• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    空間位阻凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定動(dòng)物源性食品中抗組胺類藥物殘留

    2019-07-05 02:13:34葉佳明鐘世歡陳青俊
    食品科學(xué) 2019年12期

    王 京,葉佳明,王 瀟,鐘世歡,陳青俊

    (1.贊宇科技集團(tuán)股份有限公司,浙江 杭州 310030;2.浙江省輕工業(yè)研究所,浙江 杭州 310009;3.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司,浙江 杭州 311305)

    隨著膳食結(jié)構(gòu)的不斷改善和對(duì)動(dòng)物性蛋白質(zhì)需求的不斷增加,人們對(duì)肉制品、奶制品和魚(yú)制品等動(dòng)物性食品的質(zhì)量要求也就越來(lái)越高,對(duì)食品的獸藥殘留引起了普遍關(guān)注,并認(rèn)為獸藥殘留將是今后食品安全性中重要問(wèn)題之一[1-2]??菇M胺類藥物,可用于鎮(zhèn)吐、抗暈眩、暈動(dòng)癥以及鎮(zhèn)靜催眠。其在獸醫(yī)臨床上的藥理作用廣泛,飼料中添加此類藥物,能興奮攝食中樞,不法商人在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中對(duì)其非法使用,從而達(dá)到增加動(dòng)物采食和促進(jìn)生長(zhǎng)增加體重等作用[3];另外,使用抗組胺類藥物可降低動(dòng)物運(yùn)輸過(guò)程中的死亡率。因該類藥物脂溶性高,易蓄積于脂肪組織,停藥數(shù)周乃至半年后,尿中仍可檢出其代謝物,且部分代謝物仍具有藥物活性;例如氯丙嗪、異丙嗪等藥物經(jīng)肝臟代謝,在細(xì)胞色素P450酶催化下被氧化為亞砜結(jié)構(gòu)物質(zhì),會(huì)引起白細(xì)胞減少和粒細(xì)胞缺乏癥,從而引起人體肝臟、腎臟的病變,還會(huì)引起眼部并發(fā)癥等[4]??菇M胺類藥物在養(yǎng)殖業(yè)中的使用已經(jīng)引起了美國(guó)、歐盟和日本等國(guó)家的高度重視。

    目前有關(guān)動(dòng)物源性食品中多種抗組胺類藥物的測(cè)定方法還較少,鮮見(jiàn)對(duì)同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中19 種抗組胺類藥物及其代謝物的研究。相關(guān)文獻(xiàn)主要僅檢測(cè)氯丙嗪、異丙嗪及其代謝物[5-7],大部分研究局限于法醫(yī)學(xué)方面[8-10]。國(guó)內(nèi)外檢測(cè)低濃度水平的獸藥殘留通常采用的方法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-15]和氣相色譜-質(zhì)譜法[16-17],其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法數(shù)據(jù)通量大,無(wú)需衍生化且定性能力強(qiáng),是一種靈敏度和選擇性極高的檢測(cè)手段。由于動(dòng)物源性食品種類多、基質(zhì)復(fù)雜,標(biāo)準(zhǔn)方法和文獻(xiàn)報(bào)道多數(shù)采用固相萃取柱[18-19]、多功能凈化柱[20]等凈化手段,其步驟復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)成本高。本研究旨在建立一種基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS),結(jié)合空間位阻凈化技術(shù)[21-22],實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定19 種抗組胺類藥物及其代謝物殘留。本方法簡(jiǎn)便快速,靈敏度滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)需要。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    乙酸乙酯、乙腈、甲酸(均為色譜純) 德國(guó)Merck公司;檸檬酸鈉、檸檬酸氫鈉、氯化鈉、硫酸鎂、Na2EDTA(均為優(yōu)級(jí)純) 上海譜振生物科技有限公司;EMR-Lipid吸附劑 美國(guó)Agilent公司;實(shí)驗(yàn)用水為Millipore-iQ高純水凈化儀制得。

    19 種抗組胺藥物標(biāo)準(zhǔn)品(特非那定、阿司咪唑、西替利嗪、氯雷他定、羥嗪、溴苯那敏、地氯雷他定、賽庚定、氯苯那敏、曲吡那敏、苯海拉明、氯丙嗪、氯丙嗪亞砜、異丙嗪、異丙嗪亞砜、氟奮乃靜、氟奮乃靜亞砜、奮乃靜、奮乃靜亞砜) 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    1260II超高效液相色譜儀-串聯(lián)6470三重四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司;MultiReax旋渦振蕩器 德國(guó)Heidolph公司;Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;N-EVAP112水浴式氮吹儀美國(guó)Organomation公司;Millipore-iQ高純水凈化儀美國(guó)Millipore公司;AS 3120超聲波振蕩器 天津特賽恩斯儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 預(yù)處理

    1.3.1.1 空間位阻凈化法

    稱取經(jīng)均質(zhì)的試樣5.0 g于50 mL聚丙烯離心管中,加入5 mL超純水、20 mL的乙酸乙酯-乙腈(20∶80,V/V)提取液,勻漿后超聲提取10 min,離心(8 000 r/min,5 min)后取清液加入2 g預(yù)先用3 mL水活化的EMR-Lipid吸附劑,渦旋振蕩并離心(8 000 r/min,5 min);取全部清液加入5 g鹽(NaCl-MgSO4,1∶4,m/m),立即劇烈振搖并離心(4 ℃,8 000 r/min,5 min);取上清液在40 ℃水浴中氮吹至盡干,加入1 mL初始比例的流動(dòng)相(含0.1 mol/L Na2EDTA)復(fù)溶后過(guò)0.22 μm濾膜供UPLCMS/MS測(cè)定。

    1.3.1.2 CEN法

    稱取經(jīng)均質(zhì)的試樣5.0 g于50 mL聚丙烯離心管中,分別加入10 mL超純水、10 mL甲酸-乙腈(10∶90,V/V)提取液,超聲30 min,加入1 g檸檬酸鈉、1 g氯化鈉、4 g硫酸鎂、0.5 g檸檬酸氫鈉,渦旋振蕩并離心(5 000 r/min,5 min)。取5 mL上清液加入0.75 g硫酸鎂、0.25 g N-丙基乙二胺(N-propylethylenediamine,PSA)、0.15 g C18和0.15 g Al-N,渦旋振蕩并離心(5 000 r/min,5 min),取上清液1 mL用0.1%甲酸溶液定容至10 mL,混勻后過(guò)0.22 μm濾膜供UPLC-MS/MS測(cè)定。

    1.3.1.3 AOAC法

    稱取經(jīng)均質(zhì)的試樣5.0 g于50 mL聚丙烯離心管中,加入10 mL超純水、25 mL乙腈,勻漿提取后,分別加入10 g硫酸鎂、1 g氯化鈉,勻漿并離心(5 000 r/min,5 min)。取上層乙腈4 mL加入1.2 g硫酸鎂、0.1 g PSA、0.1 g C18,渦旋振蕩并離心(5 000 r/min,5 min),取上清液過(guò)0.22 μm濾膜供UPLC-MS/MS測(cè)定。

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mg/mL)的配制:準(zhǔn)確稱取19 種藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10.0 mg,用乙腈分別溶解定容至10.0 mL,于-18 ℃冷凍保存。

    標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液(10 μg/mL)的配制:分別取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL混合,用乙腈定容至100 mL,于-18 ℃冷凍保存。

    標(biāo)準(zhǔn)混合空白工作液的配制:取標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液,用初始比例流動(dòng)相稀釋成1、2、5、10、20、50、100 μg/L系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合空白工作液。

    基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:取陰性樣品,按照1.3.1節(jié)的預(yù)處理方法處理濃縮至近干,加入標(biāo)準(zhǔn)混合空白工作液1.0 mL后按1.3.1節(jié)繼續(xù)操作,即得。

    1.3.3 UPLC-MS/MS測(cè)定

    表1 19 種藥物的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Mass spectrometric acquisition parameters of 19 drugs

    LC條件:Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×2.1 mm,2.7 μm);柱溫35 ℃;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液,B為0.1%甲酸-乙腈溶液;梯度洗脫程序:0~3 min,10%~10% B;3~6 min,10%~30% B;6~8 min,30%~40% B;8~12 min,40%~70% B;12~14 min,7%~90% B;14~16 min,90%~90% B;16~16.5 min,90%~10% B。

    MS條件:Agilent Jet Stream電噴霧離子源;動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式采集數(shù)據(jù);干燥氣溫度350 ℃;干燥氣流量10 L/min;鞘氣流量12 L/min;霧化氣壓力25 psi;毛細(xì)管電壓4 000 V;MS/MS分辨率為unit;19 種抗組胺藥物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

    定量方法:取1.3.2節(jié)制備的樣液上機(jī)測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,再取1.3.1節(jié)制備的樣液上機(jī)測(cè)定,以保留時(shí)間和2 對(duì)特征離子對(duì)定性,以定量離子的峰面積計(jì)算樣液中目標(biāo)物的含量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

    在電噴霧離子源正離子全掃描模式下分別對(duì)19 種質(zhì)量濃度為1 μg/mL的抗組胺藥物進(jìn)行分析,所有待測(cè)物均形成[M+H]+形式的準(zhǔn)分子離子峰。在單離子掃描模式下分別優(yōu)化每個(gè)待測(cè)物的裂解電壓使母離子響應(yīng)最大,后在子離子掃描和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)分析中確定兩對(duì)定性離子對(duì)和一對(duì)定量離子對(duì),并優(yōu)化其碰撞能使子離子響應(yīng)最大化。同時(shí),在多殘留檢測(cè)中為盡可能地提升靈敏度和定量的準(zhǔn)確性,采用動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,以根據(jù)不同待測(cè)物的保留時(shí)間,分段進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描,增加每個(gè)待測(cè)物的掃描駐留時(shí)間,從而加大目標(biāo)離子的通量提高數(shù)據(jù)采集效率,進(jìn)而提升靈敏度、保證重復(fù)性。

    2.2 色譜條件的優(yōu)化

    因西替利嗪和羥嗪;氟奮乃靜、氟奮乃靜亞砜、奮乃靜和奮乃靜亞砜;氯丙嗪、氯丙嗪亞砜、異丙嗪和異丙嗪亞砜具有結(jié)構(gòu)相同的母核,質(zhì)譜行為接近,在二級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生相同的豐度較高的子離子碎片,為準(zhǔn)確定量需保證色譜上的分離度。本研究綜合考慮系統(tǒng)耐壓、分析時(shí)間和分離效果,主要對(duì)比了Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×2.1 mm,2.7 μm)、Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、Cortecs C18柱(100 mm×2.1 mm,2.7 μm)、XBridge C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和Accucore Vanquish C18柱(100 mm×2.1 mm,1.5 μm)5 種色譜柱。綜合各方面因素最終選取柱效較高且背壓較低的Poroshell 120 C18柱,能達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)效果。

    根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)資料,酸性流動(dòng)相體系在正離子模式下能增強(qiáng)待測(cè)物的離子化效率從而提高靈敏度,乙腈和甲醇相比具有更小的基線噪音影響和更強(qiáng)的反相洗脫能力,從而增大梯度洗脫程序設(shè)計(jì)的靈活性,故選擇乙腈為有機(jī)相。本研究主要對(duì)水相添加不同濃度的甲酸和甲酸銨與乙腈進(jìn)行組合,考察其響應(yīng)值,結(jié)果以某種水相與A種水相中19 種藥物響應(yīng)平均值的比值計(jì)算,制作變化圖(圖1)。結(jié)果表明:水相中加入甲酸和甲酸銨都能明顯提升靈敏度,0.1%的甲酸添加量能達(dá)到最佳靈敏度。為保證梯度洗脫的穩(wěn)定性,同時(shí)在乙腈中加入相同的0.1%甲酸。最終確定0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸-乙腈溶液作為流動(dòng)相,所有19 種待測(cè)物的典型多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖見(jiàn)圖2。

    圖1 不同流動(dòng)相的比較Fig. 1 Comparison of different mobile phases

    圖2 19 種藥物的典型多反應(yīng)監(jiān)測(cè)譜圖Fig. 2 Typical MRM chromatograms of 19 drugs

    2.3 預(yù)處理方法的優(yōu)化

    動(dòng)物源性食品通常含大量的脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì),在預(yù)處理過(guò)程中動(dòng)物細(xì)胞膜的主要成分磷脂也會(huì)源源不斷溶出,這些物質(zhì)在離子源會(huì)與待分析物競(jìng)爭(zhēng)電子引起很大的基質(zhì)效應(yīng),嚴(yán)重影響定量的準(zhǔn)確性,因此如何最大程度地凈化來(lái)削弱基質(zhì)效應(yīng)是分析的主要難點(diǎn)。獸藥殘留檢測(cè)的常用提取溶劑有緩沖鹽溶液、甲醇、乙腈、乙酸乙酯等,加入適量的甲酸或氨水也能促進(jìn)提取;19 種抗組胺類藥物極性均較弱但是極性范圍較寬,實(shí)驗(yàn)表明使用緩沖鹽溶液或甲醇作為提取劑時(shí)特非那定等藥物的回收率不足40%,使用乙酸乙酯作為提取劑時(shí)曲吡那敏等藥物的回收率不足60%,而使用乙腈和乙酸乙酯的混合溶液作為提取劑能覆蓋大部分的待測(cè)物的極性;19 種抗組胺類藥物的pKa值范圍在3.7~9.3之間,故不加入甲酸或氨水促進(jìn)提取,最終選擇乙酸乙酯-乙腈(20∶80,V/V)作為提取溶劑。

    分散固相萃取技術(shù)是目前實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展藥物殘留檢測(cè)工作主流的預(yù)處理手段[23-31],它兼顧了凈化效果和效率,AOAC法和CEN法等國(guó)際方法中主要用的吸附劑有PSA、石墨化碳黑(graphitized carbon black,GCB)、十八烷基鍵合硅膠(C18)、中性氧化鋁(Al-N)等,其中PSA和Al-N主要吸附極性雜質(zhì)、GCB主要吸附色素同時(shí)會(huì)對(duì)平面結(jié)構(gòu)的化合物存在共吸附、C18主要吸附脂類和糖類物質(zhì)但是因針對(duì)性較差也引起一些親脂類化合物回收率偏低;EMR-Lipid技術(shù)是一種基于空間位阻原理的特殊聚合物基質(zhì)EMR的凈化手段,專門(mén)吸附脂質(zhì)中C5及以上的碳鏈,對(duì)脂質(zhì)具有非常強(qiáng)的選擇吸附性。由于19 種抗組胺類藥物的極性均較弱,因此在反相色譜上的共餾出物于離子源處形成基質(zhì)效應(yīng)的物質(zhì)主要是磷脂等弱極性的物質(zhì),本研究考察了通過(guò)空間位阻凈化法、CEN法和AOAC法凈化豬肉樣品后的磷脂殘留來(lái)評(píng)價(jià)3 種預(yù)處理方式的凈化效果,磷脂并非單一化合物,主要分為甘油磷脂和鞘磷脂兩大類,但是其含磷酸的母體是相同的,故可采用母離子掃描模式監(jiān)測(cè)184+碎片離子來(lái)監(jiān)測(cè)磷脂殘留量。如圖3所示,可知空間位阻凈化法的磷脂殘留最少,CEN法凈化后仍有一定量的磷脂存在,AOAC法凈化后磷脂殘留最多,因此最終確定了空間位阻凈化法為本研究的預(yù)處理手段。

    圖3 豬肉樣品經(jīng)3 種方法凈化后的磷脂殘留監(jiān)測(cè)對(duì)比圖Fig. 3 Comparison of phospholipid residues in pork samples purified by three methods

    由于氯丙嗪、異丙嗪、奮乃靜、氟奮乃靜等吩噻嗪類抗組胺藥物具有相同的硫氮雜蒽母核,其環(huán)上硫原子所具有的兩對(duì)孤對(duì)電子極易與基質(zhì)中的金屬離子絡(luò)合甚至被儀器金屬管路吸附,造成峰形拖尾、重復(fù)性差等現(xiàn)象,Na2EDTA能競(jìng)爭(zhēng)絡(luò)合基質(zhì)中的金屬離子使待測(cè)物母核游離出來(lái),因此最終復(fù)溶時(shí)用流動(dòng)相加入Na2EDTA(最終濃度為0.1 mol/L)較好地改善了重復(fù)性。

    2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察結(jié)果

    液相色譜-質(zhì)譜分析中存在的基質(zhì)效應(yīng),除了在預(yù)處理過(guò)程中盡可能凈化樣品,通常采用稀釋法、標(biāo)準(zhǔn)加入法、內(nèi)標(biāo)法、基質(zhì)配標(biāo)法來(lái)削弱或修正基質(zhì)效應(yīng)造成的偏差;本研究以基質(zhì)效應(yīng)最明顯的豬肝為例,通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫程序和基質(zhì)配標(biāo)法較好地減弱和抵消了基質(zhì)效應(yīng),比較結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 19 種藥物的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects of 19 drugs

    2.5 方法學(xué)考察結(jié)果

    2.5.1 線性與檢出限結(jié)果

    表3 19 種藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of 19 drugs

    按上述條件將系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)測(cè)定,以峰面積為縱坐標(biāo)(y),以質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)(x)制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,得到線性方程的線性回歸系數(shù)r2均大于0.999,表明19 種抗組胺藥物在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測(cè)定,以定性子離子的3 倍信噪比計(jì)算檢出限和10 倍信噪比計(jì)算定量限,結(jié)果見(jiàn)表3,得到19 種抗組胺藥物檢出限為0.2~2.0 μg/kg,定量限為0.6~6.0 μg/kg,靈敏度滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需要。

    2.5.2 回收率與重復(fù)性結(jié)果

    在陰性牛肉、雞肉和豬肝中分別添加3個(gè)質(zhì)量濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6 次回收率實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表4??芍厥章试?5.1%~89.1%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%~7.1%,方法具有較好的精密度,能滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)需要。

    表4 19 種獸藥的準(zhǔn)確度和精密度(n=6)Table 4 Accuracy and precision for 19 drugs (n= 6)

    2.5.3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

    采用本方法對(duì)流通領(lǐng)域市售雞肉86 份、牛肉91 份、豬肝77 份進(jìn)行19 種抗組胺藥物及其代謝物的篩查,檢出豬肝氯丙嗪陽(yáng)性樣品3 例、異丙嗪陽(yáng)性樣品1 例,檢出牛肉氯丙嗪陽(yáng)性樣品1 例、奮乃靜陽(yáng)性樣品1 例;全部陽(yáng)性樣品同時(shí)均檢出其亞砜結(jié)構(gòu)代謝物,可見(jiàn)通常代謝物與本體會(huì)同時(shí)存在,內(nèi)臟等脂肪含量高的組織更易蓄積抗組胺類藥物及其代謝物。

    3 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)建立UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定畜禽肉中19 種抗組胺藥物及其代謝物殘留的方法。通過(guò)比較空間位阻凈化法、CEN法和AOAC法3 種不同前處理方法的凈化效果,驗(yàn)證了空間位阻凈化法的有效性。通過(guò)優(yōu)化色譜和質(zhì)譜參數(shù),得到了最佳的儀器檢測(cè)條件。方法學(xué)考察和實(shí)際樣品的測(cè)定證明該方法實(shí)用、可靠。與目前的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道的方法相比,本方法在擴(kuò)大了同類型藥物檢測(cè)范圍、準(zhǔn)確性較好、靈敏度較高的同時(shí),盡可能省去了復(fù)雜的前處理,節(jié)省了成本,能更快更好地為市場(chǎng)監(jiān)管部門(mén)的監(jiān)督執(zhí)法提供技術(shù)支持。

    神马国产精品三级电影在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区 | av福利片在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲,欧美,日韩| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 一级黄色大片毛片| 性插视频无遮挡在线免费观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产av一区在线观看免费| 亚洲av成人av| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 十八禁国产超污无遮挡网站| 97热精品久久久久久| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 免费无遮挡裸体视频| xxxwww97欧美| 国产高清有码在线观看视频| 久久国产乱子免费精品| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产真实乱freesex| 亚洲最大成人av| 亚洲成人中文字幕在线播放| av专区在线播放| 色视频www国产| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美一区二区亚洲| 免费看a级黄色片| 国产精品电影一区二区三区| aaaaa片日本免费| 天堂√8在线中文| 国产精品不卡视频一区二区 | 最后的刺客免费高清国语| 在线观看一区二区三区| 亚洲欧美日韩东京热| 日韩大尺度精品在线看网址| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 久久人人爽人人爽人人片va | 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲激情在线av| 国产野战对白在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 伊人久久精品亚洲午夜| 内地一区二区视频在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 男人的好看免费观看在线视频| 午夜a级毛片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美最新免费一区二区三区 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 99久久精品一区二区三区| 又爽又黄a免费视频| 桃色一区二区三区在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产一区二区激情短视频| 无遮挡黄片免费观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 在线播放无遮挡| 天堂影院成人在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 51国产日韩欧美| 久久久久久久精品吃奶| 极品教师在线免费播放| 欧美性猛交黑人性爽| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 成人三级黄色视频| 久久香蕉精品热| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲人成网站高清观看| 日韩欧美国产在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 午夜精品在线福利| 色精品久久人妻99蜜桃| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久精品综合一区二区三区| 精品久久国产蜜桃| 麻豆国产97在线/欧美| 黄色女人牲交| 免费av毛片视频| 成人三级黄色视频| av在线蜜桃| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美乱色亚洲激情| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 精品人妻视频免费看| 国内精品美女久久久久久| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 18+在线观看网站| 丁香六月欧美| 欧美最黄视频在线播放免费| 成人亚洲精品av一区二区| 久久久久性生活片| 熟女人妻精品中文字幕| 日本一二三区视频观看| 丝袜美腿在线中文| 极品教师在线免费播放| 国产亚洲欧美在线一区二区| 999久久久精品免费观看国产| 男人和女人高潮做爰伦理| 成年人黄色毛片网站| 欧美黑人巨大hd| 亚洲成av人片免费观看| 日本a在线网址| 嫩草影院入口| 一级毛片久久久久久久久女| 国产成人福利小说| 久久久成人免费电影| 深夜a级毛片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 91久久精品电影网| 麻豆成人av在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美高清成人免费视频www| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美高清性xxxxhd video| 国产单亲对白刺激| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 禁无遮挡网站| 成人性生交大片免费视频hd| 一级作爱视频免费观看| 久久久久九九精品影院| 18美女黄网站色大片免费观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 一个人免费在线观看电影| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲美女视频黄频| 免费av毛片视频| 亚洲激情在线av| 亚洲av免费在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 国产成年人精品一区二区| 亚洲18禁久久av| 免费高清视频大片| 88av欧美| 我的女老师完整版在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日本 av在线| 久久亚洲精品不卡| 午夜影院日韩av| 日本与韩国留学比较| 亚洲真实伦在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日韩欧美精品v在线| 色在线成人网| 深夜a级毛片| 成人三级黄色视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 宅男免费午夜| 久久人人爽人人爽人人片va | 变态另类丝袜制服| 欧美性猛交黑人性爽| 久久精品影院6| 我要看日韩黄色一级片| 嫩草影院新地址| 最近中文字幕高清免费大全6 | 免费av不卡在线播放| 亚洲av二区三区四区| 在线观看66精品国产| 欧美三级亚洲精品| 午夜免费成人在线视频| 亚洲精品在线观看二区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久久久久九九精品二区国产| 国产三级中文精品| av在线观看视频网站免费| 亚洲精品一区av在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲精品粉嫩美女一区| 一个人免费在线观看电影| 欧美激情在线99| 国产精华一区二区三区| 热99re8久久精品国产| 18禁在线播放成人免费| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 在线观看午夜福利视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产欧美日韩一区二区精品| 极品教师在线视频| 国产久久久一区二区三区| 真实男女啪啪啪动态图| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲色图av天堂| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产真实伦视频高清在线观看 | 神马国产精品三级电影在线观看| 美女大奶头视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 深夜a级毛片| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 丰满人妻一区二区三区视频av| or卡值多少钱| 国产成人影院久久av| 免费观看的影片在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品电影一区二区三区| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久久色成人| 日韩有码中文字幕| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 真实男女啪啪啪动态图| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产视频一区二区在线看| 国产乱人视频| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 十八禁人妻一区二区| 99热6这里只有精品| 黄色丝袜av网址大全| 少妇的逼水好多| 黄色一级大片看看| 动漫黄色视频在线观看| 色在线成人网| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 丰满乱子伦码专区| 中亚洲国语对白在线视频| 在线观看午夜福利视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 免费黄网站久久成人精品 | 日韩免费av在线播放| 亚洲乱码一区二区免费版| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲,欧美精品.| 黄片小视频在线播放| 我要看日韩黄色一级片| 桃红色精品国产亚洲av| 国产视频内射| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国内精品久久久久精免费| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久久成人免费电影| 少妇的逼好多水| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 久久中文看片网| 18禁在线播放成人免费| 免费大片18禁| 午夜免费激情av| x7x7x7水蜜桃| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 脱女人内裤的视频| 亚洲,欧美,日韩| 中文亚洲av片在线观看爽| 小说图片视频综合网站| 亚洲美女黄片视频| 精品一区二区免费观看| 观看美女的网站| 亚洲精品影视一区二区三区av| 一进一出抽搐动态| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美日本视频| 在线a可以看的网站| 日韩欧美 国产精品| 久久久成人免费电影| 亚洲av一区综合| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美成人免费av一区二区三区| 脱女人内裤的视频| 网址你懂的国产日韩在线| 大型黄色视频在线免费观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产淫片久久久久久久久 | 91在线观看av| 日本黄大片高清| 少妇人妻一区二区三区视频| 九色成人免费人妻av| 欧美激情在线99| 高清毛片免费观看视频网站| 色视频www国产| 窝窝影院91人妻| 天天一区二区日本电影三级| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久精品国产自在天天线| 高清日韩中文字幕在线| 成人午夜高清在线视频| 国产成人av教育| 国产综合懂色| 中文字幕av在线有码专区| 九九在线视频观看精品| 国产三级在线视频| 国产高清视频在线观看网站| 精品免费久久久久久久清纯| 免费在线观看亚洲国产| 窝窝影院91人妻| .国产精品久久| 国产av在哪里看| 久久久久久大精品| 夜夜爽天天搞| 99久久精品国产亚洲精品| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产爱豆传媒在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲欧美清纯卡通| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲第一电影网av| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲色图av天堂| 午夜福利高清视频| 88av欧美| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产人妻一区二区三区在| 欧美xxxx性猛交bbbb| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲综合色惰| 久久99热6这里只有精品| 成人国产综合亚洲| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 偷拍熟女少妇极品色| bbb黄色大片| av黄色大香蕉| av福利片在线观看| 美女免费视频网站| 亚洲av一区综合| 欧美色欧美亚洲另类二区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 精品不卡国产一区二区三区| 久久这里只有精品中国| 亚洲国产精品成人综合色| 色视频www国产| 韩国av一区二区三区四区| 97碰自拍视频| a级毛片a级免费在线| 熟女人妻精品中文字幕| 十八禁国产超污无遮挡网站| 婷婷亚洲欧美| 最好的美女福利视频网| 国产三级黄色录像| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲av不卡在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 一区二区三区激情视频| 一级a爱片免费观看的视频| 国产精品精品国产色婷婷| 久9热在线精品视频| 中文字幕久久专区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 99久久精品热视频| 丝袜美腿在线中文| 桃色一区二区三区在线观看| 18+在线观看网站| 国产精品一区二区性色av| 精品一区二区免费观看| 欧美在线一区亚洲| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产毛片a区久久久久| 精品久久久久久久久亚洲 | 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产精品伦人一区二区| 国产激情偷乱视频一区二区| 嫩草影视91久久| 国产成年人精品一区二区| 性色avwww在线观看| 精品久久久久久成人av| 国产精品人妻久久久久久| 97碰自拍视频| 亚洲最大成人av| 最新在线观看一区二区三区| 国产亚洲精品av在线| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲人成电影免费在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产黄a三级三级三级人| 久久性视频一级片| 亚洲av成人精品一区久久| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产在线男女| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲综合色惰| 久久久久九九精品影院| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 91久久精品电影网| 国产一区二区在线观看日韩| 18禁在线播放成人免费| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久久精品大字幕| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲精品色激情综合| 精品熟女少妇八av免费久了| a级一级毛片免费在线观看| 久久精品人妻少妇| 日本精品一区二区三区蜜桃| 青草久久国产| 中文字幕久久专区| 亚洲成人久久性| 中文字幕熟女人妻在线| 婷婷六月久久综合丁香| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品三级大全| 久久久国产成人精品二区| 亚洲精品在线美女| 一个人免费在线观看电影| 成人欧美大片| 日韩欧美三级三区| 久久精品国产亚洲av天美| av天堂在线播放| 国产真实乱freesex| 九九在线视频观看精品| 99国产综合亚洲精品| 国模一区二区三区四区视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 高清在线国产一区| 亚洲专区国产一区二区| av国产免费在线观看| 欧美成人a在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 精品人妻1区二区| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲在线观看片| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 在线天堂最新版资源| 日本精品一区二区三区蜜桃| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲国产精品合色在线| 99热只有精品国产| 亚洲欧美激情综合另类| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 很黄的视频免费| 欧美激情在线99| 国产精品永久免费网站| 久久热精品热| 99国产精品一区二区蜜桃av| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲国产精品999在线| 国模一区二区三区四区视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲,欧美精品.| 51国产日韩欧美| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品午夜福利视频在线观看一区| 精品国产亚洲在线| 日韩欧美免费精品| 国产精品电影一区二区三区| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲无线在线观看| av黄色大香蕉| 午夜影院日韩av| 成人性生交大片免费视频hd| 婷婷精品国产亚洲av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产在线精品亚洲第一网站| 精品人妻视频免费看| 国产人妻一区二区三区在| av福利片在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 日韩精品青青久久久久久| 天天躁日日操中文字幕| 色综合婷婷激情| 久久人人爽人人爽人人片va | 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 十八禁网站免费在线| 亚洲美女搞黄在线观看 | 99热这里只有是精品在线观看 | 亚洲精华国产精华精| 99热这里只有是精品50| 国产精品亚洲一级av第二区| 搡老妇女老女人老熟妇| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲专区国产一区二区| 18禁在线播放成人免费| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 一级a爱片免费观看的视频| av女优亚洲男人天堂| 在线观看66精品国产| 午夜亚洲福利在线播放| 免费一级毛片在线播放高清视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美黄色淫秽网站| 国产精品一区二区性色av| 中国美女看黄片| 99国产精品一区二区三区| 欧美一区二区国产精品久久精品| av在线老鸭窝| 国产伦精品一区二区三区视频9| 两人在一起打扑克的视频| 国内精品美女久久久久久| 午夜福利在线观看吧| 天天一区二区日本电影三级| 国产精品爽爽va在线观看网站| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 9191精品国产免费久久| 长腿黑丝高跟| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩人妻高清精品专区| 美女cb高潮喷水在线观看| 日本熟妇午夜| 偷拍熟女少妇极品色| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲欧美精品综合久久99| 精品久久久久久,| 成年免费大片在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久亚洲真实| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品女同一区二区软件 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品人妻视频免费看| 免费在线观看亚洲国产| 国产高清视频在线播放一区| 青草久久国产| 久久香蕉精品热| 成人无遮挡网站| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品久久久久久人妻精品电影| netflix在线观看网站| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 夜夜夜夜夜久久久久| 一区二区三区高清视频在线| 十八禁人妻一区二区| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品亚洲美女久久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产欧美日韩精品一区二区| 色吧在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 性欧美人与动物交配| 国产精品一区二区性色av| 午夜福利视频1000在线观看| 全区人妻精品视频| 桃红色精品国产亚洲av| 动漫黄色视频在线观看| a在线观看视频网站| 在线观看免费视频日本深夜| 老鸭窝网址在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 我要看日韩黄色一级片| 国产大屁股一区二区在线视频| 男人舔奶头视频| 熟女人妻精品中文字幕| 一进一出抽搐gif免费好疼| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 免费看日本二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 简卡轻食公司| 国语自产精品视频在线第100页| 天美传媒精品一区二区| 欧美+日韩+精品| 51午夜福利影视在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 中文字幕免费在线视频6| 最好的美女福利视频网| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 午夜a级毛片| 亚洲第一电影网av| 欧美午夜高清在线| 观看免费一级毛片| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 日韩高清综合在线| 精品福利观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 免费无遮挡裸体视频| a在线观看视频网站| 精品国产亚洲在线| 午夜精品在线福利| 国产乱人视频| 很黄的视频免费| 亚洲精品在线观看二区| 色视频www国产| www日本黄色视频网| 亚洲avbb在线观看| 草草在线视频免费看| 高清在线国产一区| 久久中文看片网| 脱女人内裤的视频| 九九热线精品视视频播放| 午夜日韩欧美国产| 最近视频中文字幕2019在线8| 欧美日韩国产亚洲二区| 最近中文字幕高清免费大全6 | 一级av片app| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 直男gayav资源| 亚洲18禁久久av| 日韩欧美在线乱码|