基于高效液相色譜法對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉的提取和凈化

盧蘭香，薛 霞，張艷俠，楊 昊，王 駿，祝建華，劉艷明*

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101）

吡蟲啉，化學(xué)名稱為1-(6-氯吡啶-3-吡啶基甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺，為內(nèi)吸性新煙堿類殺蟲劑，具有廣譜、高效、低毒、低殘留，害蟲不易產(chǎn)生抗性，對(duì)人、畜、植物和天敵安全等特點(diǎn)[1]，并具有觸殺、胃毒和內(nèi)吸等多重作用[2]，廣泛應(yīng)谷物、蔬菜、茶葉等大多數(shù)農(nóng)作物。隨著吡蟲啉用量增多及使用范圍的日益擴(kuò)大，其安全性也備受關(guān)注。研究表明，吡蟲啉影響蜜蜂的采食量和死亡率[3-4]，被人或動(dòng)物長(zhǎng)期食用后，會(huì)在體內(nèi)蓄積，引起慢性中毒[5]。許多國(guó)家已經(jīng)制定了吡蟲啉在相關(guān)農(nóng)產(chǎn)品中的最高允許限量。澳大利亞規(guī)定谷物中最高殘留限量為0.05 mg/kg[6]；日本肯定列表中茶葉中的限量標(biāo)準(zhǔn)為10 mg/kg，蔬菜中的最大殘留限量為5 mg/kg[7]；韓國(guó)也對(duì)茶葉中吡蟲啉提出檢測(cè)要求；我國(guó)GB 2763—2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[1]中規(guī)定吡蟲啉的最高殘留限量：茶葉為0.5 mg/kg，谷物為0.05 mg/kg，黃瓜為1 mg/kg。

目前，吡蟲啉的殘留分析標(biāo)準(zhǔn)和研究方法主要有氣相色譜（gas chromatography，GC）法[9-10]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[11-13]、高效液相色譜法[14-18]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19-26]。GC和GC-MS方法常受到化合物極性、沸點(diǎn)及前處理方法相對(duì)復(fù)雜和耗時(shí)長(zhǎng)等限制。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法儀器昂貴難以普及，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重，定量存在一定的局限性。高效液相色譜法具有普及率高、定量準(zhǔn)確、兼容性好等特點(diǎn)，廣泛用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。已報(bào)道的吡蟲啉殘留的前處理技術(shù)主要包括加速溶劑萃取[27]、基質(zhì)固相分散、分散固相萃取、微波輔助萃取、超臨界流體萃取、凝膠滲透色譜[21]、液相微萃取[17-18,23]、分子印跡技術(shù)[28]、膠束介質(zhì)萃取、逆固相基質(zhì)分散法、QuEChERS（quick, easy,cheap, effective, rugged and safe）[16,25-26]和固相萃取（solid-phase extraction，SPE）[14-15,19-20]等。由于農(nóng)產(chǎn)品樣品的多樣性和復(fù)雜性，常采用的凈化方式有SPE和QuEChERS兩種。對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉的高效液相色譜檢測(cè)方法法報(bào)道較多，但對(duì)于不同提取方式下不同基質(zhì)中吡蟲啉提取的影響，及不同凈化方式對(duì)不同農(nóng)產(chǎn)品的凈化效果的系統(tǒng)研究鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選取蔬菜中的黃瓜、谷物中的大米及茶葉3 種基質(zhì)為研究對(duì)象，對(duì)直接用乙腈提取和加水后再用乙腈提取兩種不同提取方式和SPE、QuEChERS兩種凈化方式進(jìn)行深入討論，擬建立吡蟲啉農(nóng)藥殘留的高效液相色譜檢測(cè)方法。該方法可以為農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉農(nóng)藥殘留的監(jiān)測(cè)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉、大米、黃瓜 市購(gòu)。

吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品 農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（天津）；XBridge C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm） 美國(guó)Waters公司；醋酸鈉提取鹽試劑包（6 g MgSO4、1.5 g NaOAc）、15 mL PSA/C18凈化管（400 mg乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、400 mg C18、1 200 mg MgSO4）、WondaSep GC-e/PSA（500 mg，500 mg，6 mL） 島津技邇（上海）商貿(mào)有限公司；乙腈、甲苯（均為色譜純） 美國(guó)Fisher公司；氯化鈉（分析純） 西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀（配備2998二極管陣列檢測(cè)器）美國(guó)Waters公司；AB204-S型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；SB-800DTD型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Milli-Q超純水制備器 美國(guó)Millipore公司；渦旋混合器 德國(guó)IKA公司；N-EVAP-45型氮吹儀美國(guó)Organomation Associates公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg/L），使用前根據(jù)需要用乙腈-0.1%磷酸（1∶1，V/V）稀釋至適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃避光保存。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 SPE處理過程

提?。悍Q取適量（精確到0.01 g）粉碎均勻的試樣（黃瓜10 g、大米5 g、茶葉2 g），置于50 mL聚丙烯具塞離心管中，加入10 mL水（大米和茶葉加水，黃瓜不加水），渦旋混勻，加入乙腈20 mL，渦旋，超聲提取30 min。加入5 g氯化鈉，劇烈振蕩，靜置，離心，使乙腈和水分層，取乙腈層10 mL于15 mL離心管中，45 ℃氮吹濃縮至近干。加入2 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）溶解殘?jiān)?，待凈化?/p>

凈化：分別用5 mL乙腈、5 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）活化SPE柱，將上述樣品提取液分別上樣，上樣開始用15 mL離心管收集淋洗液，再用2 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）清洗裝濃縮液的15 mL離心管（重復(fù)1 次），倒入SPE柱；剩余用約10 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）淋洗，收集所有流出液，氮吹至近干，用1 mL乙腈-0.1%磷酸（1∶1，V/V）復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定。

1.3.2.2 QuEChERS處理過程

稱取適量（精確到0.01 g）粉碎均勻的試樣（黃瓜10 g、大米5 g、茶葉2 g），分別置于不同的50 mL聚丙烯具塞離心管中，加入10 mL水（大米和茶葉加水，黃瓜不加水），渦旋混勻，加入乙腈20 mL，渦旋，超聲提取30 min。加入醋酸鈉提取鹽試劑包，劇烈搖勻后，超聲提取20 min，離心，取上層提取液到15 mL PSA/C18凈化管中，充分搖勻后離心。取上清液10 mL于15 mL離心管中，45 ℃氮吹濃縮至近干。用1 mL乙腈-0.1%磷酸（1∶1，V/V）復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 模擬陽性樣品的制作

大米模擬陽性樣品的制作方法：把一定濃度的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液加入一定量的大米中，充分混勻，然后使溶劑全部揮發(fā)，放置7 d，粉碎均勻，過20 目篩，混勻，得到添加量約1 mg/kg的模擬陽性樣品。

黃瓜和茶葉的陽性樣品：均購(gòu)自于超市，經(jīng)檢測(cè)是陽性樣品。

1.3.4 高效液相色譜條件

XBridge C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸（A）和乙腈（B）。梯度洗脫程序：0～5 min，85%～80% A；5～15 min，80%～75% A；15～16 min，75%～5% A；16～20 min，5% A；20～21 min，5%～85% A；21～25 min，85% A；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；流速：0.8 mL/min。柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過與儀器配套的Empower 3色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)采集與處理，以及Origin 8.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 樣品提取條件的優(yōu)化

2.1.1.1 加水提取和不加水提取的比較

圖1 提取方式對(duì)陽性樣品吡蟲啉提取效果的影響Fig. 1 Effect of different extraction methods on imidacloprid content in positive samples

農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉的殘留分析常用的提取溶劑有乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、甲醇等。由于乙腈的提取效率高，提取雜質(zhì)少，有利于后續(xù)鹽析和凈化，操作簡(jiǎn)便，因此采用乙腈作為提取溶劑[13]。為驗(yàn)證不同提取條件對(duì)吡蟲啉提取的影響，實(shí)驗(yàn)采用SPE凈化方式，分別考察直接用乙腈提取和加水后再用乙腈提取對(duì)黃瓜、大米、茶葉陽性樣品提取效果見圖1；對(duì)陰性樣品和陽性樣品回收率的影響見圖2。

由圖1可見，對(duì)于陽性樣品，大米、茶葉中吡蟲啉的含量，加水提取是未加水提取的數(shù)倍；而黃瓜加水提取和不加水提取幾乎無差異。原因可能是一方面大米和茶葉為干性樣品，加水后能使其充分浸潤(rùn)，提取溶劑與樣品能夠充分接觸；另一方面吡蟲啉極性比較大，水的極性和滲透性強(qiáng)于乙腈和甲醇，加水后減弱了農(nóng)藥與基質(zhì)之間的相互作用，所以加水后大米和茶葉中吡蟲啉更容易被溶劑提取。而蔬類的黃瓜樣品本身含有大量的水，所以直接用乙腈提取和加水后再用乙腈提取結(jié)果差異很小。

圖2 提取方式對(duì)吡蟲啉回收率的影響Fig. 2 Effect of different extraction methods on imidacloprid recovery

由圖2可見，對(duì)于陽性樣品和陰性樣品，加水提取和不加水提取，不同農(nóng)產(chǎn)品吡蟲啉的回收率均不存在明顯的差異，可能是由于加標(biāo)時(shí)加入的吡蟲啉為游離狀態(tài)，即使不加水提取，也能夠比較容易的被乙腈萃取，導(dǎo)致兩種提取方式回收率都正常。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同基質(zhì)的試樣，雖然加水提取和不加水提取的回收率均正常，但是對(duì)于大米、茶葉等干性樣品存在提取不完全的問題。所以實(shí)驗(yàn)選擇黃瓜用乙腈直接提取，大米和茶葉加水后再用乙腈提取。

2.1.1.2 加水量的選擇

如圖3所示，采用SPE凈化方式，當(dāng)加水量2 mL和5 mL時(shí)，茶葉和大米樣品不能完全浸潤(rùn)，但隨著加水量的增加，檢測(cè)結(jié)果變化很小。因此實(shí)驗(yàn)選擇最終加水量為10 mL。

圖3 加水體積對(duì)吡蟲啉提取效果的影響Fig. 3 Effect of water added to agricultural products on the extraction efficiency of imidacloprid

2.1.1.3 浸泡時(shí)間的選擇

圖4 加水浸泡時(shí)間對(duì)吡蟲啉提取效果的影響Fig. 4 Effect of soaking time on the extraction efficiency of imidacloprid

圖4 表明：加水浸泡時(shí)間對(duì)大米、茶葉陽性樣品提取率和陰性樣品回收率的影響差異很小，而且隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，提取出的干擾成分增多，不利于后續(xù)過程中目標(biāo)物的凈化和分離。因此，實(shí)驗(yàn)選擇不浸泡。

2.1.2 樣品凈化方式選擇

農(nóng)產(chǎn)品種類繁多，基質(zhì)比較復(fù)雜。比如蔬菜中存在的酚類、色素、有機(jī)酸、油脂、甾類、烯烴類等干擾物；茶葉中含有的大量色素、有機(jī)酸、茶多酚等物質(zhì)。農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉的殘留分析中常用的凈化方式有SPE和QuEChERS。吡蟲啉農(nóng)藥殘留分析的SPE凈化方法中Carb-NH2[19-20]、Carb-PSA[14-15]兩種小柱凈化效果比較好。因?yàn)榛钚蕴夹≈軌蛴行コ?，PSA、氨基（NH2）主要用于去除有機(jī)酸、脂肪酸、糖類及部分色素。但是兩者相比，PSA有兩個(gè)氨基，更能有效去除干擾，所以實(shí)驗(yàn)選用WondaSep GC-e/PSA小柱。而QuEChERS與傳統(tǒng)方法相比，具有分析對(duì)象范圍廣、基質(zhì)適用范圍廣、穩(wěn)定性好、低成本、操作簡(jiǎn)單快捷等優(yōu)點(diǎn)[29]。為驗(yàn)證這兩種凈化方式對(duì)吡蟲啉凈化效果的影響，實(shí)驗(yàn)采用黃瓜、大米、茶葉陽性樣品按照1.3.2節(jié)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖5。

由圖5可見，大米基質(zhì)簡(jiǎn)單，兩種凈化方式凈化效果都比較好。對(duì)于黃瓜基質(zhì)，QuEChERS凈化方式雜峰較多，提取液色素不能被完全除去，凈化效果不理想；雖然QuEChERS也能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)物與雜質(zhì)的分離，但SPE凈化方式明顯優(yōu)于QuEChERS。而茶葉基質(zhì)更復(fù)雜，采用QuEChERS凈化方式時(shí)，茶葉中的脂肪酸、有機(jī)酸和極性色素等干擾基質(zhì)不能被有效除去。采用SPE凈化方式時(shí)，茶葉提取液無色透明，能夠有效去除干擾基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物與雜質(zhì)的完全分離，達(dá)到凈化目的。所以對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的農(nóng)產(chǎn)品優(yōu)先選用SPE凈化方式，而基質(zhì)簡(jiǎn)單的樣品QuEChERS與SPE凈化效果差別不大。

圖5 不同凈化方式對(duì)陽性樣品吡蟲啉凈化效果的影響Fig. 5 Comparison of different methods for the purification of imidacloprid

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較Symmetry Shield C18、Xbrige C18、Atlantis T3三種色譜柱對(duì)分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同的流動(dòng)相條件下吡蟲啉在Xbrige C18色譜柱的分離時(shí)間較Atlantis T3短，峰形優(yōu)于Symmetry Shield C18。在等度分離時(shí)，由于農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)的復(fù)雜性，不易實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物與雜質(zhì)的分離，而且容易干擾后續(xù)測(cè)定，所以實(shí)驗(yàn)采用梯度分離。

本實(shí)驗(yàn)比較文獻(xiàn)中幾種不同常用體系的流動(dòng)相：甲醇和水、乙腈和水、甲醇和0.1%磷酸、乙腈和0.1%磷酸。結(jié)果表明：乙腈和0.1%磷酸分離效果和峰形最佳。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈-0.1%磷酸（1∶1，V/V）逐級(jí)稀釋得質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按質(zhì)量濃度從低到高的順序，按1.3.4節(jié)條件進(jìn)行測(cè)定，以吡蟲啉峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方法，以信噪比為10得到目標(biāo)物的定量限，以信噪比為3得到目標(biāo)物的檢出限，結(jié)果見表1。吡蟲啉在0.05～10.0 μg/mL之間線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：Y=9.31×104X＋3.87×103，R2=0.999。

表1 黃瓜、大米、茶葉3 種樣品的檢出限與定量限Table 1 Limits of detection and limits of quantitation for cucumber, rice and tea

圖6 吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.0 μg/mL）的高效液相色譜（A）和光譜（B）圖Fig. 6 HPLC chromatogram (A) and spectrum (B) of imidacloprid standard solution

2.3.2 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)采取陰性樣品中添加0.05、0.1 mg/kg和1.0 mg/kg進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平平行測(cè)定6 次，得到方法的回收率及精密度，見表2。結(jié)果顯示，3 個(gè)水平的加標(biāo)回收率在88.3%～109.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.9%～3.5%之間。

表2 黃瓜、大米、茶葉3 種樣品的回收率及精密度（n= 6）Table 2 Recoveries and precision (RSD) for spiked cucumber,rice and tea (n= 6)

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

應(yīng)用本方法對(duì)市售的黃瓜、大米、茶葉各40 批次樣品進(jìn)行分析，吡蟲啉殘留量檢測(cè)結(jié)果為：黃瓜有1 批次樣品檢出，含量為0.171 mg/kg，低于GB 2763—2016中規(guī)定的限量要求；大米均未檢出；茶葉有6 批次樣品檢出，其中5 批次含量為0.102～0.425 mg/kg，1 批次高于GB 2763—2016的限量要求，含量為4.811 mg/kg。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉農(nóng)藥殘留的高效液相色譜檢測(cè)方法。結(jié)果表明：加水和不加水兩種不同的提取方式，對(duì)于含水量較高的蔬菜，結(jié)果無差異；而對(duì)于谷類、茶葉等干性樣品，結(jié)果差異比較大，加水量和浸泡時(shí)間對(duì)結(jié)果影響很小。對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的農(nóng)產(chǎn)品SPE凈化效果明顯優(yōu)于QuEChERS，而基質(zhì)簡(jiǎn)單的農(nóng)產(chǎn)品二者差別很小。本實(shí)驗(yàn)可為農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉農(nóng)藥殘留測(cè)定方法的建立提供技術(shù)支持。