空間位阻凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定動物源性食品中抗組胺類藥物殘留

王 京，葉佳明，王 瀟，鐘世歡，陳青俊

（1.贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州 310030；2.浙江省輕工業(yè)研究所，浙江 杭州 310009；3.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江 杭州 311305）

隨著膳食結(jié)構(gòu)的不斷改善和對動物性蛋白質(zhì)需求的不斷增加，人們對肉制品、奶制品和魚制品等動物性食品的質(zhì)量要求也就越來越高，對食品的獸藥殘留引起了普遍關(guān)注，并認(rèn)為獸藥殘留將是今后食品安全性中重要問題之一[1-2]?？菇M胺類藥物，可用于鎮(zhèn)吐、抗暈眩、暈動癥以及鎮(zhèn)靜催眠。其在獸醫(yī)臨床上的藥理作用廣泛，飼料中添加此類藥物，能興奮攝食中樞，不法商人在動物養(yǎng)殖過程中對其非法使用，從而達(dá)到增加動物采食和促進(jìn)生長增加體重等作用[3]；另外，使用抗組胺類藥物可降低動物運(yùn)輸過程中的死亡率。因該類藥物脂溶性高，易蓄積于脂肪組織，停藥數(shù)周乃至半年后，尿中仍可檢出其代謝物，且部分代謝物仍具有藥物活性；例如氯丙嗪、異丙嗪等藥物經(jīng)肝臟代謝，在細(xì)胞色素P450酶催化下被氧化為亞砜結(jié)構(gòu)物質(zhì)，會引起白細(xì)胞減少和粒細(xì)胞缺乏癥，從而引起人體肝臟、腎臟的病變，還會引起眼部并發(fā)癥等[4]?？菇M胺類藥物在養(yǎng)殖業(yè)中的使用已經(jīng)引起了美國、歐盟和日本等國家的高度重視。

目前有關(guān)動物源性食品中多種抗組胺類藥物的測定方法還較少，鮮見對同時測定動物源性食品中19 種抗組胺類藥物及其代謝物的研究。相關(guān)文獻(xiàn)主要僅檢測氯丙嗪、異丙嗪及其代謝物[5-7]，大部分研究局限于法醫(yī)學(xué)方面[8-10]。國內(nèi)外檢測低濃度水平的獸藥殘留通常采用的方法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-15]和氣相色譜-質(zhì)譜法[16-17]，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法數(shù)據(jù)通量大，無需衍生化且定性能力強(qiáng)，是一種靈敏度和選擇性極高的檢測手段。由于動物源性食品種類多、基質(zhì)復(fù)雜，標(biāo)準(zhǔn)方法和文獻(xiàn)報(bào)道多數(shù)采用固相萃取柱[18-19]、多功能凈化柱[20]等凈化手段，其步驟復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)成本高。本研究旨在建立一種基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS），結(jié)合空間位阻凈化技術(shù)[21-22]，實(shí)現(xiàn)同時測定19 種抗組胺類藥物及其代謝物殘留。本方法簡便快速，靈敏度滿足實(shí)際樣品的檢測需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙酸乙酯、乙腈、甲酸（均為色譜純） 德國Merck公司；檸檬酸鈉、檸檬酸氫鈉、氯化鈉、硫酸鎂、Na2EDTA（均為優(yōu)級純） 上海譜振生物科技有限公司；EMR-Lipid吸附劑 美國Agilent公司；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore-iQ高純水凈化儀制得。

19 種抗組胺藥物標(biāo)準(zhǔn)品（特非那定、阿司咪唑、西替利嗪、氯雷他定、羥嗪、溴苯那敏、地氯雷他定、賽庚定、氯苯那敏、曲吡那敏、苯海拉明、氯丙嗪、氯丙嗪亞砜、異丙嗪、異丙嗪亞砜、氟奮乃靜、氟奮乃靜亞砜、奮乃靜、奮乃靜亞砜） 德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260II超高效液相色譜儀-串聯(lián)6470三重四極桿質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；MultiReax旋渦振蕩器 德國Heidolph公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；N-EVAP112水浴式氮吹儀美國Organomation公司；Millipore-iQ高純水凈化儀美國Millipore公司；AS 3120超聲波振蕩器 天津特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 預(yù)處理

1.3.1.1 空間位阻凈化法

稱取經(jīng)均質(zhì)的試樣5.0 g于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL超純水、20 mL的乙酸乙酯-乙腈（20∶80，V/V）提取液，勻漿后超聲提取10 min，離心（8 000 r/min，5 min）后取清液加入2 g預(yù)先用3 mL水活化的EMR-Lipid吸附劑，渦旋振蕩并離心（8 000 r/min，5 min）；取全部清液加入5 g鹽（NaCl-MgSO4，1∶4，m/m），立即劇烈振搖并離心（4 ℃，8 000 r/min，5 min）；取上清液在40 ℃水浴中氮吹至盡干，加入1 mL初始比例的流動相（含0.1 mol/L Na2EDTA）復(fù)溶后過0.22 μm濾膜供UPLCMS/MS測定。

1.3.1.2 CEN法

稱取經(jīng)均質(zhì)的試樣5.0 g于50 mL聚丙烯離心管中，分別加入10 mL超純水、10 mL甲酸-乙腈（10∶90，V/V）提取液，超聲30 min，加入1 g檸檬酸鈉、1 g氯化鈉、4 g硫酸鎂、0.5 g檸檬酸氫鈉，渦旋振蕩并離心（5 000 r/min，5 min）。取5 mL上清液加入0.75 g硫酸鎂、0.25 g N-丙基乙二胺（N-propylethylenediamine，PSA）、0.15 g C18和0.15 g Al-N，渦旋振蕩并離心（5 000 r/min，5 min），取上清液1 mL用0.1%甲酸溶液定容至10 mL，混勻后過0.22 μm濾膜供UPLC-MS/MS測定。

1.3.1.3 AOAC法

稱取經(jīng)均質(zhì)的試樣5.0 g于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL超純水、25 mL乙腈，勻漿提取后，分別加入10 g硫酸鎂、1 g氯化鈉，勻漿并離心（5 000 r/min，5 min）。取上層乙腈4 mL加入1.2 g硫酸鎂、0.1 g PSA、0.1 g C18，渦旋振蕩并離心（5 000 r/min，5 min），取上清液過0.22 μm濾膜供UPLC-MS/MS測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 mg/mL）的配制：準(zhǔn)確稱取19 種藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10.0 mg，用乙腈分別溶解定容至10.0 mL，于－18 ℃冷凍保存。

標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液（10 μg/mL）的配制：分別取標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0 mL混合，用乙腈定容至100 mL，于－18 ℃冷凍保存。

標(biāo)準(zhǔn)混合空白工作液的配制：取標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液，用初始比例流動相稀釋成1、2、5、10、20、50、100 μg/L系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合空白工作液。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：取陰性樣品，按照1.3.1節(jié)的預(yù)處理方法處理濃縮至近干，加入標(biāo)準(zhǔn)混合空白工作液1.0 mL后按1.3.1節(jié)繼續(xù)操作，即得。

1.3.3 UPLC-MS/MS測定

表1 19 種藥物的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Mass spectrometric acquisition parameters of 19 drugs

LC條件：Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動相A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～3 min，10%～10% B；3～6 min，10%～30% B；6～8 min，30%～40% B；8～12 min，40%～70% B；12～14 min，7%～90% B；14～16 min，90%～90% B；16～16.5 min，90%～10% B。

MS條件：Agilent Jet Stream電噴霧離子源；動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式采集數(shù)據(jù)；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流量10 L/min；鞘氣流量12 L/min；霧化氣壓力25 psi；毛細(xì)管電壓4 000 V；MS/MS分辨率為unit；19 種抗組胺藥物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

定量方法：取1.3.2節(jié)制備的樣液上機(jī)測定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再取1.3.1節(jié)制備的樣液上機(jī)測定，以保留時間和2 對特征離子對定性，以定量離子的峰面積計(jì)算樣液中目標(biāo)物的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源正離子全掃描模式下分別對19 種質(zhì)量濃度為1 μg/mL的抗組胺藥物進(jìn)行分析，所有待測物均形成[M＋H]＋形式的準(zhǔn)分子離子峰。在單離子掃描模式下分別優(yōu)化每個待測物的裂解電壓使母離子響應(yīng)最大，后在子離子掃描和多反應(yīng)監(jiān)測分析中確定兩對定性離子對和一對定量離子對，并優(yōu)化其碰撞能使子離子響應(yīng)最大化。同時，在多殘留檢測中為盡可能地提升靈敏度和定量的準(zhǔn)確性，采用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以根據(jù)不同待測物的保留時間，分段進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測掃描，增加每個待測物的掃描駐留時間，從而加大目標(biāo)離子的通量提高數(shù)據(jù)采集效率，進(jìn)而提升靈敏度、保證重復(fù)性。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

因西替利嗪和羥嗪；氟奮乃靜、氟奮乃靜亞砜、奮乃靜和奮乃靜亞砜；氯丙嗪、氯丙嗪亞砜、異丙嗪和異丙嗪亞砜具有結(jié)構(gòu)相同的母核，質(zhì)譜行為接近，在二級質(zhì)譜中產(chǎn)生相同的豐度較高的子離子碎片，為準(zhǔn)確定量需保證色譜上的分離度。本研究綜合考慮系統(tǒng)耐壓、分析時間和分離效果，主要對比了Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）、Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Cortecs C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）、XBridge C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Accucore Vanquish C18柱（100 mm×2.1 mm，1.5 μm）5 種色譜柱。綜合各方面因素最終選取柱效較高且背壓較低的Poroshell 120 C18柱，能達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)效果。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)資料，酸性流動相體系在正離子模式下能增強(qiáng)待測物的離子化效率從而提高靈敏度，乙腈和甲醇相比具有更小的基線噪音影響和更強(qiáng)的反相洗脫能力，從而增大梯度洗脫程序設(shè)計(jì)的靈活性，故選擇乙腈為有機(jī)相。本研究主要對水相添加不同濃度的甲酸和甲酸銨與乙腈進(jìn)行組合，考察其響應(yīng)值，結(jié)果以某種水相與A種水相中19 種藥物響應(yīng)平均值的比值計(jì)算，制作變化圖（圖1）。結(jié)果表明：水相中加入甲酸和甲酸銨都能明顯提升靈敏度，0.1%的甲酸添加量能達(dá)到最佳靈敏度。為保證梯度洗脫的穩(wěn)定性，同時在乙腈中加入相同的0.1%甲酸。最終確定0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸-乙腈溶液作為流動相，所有19 種待測物的典型多反應(yīng)監(jiān)測圖見圖2。

圖1 不同流動相的比較Fig. 1 Comparison of different mobile phases

圖2 19 種藥物的典型多反應(yīng)監(jiān)測譜圖Fig. 2 Typical MRM chromatograms of 19 drugs

2.3 預(yù)處理方法的優(yōu)化

動物源性食品通常含大量的脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，在預(yù)處理過程中動物細(xì)胞膜的主要成分磷脂也會源源不斷溶出，這些物質(zhì)在離子源會與待分析物競爭電子引起很大的基質(zhì)效應(yīng)，嚴(yán)重影響定量的準(zhǔn)確性，因此如何最大程度地凈化來削弱基質(zhì)效應(yīng)是分析的主要難點(diǎn)。獸藥殘留檢測的常用提取溶劑有緩沖鹽溶液、甲醇、乙腈、乙酸乙酯等，加入適量的甲酸或氨水也能促進(jìn)提??；19 種抗組胺類藥物極性均較弱但是極性范圍較寬，實(shí)驗(yàn)表明使用緩沖鹽溶液或甲醇作為提取劑時特非那定等藥物的回收率不足40%，使用乙酸乙酯作為提取劑時曲吡那敏等藥物的回收率不足60%，而使用乙腈和乙酸乙酯的混合溶液作為提取劑能覆蓋大部分的待測物的極性；19 種抗組胺類藥物的pKa值范圍在3.7～9.3之間，故不加入甲酸或氨水促進(jìn)提取，最終選擇乙酸乙酯-乙腈（20∶80，V/V）作為提取溶劑。

分散固相萃取技術(shù)是目前實(shí)驗(yàn)室開展藥物殘留檢測工作主流的預(yù)處理手段[23-31]，它兼顧了凈化效果和效率，AOAC法和CEN法等國際方法中主要用的吸附劑有PSA、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、中性氧化鋁（Al-N）等，其中PSA和Al-N主要吸附極性雜質(zhì)、GCB主要吸附色素同時會對平面結(jié)構(gòu)的化合物存在共吸附、C18主要吸附脂類和糖類物質(zhì)但是因針對性較差也引起一些親脂類化合物回收率偏低；EMR-Lipid技術(shù)是一種基于空間位阻原理的特殊聚合物基質(zhì)EMR的凈化手段，專門吸附脂質(zhì)中C5及以上的碳鏈，對脂質(zhì)具有非常強(qiáng)的選擇吸附性。由于19 種抗組胺類藥物的極性均較弱，因此在反相色譜上的共餾出物于離子源處形成基質(zhì)效應(yīng)的物質(zhì)主要是磷脂等弱極性的物質(zhì)，本研究考察了通過空間位阻凈化法、CEN法和AOAC法凈化豬肉樣品后的磷脂殘留來評價3 種預(yù)處理方式的凈化效果，磷脂并非單一化合物，主要分為甘油磷脂和鞘磷脂兩大類，但是其含磷酸的母體是相同的，故可采用母離子掃描模式監(jiān)測184＋碎片離子來監(jiān)測磷脂殘留量。如圖3所示，可知空間位阻凈化法的磷脂殘留最少，CEN法凈化后仍有一定量的磷脂存在，AOAC法凈化后磷脂殘留最多，因此最終確定了空間位阻凈化法為本研究的預(yù)處理手段。

圖3 豬肉樣品經(jīng)3 種方法凈化后的磷脂殘留監(jiān)測對比圖Fig. 3 Comparison of phospholipid residues in pork samples purified by three methods

由于氯丙嗪、異丙嗪、奮乃靜、氟奮乃靜等吩噻嗪類抗組胺藥物具有相同的硫氮雜蒽母核，其環(huán)上硫原子所具有的兩對孤對電子極易與基質(zhì)中的金屬離子絡(luò)合甚至被儀器金屬管路吸附，造成峰形拖尾、重復(fù)性差等現(xiàn)象，Na2EDTA能競爭絡(luò)合基質(zhì)中的金屬離子使待測物母核游離出來，因此最終復(fù)溶時用流動相加入Na2EDTA（最終濃度為0.1 mol/L）較好地改善了重復(fù)性。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察結(jié)果

液相色譜-質(zhì)譜分析中存在的基質(zhì)效應(yīng)，除了在預(yù)處理過程中盡可能凈化樣品，通常采用稀釋法、標(biāo)準(zhǔn)加入法、內(nèi)標(biāo)法、基質(zhì)配標(biāo)法來削弱或修正基質(zhì)效應(yīng)造成的偏差；本研究以基質(zhì)效應(yīng)最明顯的豬肝為例，通過優(yōu)化梯度洗脫程序和基質(zhì)配標(biāo)法較好地減弱和抵消了基質(zhì)效應(yīng)，比較結(jié)果見表2。

表2 19 種藥物的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects of 19 drugs

2.5 方法學(xué)考察結(jié)果

2.5.1 線性與檢出限結(jié)果

表3 19 種藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of 19 drugs

按上述條件將系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)測定，以峰面積為縱坐標(biāo)（y），以質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)（x）制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到線性方程的線性回歸系數(shù)r2均大于0.999，表明19 種抗組胺藥物在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測定，以定性子離子的3 倍信噪比計(jì)算檢出限和10 倍信噪比計(jì)算定量限，結(jié)果見表3，得到19 種抗組胺藥物檢出限為0.2～2.0 μg/kg，定量限為0.6～6.0 μg/kg，靈敏度滿足實(shí)際樣品檢測的需要。

2.5.2 回收率與重復(fù)性結(jié)果

在陰性牛肉、雞肉和豬肝中分別添加3個質(zhì)量濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6 次回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。可知回收率在75.1%～89.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～7.1%，方法具有較好的精密度，能滿足實(shí)際樣品的檢測需要。

表4 19 種獸藥的準(zhǔn)確度和精密度（n=6）Table 4 Accuracy and precision for 19 drugs (n= 6)

2.5.3 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

采用本方法對流通領(lǐng)域市售雞肉86 份、牛肉91 份、豬肝77 份進(jìn)行19 種抗組胺藥物及其代謝物的篩查，檢出豬肝氯丙嗪陽性樣品3 例、異丙嗪陽性樣品1 例，檢出牛肉氯丙嗪陽性樣品1 例、奮乃靜陽性樣品1 例；全部陽性樣品同時均檢出其亞砜結(jié)構(gòu)代謝物，可見通常代謝物與本體會同時存在，內(nèi)臟等脂肪含量高的組織更易蓄積抗組胺類藥物及其代謝物。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC-MS/MS同時測定畜禽肉中19 種抗組胺藥物及其代謝物殘留的方法。通過比較空間位阻凈化法、CEN法和AOAC法3 種不同前處理方法的凈化效果，驗(yàn)證了空間位阻凈化法的有效性。通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜參數(shù)，得到了最佳的儀器檢測條件。方法學(xué)考察和實(shí)際樣品的測定證明該方法實(shí)用、可靠。與目前的國家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道的方法相比，本方法在擴(kuò)大了同類型藥物檢測范圍、準(zhǔn)確性較好、靈敏度較高的同時，盡可能省去了復(fù)雜的前處理，節(jié)省了成本，能更快更好地為市場監(jiān)管部門的監(jiān)督執(zhí)法提供技術(shù)支持。