儀器法與化學(xué)法測定健康麋鹿血清蛋白結(jié)果比較

李夷平，張樹苗，陳頎，白加德

（北京麋鹿生態(tài)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100076）

麋鹿（Elaphurus davidianus）是原產(chǎn)于中國長江中下游沼澤地帶我國特有的大型鹿科動(dòng)物，現(xiàn)屬于國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，世界自然保護(hù)聯(lián)盟IUCN紅皮書野外滅絕物種，是我國15個(gè)重引進(jìn)成功物種之一，現(xiàn)在我國麋鹿的遷地保護(hù)工作取得了階段性的成功。動(dòng)物血液中血清白蛋白與球蛋白組成一對緩沖對，維持著血漿膠體滲透壓平衡，并在營養(yǎng)、運(yùn)輸?shù)确矫姘l(fā)揮重要作用[1]。因此，研究健康麋鹿的血清蛋白，為正確評估各指標(biāo)在各年齡段對相關(guān)疾病診斷和預(yù)防等諸多方面均具有重要的參考價(jià)值。近年來隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，全自動(dòng)生化分析儀器逐漸替代了之前學(xué)者們使用的手工化學(xué)法（鹽析法、溴甲酚綠法、溴甲酚紫法、雙縮脲法等）測定，使各項(xiàng)試驗(yàn)條件得到控制，測定結(jié)果更為客觀。本試驗(yàn)用全自動(dòng)生化分析儀（以下簡稱儀器法）與手工化學(xué)法（溴甲酚綠法及雙縮脲法）（以下簡稱化學(xué)法）對麋鹿血清同步做血清蛋白測定，探索2種方法間得出的結(jié)果是否存在差異顯著及是否具有良好的相關(guān)性。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源于北京南海子麋鹿苑，按張樹苗等[2]（以下簡稱報(bào)道）文章中麋鹿年齡的劃分方法將試驗(yàn)麋鹿分為幼年組、青年組、成年組和老年組。其中，幼年組20只，青年組28只，成年16只，老年16，每組雌、雄各半。

麻醉槍對80只健康麋鹿注射藥物陸眠靈進(jìn)行麻醉保定，在麋鹿完全進(jìn)入麻醉狀態(tài)下，分別采集頸部靜脈血10mL，3 000r/min離心15min，取分離后的血清加入防腐劑，分裝后置于4℃冰箱中保存，備用。

1.2 試劑

溴甲酚綠試劑、雙縮脲試劑、0.85%氯化鈉溶液均按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[3]配制。

1.3 儀器

全自動(dòng)生化分析儀（TBA40，日本東芝集團(tuán)）；尤尼柯UV-2102PC型紫外分光光度計(jì)（上海儀器有限公司）。

2 檢測方法

2.1 化學(xué)法測定

2.1.1 溴甲酚綠法測定血清白蛋白 取試管2支，1支加血清0.2mL，另1支加0.85%氯化鈉溶液0.2mL作試劑空白管，2管各加溴甲酚綠試劑5mL。蒸餾水作為空白對照，以綠色濾光板進(jìn)行比色，以空白管校正光密度到0點(diǎn)，讀取各管光密度讀數(shù)。

2.1.2 雙縮脲法測定血清總蛋白 取血清0.1mL，加入0.85%氯化鈉溶液2.4mL，混勻取1mL加入雙縮脲試劑4mL，混勻放置20min，以綠色濾光板，用雙縮脲試劑作空白比色，由總蛋白標(biāo)準(zhǔn)線上查得其結(jié)果。

2.1.3 計(jì)算 血清總蛋白=總蛋白測定管光密度/標(biāo)準(zhǔn)管光密度 標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白濃度；血清白蛋白=白蛋白測定管光密度/標(biāo)準(zhǔn)管光密度 標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白濃度；血清球蛋白=血清總蛋白-血清白蛋白；血清白蛋白/球蛋白比值（A/G）=血清白蛋白/血清球蛋白。

2.2 儀器法測定

2.2.1 麋鹿血清總蛋白檢測 比色杯中加入總蛋白試劑，推入后監(jiān)測540nm下吸光度A0；標(biāo)準(zhǔn)液檢測吸光度為AS。以吸光度A為縱坐標(biāo)、濃度C為橫坐標(biāo)，將A0和AS2點(diǎn)在坐標(biāo)圖上連成線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將樣品血清如標(biāo)準(zhǔn)液一樣操作流程，檢測出的吸光度為A，將這個(gè)A在標(biāo)準(zhǔn)曲線上尋找其對應(yīng)的濃度即血清總蛋白濃度。

2.2.2 麋鹿血清白蛋白檢測 在比色杯中加入白蛋白試劑，推入后監(jiān)測540nm下吸光度A01；標(biāo)準(zhǔn)液檢測吸光度為AS1。以吸光度A1為縱坐標(biāo)、濃度C1為橫坐標(biāo)，將A01和AS12點(diǎn)在坐標(biāo)圖上連成線，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。再將樣品血清與標(biāo)準(zhǔn)液操作流程一致，檢測出的吸光度為A1，將這個(gè)A1在標(biāo)準(zhǔn)曲線上尋找其對應(yīng)的濃度，即血清白蛋白濃度。

2.3 數(shù)據(jù)處理方法

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將儀器法與化學(xué)法測得的幼年、青年、成年及老年4個(gè)年齡段的個(gè)體以及每個(gè)年齡段雌雄個(gè)體的總蛋白、球蛋白及白蛋白數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及相關(guān)雙變量Person雙側(cè)檢驗(yàn)，以檢測2種方法間的差異性及相關(guān)性。

3 結(jié)果

3.1 麋鹿血清蛋白濃度及白球比值比較

檢測結(jié)果表明，幼年血清總蛋白濃度存在顯著差異（P＜ 0.05），具有良好的相關(guān)性（r＞ 0.80）；幼年血清白蛋白、球蛋白及白球比2種方法測得結(jié)果均差異不顯著（P＞ 0.05），具有良好的相關(guān)性（r＞ 0.80）；青年、成年及老年血清總蛋白、白蛋白、球蛋白及白球比2種方法測得結(jié)果差異不顯著（P＞0.05），均具有良好的相關(guān)性（r＞ 0.80）。見表1、圖1～圖 4。

表1 儀器法及化學(xué)法檢測健康麋鹿血清蛋白及相關(guān)與差異比較Table 1 Comparison of instrumental and chemical methods for detectingserum albumin in healthy elk(，g/L)

表1 儀器法及化學(xué)法檢測健康麋鹿血清蛋白及相關(guān)與差異比較Table 1 Comparison of instrumental and chemical methods for detectingserum albumin in healthy elk(，g/L)

組別 數(shù)量 儀器法 化學(xué)法r值t值t檢驗(yàn) p值GroupNInstrumentalmethodChemicalmethodr-valuet-valuep-value of t-test總蛋白 雌性 Female10 52.026 4±4.371 6 55.383 5±3.673 6 0.840 2.240 0.038 Totalprotein雄性 Male10 52.594 5±3.867 8 57.073 1±3.902 8 0.909 2.697 0.015白蛋白 雌性 Female10 35.452 5±2.485 3 37.247 1±3.064 7 0.914 1.999 0.061幼年Albumin雄性 Male10 35.913 7±3.530 8 38.383 5±2.662 5 0.869 1.987 0.062 Juvenile10 group球蛋白 雌性 Female16.573 9±3.812 6 18.109 4±3.052 3 0.862 1.053 0.306 Globulin雄性 Male10 16.680 8±2.947 5 18.689 2±2.471 6 0.899 1.518 0.146白球比 雌性 Female10 2.198 7±0.327 2 2.121 6±0.518 7 0.925 0.606 0.552 Albumin/globulin雄性 Male10 2.212 7±0.434 9 2.156 6±0.405 7 0.871 0.506 0.619總蛋白 雌性 Female14 61.747 1±2.981 7 60.191 3±2.242 5 0.887 1.917 0.071 Total protein雄性 Male14 62.936 2±2.057 3 62.081 7±2.280 3 0.866 1.166 0.254白蛋白 雌性 Female14 40.173 9±2.594 2 39.818 1±2.145 1 0.860 0.648 0.523青年Albumin雄性 Male14 41.041 7±2.586 1 40.947 2±2.177 4 0.857 1.223 0.232 Young14 group球蛋白 雌性 Female21.573 2±2.732 4 20.373 2±2.456 2 0.873 1.786 0.096 Globulin雄性 Male14 21.894 5±2.263 7 21.134 5±2.869 7 0.934 1.286 0.210白球比 雌性 Female14 1.912 0±0.367 7 1.969 1±0.373 3 0.909 0.977 0.337 Albumin/globulin雄性 Male14 1.951 1±0.306 8 1.970 7±0.331 9 0.925 0.268 0.791總蛋白 雌性 Female8 61.861 2±2.879 1 61.859 0±2.695 5 0.868 0.003 0.998 Totalprotein雄性 Male8 63.248 4±2.021 5 62.856 2±2.834 6 0.914 0.375 0.713白蛋白 雌性 Female8 40.267 1±2.315 6 40.667 9±2.024 0 0.910 0.880 0.394成年Albumin雄性 Male8 41.452 9±1.965 7 41.102 1±2.017 4 0.883 0.625 0.542 Adult8 group球蛋白 雌性 Female21.594 1±2.427 6 21.189 3±2.891 3 0.911 0.353 0.729 Globulin雄性 Male8 21.795 5±1.758 9 21.754 1±1.807 9 0.897 0.073 0.943白球比 雌性 Female8 1.925 4±0.385 1 1.919 6±0.384 7 0.863 0.046 0.964 Albumin/globulin雄性 Male8 1.976 3±0.151 3 1.933 7±0.209 7 0.917 1.297 0.216總蛋白 雌性 Female8 57.262 7±2.712 5 58.072 8±2.437 8 0.910 1.165 0.263 Totalprotein雄性 Male8 58.134 8±2.682 1 59.823 6±1.603 7 0.914 3.064 0.080白蛋白 雌性 Female8 37.125 7±2.682 1 36.925 7±2.986 3 0.924 0.173 0.865老年Albumin雄性 Male8 37.876 0±2.568 4 38.535 3±1.375 4 0.880 1.714 0.108 Elderly8 group球蛋白 雌性 Female20.137 0±2.859 6 21.147 1±2.546 2 0.884 1.221 0.242 Globulin雄性 Male8 20.168 8±2.253 5 21.288 3±2.482 5 0.892 1.519 0.141白球比 雌性 Female8 1.892 2±0.381 1 1.817 2±0.285 5 0.921 0.938 0.364 Albumin/globulin雄性 Male8 1.913 8±0.198 5 1.905 3±0.206 1 0.875 0.201 0.844

圖1 各年齡階段總蛋白濃度Fig.1 Total protein concentrationat various ages

圖2 各年齡階段白蛋白濃度Fig.2 Albumin concentrationat various ages

圖3 各年齡階段球蛋白濃度Fig.3 Concentration of globulinat various ages

圖4 各年齡階段白球比值Fig.4 Albumin/globulinat various ages

3.2 本研究結(jié)果與報(bào)道結(jié)果對比

2種方法測定的各年齡段各血清蛋白數(shù)據(jù)的變化趨勢基本一致（圖5～圖8.），與報(bào)道中采用全自動(dòng)生化分析儀測定血清中總蛋白、白蛋白和球蛋白的研究結(jié)果、趨勢也近乎一致（表2）。

麋鹿在幼年階段血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量最低，隨著年齡增長，當(dāng)麋鹿在青年期和成年期時(shí)，其血液中的血清白蛋白、球蛋白和總蛋白含量達(dá)到最大值，2個(gè)階段之間蛋白含量相近（P＞0.05），但顯著高于幼年和老年階段，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著年齡進(jìn)一步增長，麋鹿進(jìn)入老年期，蛋白含量顯著下降[3]。

在健康麋鹿的各個(gè)年齡階段，雄性血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量的平均值均高于雌性個(gè)體，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 報(bào)道與本次檢測結(jié)果比較Table 2 Comparison of previous reports date with the date of this test

圖5 各年齡階段總蛋白變化趨勢Fig.5Trends in total protein at various ages

圖6 各年齡階段白蛋白變化趨勢Fig.6 Trends in albumin at various ages

圖7 各年齡階段球蛋白變化趨勢Fig.7 Trends in globulin at various ages

圖8 各年齡階段白球比值變化趨勢Figure 8Trends in albumin/globulinat various ages

4 討論

4.1 本次研究與報(bào)道的一致性

通過對80份健康麋鹿血清使用儀器法測定血清蛋白與化學(xué)法檢測血清蛋白，進(jìn)一步驗(yàn)證了張樹苗等[3]的結(jié)論：年齡與總蛋白、球蛋白和白/球比的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），青年及成年階段血清總蛋白、白蛋白及球蛋白間不存在顯著差異（P＞0.05），但顯著高于幼年及老年血清總蛋白、白蛋白及球蛋白（P＜0.05）；性別與三者相關(guān)性較小，說明同一年齡段雌、雄個(gè)體間的蛋白含量相近，各年齡階段雄性血清總蛋白、白蛋白和球蛋白均高于雌性，但差異不顯著（P＞0.05）。究其原因，張樹苗等[3]報(bào)道中也有過論述。白蛋白水平的高低能夠反映麋鹿的營養(yǎng)狀況，麋鹿在幼年階段由于消化和吸收功能尚未完善，營養(yǎng)狀態(tài)較差；隨著年齡增長，進(jìn)入青年和成年期后，營養(yǎng)狀態(tài)最好；而后隨著年齡的衰老，其牙齒及各消化器官功能退化，攝入營養(yǎng)的能力下降；球蛋白水平的高低反映機(jī)體的免疫能力，表中數(shù)據(jù)說明麋鹿在青年和成年期的免疫力最好，幼年麋鹿由于免疫功能尚未發(fā)育完全，免疫能力較低，而老年麋鹿的衰老也導(dǎo)致免疫功能下降；雄性個(gè)體的蛋白水平普遍高于雌性個(gè)體，這可能與雄性麋鹿的攝食量大和雄激素促進(jìn)蛋白合成有關(guān)[3]。

4.2 2種方法檢測結(jié)果的一致性及化學(xué)方法的有效性

儀器法測定血清蛋白與化學(xué)法檢測血清蛋白，2種方法間除幼年總蛋白測得數(shù)據(jù)存在顯著差異之外，（2種方法間幼年總蛋白存在差異的原因可能與個(gè)體間差異有關(guān)，某些幼年個(gè)體血清蛋白濃度偏高，某些偏低，標(biāo)準(zhǔn)差相較其他組大。再者，化學(xué)法受限于人工操作，難免會(huì)存在操作誤差），其余各年齡階段各蛋白成分測得數(shù)據(jù)均不存在顯著差異（P＞0.05）；且2種方法間具有良好的相關(guān)性（r＞0.80），能科學(xué)客觀地體現(xiàn)各年齡階段的血清蛋白各成分的變化趨勢。

4.3 實(shí)際應(yīng)用中2種方法應(yīng)注意事項(xiàng)

4.3.1 實(shí)驗(yàn)操作中儀器、試劑、樣本來源以及實(shí)驗(yàn)操作技能的差異等因素均有可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)血清中蛋白成分相對正常時(shí)候，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作，把握好反應(yīng)時(shí)間，2種方法檢測血清白蛋白濃度結(jié)果相一致或接近。因此，實(shí)際操作中，不同方法應(yīng)根據(jù)方法采用相應(yīng)參考值。

4.3.2 溴甲酚綠反應(yīng)時(shí)間長短對讀數(shù)也有影響[4]，同時(shí)溴甲酚綠染料濃度的增加可導(dǎo)致結(jié)果評價(jià)光密度值相應(yīng)增大，影響檢測結(jié)果[5]。這是由于溴甲酚綠能與非血清白蛋白類蛋白質(zhì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合反應(yīng)，使得其檢測特異性一直以來不是很理想?；瘜W(xué)法測定蛋白存在的非特異性反應(yīng)一直是生化檢驗(yàn)的難點(diǎn)，縮短反應(yīng)時(shí)間固然可減少非特異性反應(yīng)，但反應(yīng)時(shí)間過短亦可使反應(yīng)不充分[3]。雙縮脲法對各種蛋白質(zhì)呈色基本相同，雖然靈敏度不高，但對血清總蛋白定量是較為適合的方法[6]。

4.3.3 全自動(dòng)生化分析儀器測定法是依據(jù)物理性分離蛋白，測得的各組分較真實(shí)地反應(yīng)了白蛋白和球蛋白的含量，其中白蛋白較接近真值[7]，使測定結(jié)果更具客觀性，具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，但如果不能及時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)液校正，結(jié)果有可能造成同一傾向的偏高或偏低，造成較大的系統(tǒng)誤差，所以每次測定前要進(jìn)行校正，以確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[8]。

5 結(jié)論

麋鹿在幼年時(shí)期的血清白蛋白和球蛋白含量相對較低，進(jìn)入青年期后血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量都達(dá)到最大值，老年期后，血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量逐漸下降；雌性個(gè)體與雄性個(gè)體比較，雄性個(gè)體的血清蛋白含量略高于雌性個(gè)體。