響應(yīng)面法優(yōu)化以SPME-GC-MS技術(shù)萃取人參花揮發(fā)性成分工藝的研究

肖陽，姜濤，韓燕燕，王中喜，王恩鵬※，陳長寶※

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，長春 130021；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

人參主要生長在黑龍江省、遼寧省、吉林省、河北省北部等地[1]，人參花是五加科植物人參的花蕾[2]，主要化學(xué)成分有人參皂苷、揮發(fā)性成分、脂肪酸、多糖、黃酮、多肽等[3～6]，具有鎮(zhèn)靜、抑菌、抗腫瘤及保護神經(jīng)細(xì)胞等藥理作用[7～11]。近年來，國內(nèi)、外對人參花中皂苷類成分已經(jīng)做了較多的研究，但對于人參花揮發(fā)性成分的研究相對較少。本研究利用響應(yīng)面分析法對固相微萃取提取人參花揮發(fā)性成分工藝進行優(yōu)化，為研究其化學(xué)成分及藥理作用等提供參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器

電子分析天平（西杰天平儀器有限公司）；高速中藥粉碎機（浙江省永康市溪岸五金藥具廠）；恒溫水浴鍋dsy-2-4（北京國華醫(yī)療器械廠）；SPME萃取手柄及萃取架、萃取頭（PDMS，PDMS-DVB，PA）、頂空萃取瓶（美國Supelco公司）；TSQ 8000（美國 Thermo Fisher公司）。

1.2 材料

鮮人參花購于吉林省撫松縣萬良市場，2018年7月花期采摘。

2 實驗方法

2.1 固相微萃取樣品的制備

鮮人參花40℃恒溫減壓干燥，粉碎過20目篩備用。

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜測定條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：HP-5ms（30mm 0.25mm，0.25μm）石英毛細(xì)管柱；載氣、流速：氦氣、1mL/min；汽化室溫度：280℃；進樣方式、流速：不分流進樣、1mL/min；溶劑延遲時間：3.8min；程序升溫見表1。

表1 程序升溫表Table 1 Temperature programming table

2.2.2 質(zhì)譜條件 電離源：EI源；電離能量：70eV；進樣口溫度：250℃；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；加速電壓：1 300V；質(zhì)量掃描范圍：50amu～550amu。

2.3 人參花揮發(fā)性成分的提取及測定

稱取樣品，置于15mL樣品瓶中，水浴加熱平衡，頂空萃取，解析附1min，解析溫度250℃。

2.4 萃取頭的優(yōu)化

稱取0.6g人參花粉末，按照“2.3”項下方法操作，將樣品瓶70℃水浴平衡 30min、萃取 30min，比較PDMS、PDMS-DVB、PA對人參花揮發(fā)性成分萃取量的影響。選取人參花揮發(fā)性成分中7種揮發(fā)性成分為參考對象，比較3種萃取頭萃取該7種組分所得的總峰面積。

2.5 固相微萃取提取人參花揮發(fā)性成分的單因素實驗

2.5.1 溫度對人參花揮發(fā)性成分萃取量的影響 稱取0.6g人參花粉末，按“2.3”項下方法操作，將樣品瓶分別置于 50℃、60℃、70℃、80℃、90℃恒溫水浴鍋，平衡30min，萃取30min，比較不同溫度下人參花揮發(fā)性成分的總峰面積。

2.5.2 平衡時間對人參花揮發(fā)性成分萃取量的影響

稱取0.6g人參花粉末，按“2.3”項下方法操作，將樣品瓶置于70℃恒溫水浴鍋，分別平衡5min、15min、30min、45min、60min，萃取30min，比較不同平衡時間人參花揮發(fā)性成分的總峰面積。

2.5.3 萃取時間對人參花揮發(fā)性成分萃取量的影響

稱取0.6g人參花粉末，按“2.3”項下方法操作，將樣品瓶置于70℃恒溫水浴鍋，平衡30min，分別萃取5min、15min、30min、45min、60min，比較不同萃取時間人參花揮發(fā)性成分的總峰面積。

2.5.4 樣品量對人參花揮發(fā)性成分萃取量的影響分別稱取人參花粉末0.1g、0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g，按“2.3”項下方法操作，將樣品瓶置于70℃恒溫水浴鍋，平衡30min，萃取30min，比較不同樣品量人參花揮發(fā)性成分的總峰面積。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化固相微萃取對人參花揮發(fā)性成分萃取的工藝

選取樣品量（A）、溫度（B）、平衡時間（C）、萃取時間（D）4個因素，設(shè)定3個水平，把總峰面積設(shè)為響應(yīng)值（R），進行4因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計，并利用響應(yīng)面分析法對人參花揮發(fā)性成分提取工藝進行優(yōu)化。試驗因素和水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗的因素和水平Tab.2 Factors and levels of response surface testing

2.7 響應(yīng)模型的建立與分析

采用 Design-expert軟件按照 Box-Benhnken實驗設(shè)計了29組實驗，24組為析因點實驗，5組為重復(fù)實驗，結(jié)果見表3。

表3 Box-Benhnken實驗設(shè)計Tab.3 Box-Benhnken experimental design

2.8 工藝驗證試驗

稱取0.4g人參花粉末，按“2.3”項下方法操作，樣品瓶75℃水浴平衡37min，萃取43min。按照上述選取的最佳工藝條件進行3次平行實驗，得出人參花揮發(fā)性成分的總峰面積。

3 實驗結(jié)果

3.1 萃取頭的優(yōu)化

PDMS對保留時間較短的非極性或弱極性化合物的萃取能力較強，PA對極性成分表現(xiàn)出較強的萃取能力，PDMS-DVB對各類組分都有萃取。PDMSDVB纖維頭既能分析到人參花中倍半萜烯成分，也能分析到其中的醇類等極性較大的成分，且PDMSDVB萃取頭的萃取量綜合起來更高些，因此選用PDMS-DVB萃取頭。見圖1。

圖1 萃取頭的優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization for the extraction head

3.2 單因素實驗

3.2.1 溫度對人參花揮發(fā)性成分萃取量的影響50℃～70℃時，總峰面積增長明顯；70℃以后總峰面積增長不明顯。人參花揮發(fā)性成分的主要成分是萜類化合物，其中一些單萜類成分和低沸點的醛、醇類化合物首先揮發(fā)到樣品瓶上部，由于其所占揮發(fā)物含量較低，所以，對總峰面積的影響不大。隨著溫度的升高，一些倍半萜類的成分逐漸揮發(fā)到氣相中，增加了氣相中揮發(fā)性成分的含量，峰面積此時大幅躍升。由于溫度過高會增加萃取難度，所以，樣品最佳平衡和萃取溫度范圍為60℃～80℃。見圖2。

圖2 溫度對人參花揮發(fā)性成分萃取量的影響Fig.2 Effect of temperature on the extraction of volatile components from ginseng flowers

3.2.2 平衡時間對人參花揮發(fā)性成分萃取量的影響

平衡時間為5min～30min時，總峰面積不斷增加；平衡時間達到30min時，總峰面積不再增加，樣品瓶頂空空氣中的揮發(fā)性成分已經(jīng)趨于平衡。所以，樣品的最佳平衡時間范圍為15min～45min。見圖3。

圖3 平衡時間對人參花揮發(fā)性成分萃取量的影響Fig.3 Effect of equilibrium time on the extraction of volatile components from ginseng flowers

3.2.3 萃取時間對人參花揮發(fā)性成分萃取量的影響

萃取時間為5min～30min時，總峰面積隨著時間的增加急劇上升；萃取時間達到30min后，總峰面積趨于平衡。所以，最佳萃取時間范圍為15min～45min。見圖4。

圖4 萃取時間對人參花揮發(fā)性成分萃取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction of volatile components from ginseng flowers

3.2.4 樣品量對人參花揮發(fā)性成分萃取量的影響樣品量為0.1g～0.4g時，總峰面積急劇上升，此時樣品量對人參花揮發(fā)性成分萃取量有顯著影響；樣品量為0.4g～0.8g時，總峰面積增長趨于平緩；樣品量為0.8g～1.0g時，總峰面積呈下降趨勢，可能是樣品量過多，樣品厚度增加，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分揮散到樣品瓶上部，空氣中的難度增加，從而導(dǎo)致人參花揮發(fā)性成分萃取量減少。所以，最佳樣品量范圍為0.4g～0.8g。見圖5。

圖5 樣品量對人參花會揮發(fā)性成分萃取量的影響Fig.5 Effect of sample weigh on the extraction of volatile components from ginseng flowers

3.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果與優(yōu)化分析

3.3.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果 利用Design Expert軟件對表5進行統(tǒng)計分析，得出總峰面積與各提取因素變量間的函數(shù)關(guān)系為總峰面積=+3.026E+010+4.503E+008 A+3.657E+009 B+1.740E+009 C+3.648E+009 D-1.458E+008 A B+7.306E+006 A C-8.894E+008 A D+6.649E+008 B C-1.058E+008 B D-3.494E+008 C D-2.329E+008 A2-3.679E+009 B2-1.920E+009C2-2.400E+009D2

為了說明回歸方程的有效性及各因素對提取率的影響程度，對回歸方程進行了方差分析，結(jié)果見表4。

表4 回歸方程的方差分析Tab.4 Analysis of variance of regression equation

續(xù)表4

結(jié)果表明，樣品量對人參花揮發(fā)性成分的總峰面積差異不顯著；溫度、平衡時間、萃取時間對人參花揮發(fā)性成分的總峰面積差異極顯著；二次項溫度、平衡時間、萃取時間對人參花揮發(fā)性成分的總峰面積差異極顯著；二次項樣品量對人參花揮發(fā)性成分的總峰面積差異不顯著；交互項AC、AD、BC、BD對人參花揮發(fā)性成分總峰面積差異不顯著。此模型的決定系數(shù)R2=0.976 9，經(jīng)擬合檢驗得P=0.000 1＜0.01，呈極顯著差異，說明該方程與實際情況擬合度很好，能夠正確反映人參花揮發(fā)性成分總峰面積與樣品量、溫度、平衡時間、萃取時間之間的關(guān)系。經(jīng)失擬檢驗得，P=0.486 1＞0.05，不顯著，說明本試驗無其他因素的顯著影響，模型符合試驗設(shè)計。樣品量、溫度、平衡時間、萃取時間的 F值分別為2.98、196.61、44.51、195.67，所以，各因素對人參花揮發(fā)性成分總峰面積的影響由大到小順序為溫度＞萃取時間＞平衡時間＞樣品量。

3.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測 根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面三維效應(yīng)圖及相應(yīng)等高線圖，結(jié)果可以更為直觀地看出各因素交互作用對人參花揮發(fā)性成分總峰面積的影響。若三維效應(yīng)圖中影響因素所對應(yīng)的曲線坡度越大，則表明該因素對總峰面積的影響越大，相對應(yīng)表現(xiàn)為R值越大，從等高線圖中可以看出，在圓心處為條件最大值。

溫度對人參花揮發(fā)性成分總峰面積的影響比樣品量大（圖6），同理分析得出，各因素對總峰面積的影響為溫度＞萃取時間＞平衡時間＞樣品量，與表4回歸方差分析結(jié)果吻合。對回歸模型進行預(yù)測分析，得出固相微萃取提取人參花揮發(fā)性成分最佳工藝為樣品量0.43g、溫度75.43℃、平衡時間36.98min、萃取時間 43.14min（圖 6～圖11）。溫度、萃取時間、平衡時間曲面坡度陡峭（圖10、圖11）。立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性。利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的SPME萃取人參花揮發(fā)性成分工藝真實性好、可靠性好、重現(xiàn)性好，具有實用性價值。見表5。

圖6 溫度和樣品量對人參花揮發(fā)性成分總峰面積的影響Fig.6 Effect of temperature and sample size on total peak area of volatile components in ginseng flowers

圖7 平衡時間和樣品量對人參花揮發(fā)性成分總峰面積的影響Fig.7 Effect of equilibration time and sample size on total peak area of volatile components of ginseng flowers

圖8 萃取時間和樣品量對人參花揮發(fā)性成分總峰面積的影響Fig.8 Effect of extraction time and sample size on total fraction of volatile components in ginseng flowers

圖9 平衡時間和溫度對人參花揮發(fā)性成分總峰面積的影響Fig.9 Effect of equilibrium time and temperature on total peak area of volatile components of ginseng flowers

圖10 萃取時間和溫度對人參花揮發(fā)性成分總峰面積的影響Fig.10 Effect of extraction time and temperature on total peak area of volatile components in ginseng flowers

圖11 萃取時間和平衡時間對人參花揮發(fā)性成分總峰面積的影響Fig.11 Effect of extraction time and equilibration time on total peak area of volatile components in ginseng flowers

表5 工藝驗證試驗結(jié)果Tab.5 Process verification test results

4 結(jié)語

結(jié)合實際，為了減小實驗誤差與操作難度，最佳工藝條件修正為樣品量0.4g、溫度75℃、平衡時間37min、萃取時間 43min。

響應(yīng)面法作為一種簡便、有效、易于操作的試驗設(shè)計方法，近些年在優(yōu)化中藥提取工藝方面得到逐步應(yīng)用。它不僅可以進行多因素、多水平的研究，還可以進行各因素間的交互作用研究，并進行綜合性的統(tǒng)計與分析，最終得到最優(yōu)化的工藝條件，顯示出較其他設(shè)計方法更多的優(yōu)勢。本實驗采用此法優(yōu)化SPME法萃取人參花揮發(fā)性成分工藝，并建立了人參花揮發(fā)性成分總峰面積與樣品量、溫度、平衡時間和萃取時間關(guān)系的回歸模型，經(jīng)驗證，該模型合理，能較好地預(yù)測人參花揮發(fā)性成分的最大總峰面積，從而得到最優(yōu)的工藝參數(shù)，能有效減少工藝操作的盲目性，為進一步開發(fā)利用人參花揮發(fā)性成分提供了有利的參考，為建立一種便捷、原位、快速分析的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測方法提供借鑒。