人參中人參總皂苷測定方法研究

逄世峰，王佳，鄭培和，許世泉，張浩，崔麗麗，馬瑩，王英平※，梁毅，單巍

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132013；3.康美新開河吉林藥業(yè)有限公司，吉林 集安 134299

人參（Panax ginseng C.A.Mey.）系五加科人參屬多年生草本植物，在中國已有數(shù)千年的藥用歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載：“人參，味甘、微苦，微溫。主補(bǔ)五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目、開心、益智、久服輕身延年”[1]。人參皂苷是人參中的主要活性成分[2，3]，各國藥典均以人參皂苷做為藥材質(zhì)量評價指標(biāo)[4]。目前，人參的質(zhì)量評價大多采用液相色譜法測定人參皂苷的含量，但往往忽略了齊墩果烷型人參皂苷和丙二?；藚⒃碥誟5～7]，這2種類型人參皂苷具有獨(dú)特的藥理活性[8～10]。

本研究通過氨水將丙二?；藚⒃碥辙D(zhuǎn)化為相應(yīng)的中性皂苷，采用超高效液相色譜測定人參中人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 含量，為人參產(chǎn)品質(zhì)量評價及標(biāo)準(zhǔn)制定提供理論參考。

1 試驗(yàn)儀器、試劑與材料

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀Acquity（Waters公司）；乙腈為色譜純（Fisher），水為超純水（Millipore），磷酸為優(yōu)級純，其他試劑均為分析純；人參皂苷Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd（中國藥品生物制品檢定所）。

1.2 材料

人參樣品分為自制樣品和成品，自制樣品為采自黑龍江省和吉林省的不同產(chǎn)地鮮人參自制加工的生曬參，采樣時間為2016年9月20日～2016年10月30日，共收集樣品30份。經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所許世泉副研究員鑒定，全部樣品均為五加科植物人參。成品購自吉林省、上海市、杭州市，參根于50°C烘干至恒重，粉碎，過60目篩，待測。樣品采集信息見表1。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information form

續(xù)表1

續(xù)表1

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

精密稱取人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 標(biāo)準(zhǔn)品 2.96mg、3.54mg、2.18mg、2.34mg、4.34mg、4.46mg、3.49mg、1.66mg、3.86mg，置于 10mL容量瓶中，加甲醇配置成不同濃度的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

取1.0g的樣品粉末，精密稱定，置于50mL具塞磨口三角瓶中，加入25mL氨-水-甲醇溶液（NH3+H2O+CH3OH=4+21+75），密塞，超聲提取 30min（功率500W，頻率40kHz），靜置48h，取上清液，過微孔濾膜，待測。

2.3 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 50mm，流動相：乙腈-0.0005%磷酸水溶液（梯度洗脫：0min～3min，17%～19%乙腈；3min～4min，19%～21%乙腈；4min～4.5min，21%～24% 乙 腈；4.5min～5min，24%～28%乙腈；5min～6.5min，28%乙腈；6.5min～7.5min，28%～30%乙腈；7.5min～9.5min，30%～36%乙腈；9.5min～11min，36%～40%乙腈），流速 0.5mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量

2.4 線性關(guān)系考察與定量限（LOQ）、檢測限（LOD）

將混合對照品溶液分別用甲醇稀釋100倍、5倍、2.5倍、1.25倍、1倍，制成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。各種人參皂苷檢出限（LOD）和定量限（LOQ）由3倍和10倍信噪比計算而來。結(jié)果見表2。

表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Linear equation，correlation coefficient and detection limit

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試人參樣品，精密稱取6份，按供試品溶液的制備方法處理，進(jìn)樣分析，測得人參皂苷Rg1平均含量為0.45%、RSD 0.78%，Re平均含量為0.39%、RSD0.71%，Rf平均含量為 0.11%、RSD1.62%，Ro平均含量為0.41%、RSD 0.4%，Rb1平均含量為1.23%、RSD0.54%，Rc平均含量為 0.56%、RSD0.4%，Rb2平均含量為0.57%、RSD0.48%，Rb3平均含量為0.1%、RSD1.94%，Rd平均含量為0.34%、RSD0.74%，表明重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d 按上述色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 峰面積的RSD分別為1.01%、1.02%、0.71%、1.14%、0.96%、0.48%、1.04%、1.47%、1.11%，表明供試品溶液在7d內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品粉末6份，添加一定量的人參皂苷對照品，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率Tab.3 Recovery of sample (n=6)

2.8 樣品測定

按照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法操作，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定樣品。人參中主要含有Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 9 種人參皂苷，生曬參片中人參皂苷含量較低（樣品32、43、44），生曬參須中人參皂苷含量較高（樣品49、50、51），光支生曬參和全須生曬參主要人參皂苷含量之和在2.11%～6.01%之間。結(jié)果見表4，色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（A）和樣品（B）超高效液相色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of reference substances（A）and sample（B）

表4 人參中9種人參皂苷含量Tab.4 Content of nine ginsenosides in the roots of ginseng

續(xù)表4

3 討論

丙二?；藚⒃碥帐巧鷷駞⒅腥藚⒃碥盏闹饕M成成分，丙二?；藚⒃碥誖b1、Rb2、Rc、Rd的含量約占人參總皂苷的1/3[11]。韓國藥典中采用氫氧化鈉將丙二?；藚⒃碥辙D(zhuǎn)化為相應(yīng)的中性皂苷，后用鹽酸中和樣品溶液[12]。該方法溶液穩(wěn)定性較差，轉(zhuǎn)化后的中性皂苷不穩(wěn)定。本方法采用氨水轉(zhuǎn)化丙二?；藚⒃碥?，溶液穩(wěn)定性良好。

為了明確丙二?；藚⒃碥辙D(zhuǎn)化情況，本研究考察了 12h、24h、36h、48h、60h共 5個時間點(diǎn)，結(jié)果表明，48h后相應(yīng)中性人參皂苷含量不再增加，丙二?；藚⒃碥找艳D(zhuǎn)化完全。因此，提取時間應(yīng)控制在48h以上。

流動相中磷酸的濃度直接影響齊墩果酸型人參皂苷Ro的峰型和分離度，本研究分別將25%磷酸加入500mL水中，考察不同濃度磷酸溶液流動相對色譜分離的影響，結(jié)果表明，乙腈 0.000 5%磷酸水溶液作為流動相時，Ro峰型和色譜分離良好，見圖2。

圖2 不同濃度磷酸UPLC色譜圖Fig.2 UPLC chromatograms of different concentration of phosphoric acid

綜上，人參中主要含有 Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 9 種人參皂苷，且含有大量 M-Rb1、MRb2、M-Rc、M-Rd丙二?；藚⒃碥?，僅以某種或幾種人參皂苷作為評價指標(biāo)會低估人參總皂苷的含量。相比而言，先將丙二酰基人參皂苷轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的中性皂苷，再將各單體皂苷進(jìn)行加和作為人參質(zhì)量評價指標(biāo)更為合理。