復(fù)雜，標(biāo)準(zhǔn)方法和文獻(xiàn)報(bào)道多數(shù)采用固相萃取柱[18-19]、多功能凈化柱[20]等凈化手段，其步驟復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)成本高。本研究旨在建立一種基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS），結(jié)合空間位阻凈化技術(shù)[21-22]，實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定19 種抗組胺類藥物及其代謝物殘留。本方法簡(jiǎn)便快速，靈敏度滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙酸乙酯、乙腈、甲酸（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；檸檬酸鈉、檸檬酸氫鈉、氯化鈉、硫酸鎂、Na2EDTA（均為優(yōu)級(jí)純） 上海譜振生物科技有限公司；EMR-Lipid吸附劑 美國(guó)Agilent公司；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore-iQ高純水凈化儀制得。

19 種抗組胺藥物標(biāo)準(zhǔn)品（特非那定、阿司咪唑、西替利嗪、氯雷他定、羥嗪、溴苯那敏、地氯雷他定、賽庚定、氯苯那敏、曲吡那敏、苯海拉明、氯丙嗪、氯丙嗪亞砜、異丙嗪、異丙嗪亞砜、氟奮乃靜、氟奮乃靜亞砜、奮乃靜、奮乃靜亞砜） 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260II超高效液相色譜儀-串聯(lián)6470三重四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；MultiReax旋渦振蕩器 德國(guó)Heidolph公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；N-EVAP112水浴式氮吹儀美國(guó)Organomation公司；Millipore-iQ高純水凈化儀美國(guó)Millipore公司；AS 3120超聲波振蕩器 天津特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 預(yù)處理

1.3.1.1 空間位阻凈化法

稱取經(jīng)均質(zhì)的試樣5.0 g于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL超純水、20 mL的乙酸乙酯-乙腈（20∶80，V/V）提取液，勻漿后超聲提取10 min，離心（8 000 r/min，5 min）后取清液加入2 g預(yù)先用3 mL水活化的EMR-Lipid吸附劑，渦旋振蕩并離心（8 000 r/min，5 min）；取全部清液加入5 g鹽（NaCl-MgSO4，1∶4，m/m），立即劇烈振搖并離心（4 ℃，8 000 r/min，5 min）；取上清液在40 ℃水浴中氮吹至盡干，加入1 mL初始比例的流動(dòng)相（含0.1 mol/L Na2EDTA）復(fù)溶后過(guò)0.22 μm濾膜供UPLCMS/MS測(cè)定。

1.3.1.2 CEN法

稱取經(jīng)均質(zhì)的試樣5.0 g于50 mL聚丙烯離心管中，分別加入10 mL超純水、10 mL甲酸-乙腈（10∶90，V/V）提取液，超聲30 min，加入1 g檸檬酸鈉、1 g氯化鈉、4 g硫酸鎂、0.5 g檸檬酸氫鈉，渦旋振蕩并離心（5 000 r/min，5 min）。取5 mL上清液加入0.75 g硫酸鎂、0.25 g N-丙基乙二胺（N-propylethylenediamine，PSA）、0.15 g C18和0.15 g Al-N，渦旋振蕩并離心（5 000 r/min，5 min），取上清液1 mL用0.1%甲酸溶液定容至10 mL，混勻后過(guò)0.22 μm濾膜供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3.1.3 AOAC法

稱取經(jīng)均質(zhì)的試樣5.0 g于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL超純水、25 mL乙腈，勻漿提取后，分別加入10 g硫酸鎂、1 g氯化鈉，勻漿并離心（5 000 r/min，5 min）。取上層乙腈4 mL加入1.2 g硫酸鎂、0.1 g PSA、0.1 g C18，渦旋振蕩并離心（5 000 r/min，5 min），取上清液過(guò)0.22 μm濾膜供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/mL）的配制：準(zhǔn)確稱取19 種藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10.0 mg，用乙腈分別溶解定容至10.0 mL，于－18 ℃冷凍保存。

標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液（10 μg/mL）的配制：分別取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL混合，用乙腈定容至100 mL，于－18 ℃冷凍保存。

標(biāo)準(zhǔn)混合空白工作液的配制：取標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液，用初始比例流動(dòng)相稀釋成1、2、5、10、20、50、100 μg/L系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合空白工作液。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：取陰性樣品，按照1.3.1節(jié)的預(yù)處理方法處理濃縮至近干，加入標(biāo)準(zhǔn)混合空白工作液1.0 mL后按1.3.1節(jié)繼續(xù)操作，即得。

1.3.3 UPLC-MS/MS測(cè)定

表1 19 種藥物的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Mass spectrometric acquisition parameters of 19 drugs

LC條件：Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～3 min，10%～10% B；3～6 min，10%～30% B；6～8 min，30%～40% B；8～12 min，40%～70% B；12～14 min，7%～90% B；14～16 min，90%～90% B；16～16.5 min，90%～10% B。

MS條件：Agilent Jet Stream電噴霧離子源；動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式采集數(shù)據(jù)；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流量10 L/min；鞘氣流量12 L/min；霧化氣壓力25 psi；毛細(xì)管電壓4 000 V；MS/MS分辨率為unit；19 種抗組胺藥物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

定量方法：取1.3.2節(jié)制備的樣液上機(jī)測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再取1.3.1節(jié)制備的樣液上機(jī)測(cè)定，以保留時(shí)間和2 對(duì)特征離子對(duì)定性，以定量離子的峰面積計(jì)算樣液中目標(biāo)物的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源正離子全掃描模式下分別對(duì)19 種質(zhì)量濃度為1 μg/mL的抗組胺藥物進(jìn)行分析，所有待測(cè)物均形成[M＋H]＋形式的準(zhǔn)分子離子峰。在單離子掃描模式下分別優(yōu)化每個(gè)待測(cè)物的裂解電壓使母離子響應(yīng)最大，后在子離子掃描和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)分析中確定兩對(duì)定性離子對(duì)和一對(duì)定量離子對(duì)，并優(yōu)化其碰撞能使子離子響應(yīng)最大化。同時(shí)，在多殘留檢測(cè)中為盡可能地提升靈敏度和定量的準(zhǔn)確性，采用動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以根據(jù)不同待測(cè)物的保留時(shí)間，分段進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描，增加每個(gè)待測(cè)物的掃描駐留時(shí)間，從而加大目標(biāo)離子的通量提高數(shù)據(jù)采集效率，進(jìn)而提升靈敏度、保證重復(fù)性。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

因西替利嗪和羥嗪；氟奮乃靜、氟奮乃靜亞砜、奮乃靜和奮乃靜亞砜；氯丙嗪、氯丙嗪亞砜、異丙嗪和異丙嗪亞砜具有結(jié)構(gòu)相同的母核，質(zhì)譜行為接近，在二級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生相同的豐度較高的子離子碎片，為準(zhǔn)確定量需保證色譜上的分離度。本研究綜合考慮系統(tǒng)耐壓、分析時(shí)間和分離效果，主要對(duì)比了Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）、Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Cortecs C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）、XBridge C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Accucore Vanquish C18柱（100 mm×2.1 mm，1.5 μm）5 種色譜柱。綜合各方面因素最終選取柱效較高且背壓較低的Poroshell 120 C18柱，能達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)效果。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)資料，酸性流動(dòng)相體系在正離子模式下能增強(qiáng)待測(cè)物的離子化效率從而提高靈敏度，乙腈和甲醇相比具有更小的基線噪音影響和更強(qiáng)的反相洗脫能力，從而增大梯度洗脫程序設(shè)計(jì)的靈活性，故選擇乙腈為有機(jī)相。本研究主要對(duì)水相添加不同濃度的甲酸和甲酸銨與乙腈進(jìn)行組合，考察其響應(yīng)值，結(jié)果以某種水相與A種水相中19 種藥物響應(yīng)平均值的比值計(jì)算，制作變化圖（圖1）。結(jié)果表明：水相中加入甲酸和甲酸銨都能明顯提升靈敏度，0.1%的甲酸添加量能達(dá)到最佳靈敏度。為保證梯度洗脫的穩(wěn)定性，同時(shí)在乙腈中加入相同的0.1%甲酸。最終確定0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸-乙腈溶液作為流動(dòng)相，所有19 種待測(cè)物的典型多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖見(jiàn)圖2。

圖1 不同流動(dòng)相的比較Fig. 1 Comparison of different mobile phases

圖2 19 種藥物的典型多反應(yīng)監(jiān)測(cè)譜圖Fig. 2 Typical MRM chromatograms of 19 drugs

2.3 預(yù)處理方法的優(yōu)化

動(dòng)物源性食品通常含大量的脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，在預(yù)處理過(guò)程中動(dòng)物細(xì)胞膜的主要成分磷脂也會(huì)源源不斷溶出，這些物質(zhì)在離子源會(huì)與待分析物競(jìng)爭(zhēng)電子引起很大的基質(zhì)效應(yīng)，嚴(yán)重影響定量的準(zhǔn)確性，因此如何最大程度地凈化來(lái)削弱基質(zhì)效應(yīng)是分析的主要難點(diǎn)。獸藥殘留檢測(cè)的常用提取溶劑有緩沖鹽溶液、甲醇、乙腈、乙酸乙酯等，加入適量的甲酸或氨水也能促進(jìn)提??；19 種抗組胺類藥物極性均較弱但是極性范圍較寬，實(shí)驗(yàn)表明使用緩沖鹽溶液或甲醇作為提取劑時(shí)特非那定等藥物的回收率不足40%，使用乙酸乙酯作為提取劑時(shí)曲吡那敏等藥物的回收率不足60%，而使用乙腈和乙酸乙酯的混合溶液作為提取劑能覆蓋大部分的待測(cè)物的極性；19 種抗組胺類藥物的pKa值范圍在3.7～9.3之間，故不加入甲酸或氨水促進(jìn)提取，最終選擇乙酸乙酯-乙腈（20∶80，V/V）作為提取溶劑。

分散固相萃取技術(shù)是目前實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展藥物殘留檢測(cè)工作主流的預(yù)處理手段[23-31]，它兼顧了凈化效果和效率，AOAC法和CEN法等國(guó)際方法中主要用的吸附劑有PSA、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、中性氧化鋁（Al-N）等，其中PSA和Al-N主要吸附極性雜質(zhì)、GCB主要吸附色素同時(shí)會(huì)對(duì)平面結(jié)構(gòu)的化合物存在共吸附、C18主要吸附脂類和糖類物質(zhì)但是因針對(duì)性較差也引起一些親脂類化合物回收率偏低；EMR-Lipid技術(shù)是一種基于空間位阻原理的特殊聚合物基質(zhì)EMR的凈化手段，專門(mén)吸附脂質(zhì)中C5及以上的碳鏈，對(duì)脂質(zhì)具有非常強(qiáng)的選擇吸附性。由于19 種抗組胺類藥物的極性均較弱，因此在反相色譜上的共餾出物于離子源處形成基質(zhì)效應(yīng)的物質(zhì)主要是磷脂等弱極性的物質(zhì)，本研究考察了通過(guò)空間位阻凈化法、CEN法和AOAC法凈化豬肉樣品后的磷脂殘留來(lái)評(píng)價(jià)3 種預(yù)處理方式的凈化效果，磷脂并非單一化合物，主要分為甘油磷脂和鞘磷脂兩大類，但是其含磷酸的母體是相同的，故可采用母離子掃描模式監(jiān)測(cè)184＋碎片離子來(lái)監(jiān)測(cè)磷脂殘留量。如圖3所示，可知空間位阻凈化法的磷脂殘留最少，CEN法凈化后仍有一定量的磷脂存在，AOAC法凈化后磷脂殘留最多，因此最終確定了空間位阻凈化法為本研究的預(yù)處理手段。

圖3 豬肉樣品經(jīng)3 種方法凈化后的磷脂殘留監(jiān)測(cè)對(duì)比圖Fig. 3 Comparison of phospholipid residues in pork samples purified by three methods

由于氯丙嗪、異丙嗪、奮乃靜、氟奮乃靜等吩噻嗪類抗組胺藥物具有相同的硫氮雜蒽母核，其環(huán)上硫原子所具有的兩對(duì)孤對(duì)電子極易與基質(zhì)中的金屬離子絡(luò)合甚至被儀器金屬管路吸附，造成峰形拖尾、重復(fù)性差等現(xiàn)象，Na2EDTA能競(jìng)爭(zhēng)絡(luò)合基質(zhì)中的金屬離子使待測(cè)物母核游離出來(lái)，因此最終復(fù)溶時(shí)用流動(dòng)相加入Na2EDTA（最終濃度為0.1 mol/L）較好地改善了重復(fù)性。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察結(jié)果

液相色譜-質(zhì)譜分析中存在的基質(zhì)效應(yīng)，除了在預(yù)處理過(guò)程中盡可能凈化樣品，通常采用稀釋法、標(biāo)準(zhǔn)加入法、內(nèi)標(biāo)法、基質(zhì)配標(biāo)法來(lái)削弱或修正基質(zhì)效應(yīng)造成的偏差；本研究以基質(zhì)效應(yīng)最明顯的豬肝為例，通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫程序和基質(zhì)配標(biāo)法較好地減弱和抵消了基質(zhì)效應(yīng)，比較結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 19 種藥物的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects of 19 drugs

2.5 方法學(xué)考察結(jié)果

2.5.1 線性與檢出限結(jié)果

表3 19 種藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of 19 drugs

按上述條件將系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（y），以質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)（x）制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到線性方程的線性回歸系數(shù)r2均大于0.999，表明19 種抗組胺藥物在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測(cè)定，以定性子離子的3 倍信噪比計(jì)算檢出限和10 倍信噪比計(jì)算定量限，結(jié)果見(jiàn)表3，得到19 種抗組胺藥物檢出限為0.2～2.0 μg/kg，定量限為0.6～6.0 μg/kg，靈敏度滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需要。

2.5.2 回收率與重復(fù)性結(jié)果

在陰性牛肉、雞肉和豬肝中分別添加3個(gè)質(zhì)量濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6 次回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。可知回收率在75.1%～89.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～7.1%，方法具有較好的精密度，能滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)需要。

表4 19 種獸藥的準(zhǔn)確度和精密度（n=6）Table 4 Accuracy and precision for 19 drugs (n= 6)

2.5.3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

采用本方法對(duì)流通領(lǐng)域市售雞肉86 份、牛肉91 份、豬肝77 份進(jìn)行19 種抗組胺藥物及其代謝物的篩查，檢出豬肝氯丙嗪陽(yáng)性樣品3 例、異丙嗪陽(yáng)性樣品1 例，檢出牛肉氯丙嗪陽(yáng)性樣品1 例、奮乃靜陽(yáng)性樣品1 例；全部陽(yáng)性樣品同時(shí)均檢出其亞砜結(jié)構(gòu)代謝物，可見(jiàn)通常代謝物與本體會(huì)同時(shí)存在，內(nèi)臟等脂肪含量高的組織更易蓄積抗組胺類藥物及其代謝物。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定畜禽肉中19 種抗組胺藥物及其代謝物殘留的方法。通過(guò)比較空間位阻凈化法、CEN法和AOAC法3 種不同前處理方法的凈化效果，驗(yàn)證了空間位阻凈化法的有效性。通過(guò)優(yōu)化色譜和質(zhì)譜參數(shù)，得到了最佳的儀器檢測(cè)條件。方法學(xué)考察和實(shí)際樣品的測(cè)定證明該方法實(shí)用、可靠。與目前的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道的方法相比，本方法在擴(kuò)大了同類型藥物檢測(cè)范圍、準(zhǔn)確性較好、靈敏度較高的同時(shí)，盡可能省去了復(fù)雜的前處理，節(jié)省了成本，能更快更好地為市場(chǎng)監(jiān)管部門(mén)的監(jiān)督執(zhí)法提供技術(shù)支持。