哺乳動物卵泡發(fā)育調(diào)控分子機制研究進展

曹俊國，陳敏，李文，李丹麗，常彤，魏海軍，許保增

（中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟動物分子生物學重點實驗室，長春 130112）

哺乳動物的繁殖需要雄性和雌性共同參與完成，進而將二者基因中優(yōu)秀的部分傳遞給下一代，完成物種的繁衍。在這一過程中，哺乳動物還承擔著生育后代的功能，在生殖過程中扮演著重要的角色。哺乳動物的生殖進程主要包括卵泡的生長發(fā)育、卵母細胞的成熟及排出，即雌性配子的形成、精卵融合、胚胎的形成和著床以及妊娠的維持等[1]。卵泡的生長發(fā)育對于繁殖力的高低具有重要意義，因為它可以影響排卵數(shù)及后續(xù)相關(guān)的進程。因此，深入了解哺乳動物卵泡發(fā)育的分子機制和相關(guān)信號通路的調(diào)控作用對于解決哺乳動物生殖不孕以及找出最佳的治療方法具有重要的意義。

1 哺乳動物卵泡的發(fā)育

哺乳動物的卵泡發(fā)育過程主要包含原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡和成熟卵泡幾個時期。原始卵泡是由一層扁平單層狀的顆粒細胞和其所包圍的未成熟的卵母細胞組成。隨著原始卵泡生長啟動后，卵母細胞周圍的顆粒細胞由扁平單層狀變成柱狀，卵母細胞基因組被激活并進行轉(zhuǎn)錄，形成初級卵泡。當卵泡繼續(xù)發(fā)育進入到次級卵泡階段，卵泡中的顆粒細胞由單層變成多層，次級卵泡進一步發(fā)育變成三級卵泡，此時期主要變化是卵泡腔形成且卵泡腔內(nèi)有卵泡液。最后卵泡發(fā)育到成熟期卵泡，該時期分為選擇卵泡時期和成熟卵泡時期兩個階段。卵泡從生長到成熟期主要經(jīng)歷了募集、選擇、優(yōu)勢化和閉鎖幾個重要環(huán)節(jié)。進入募集階段的卵泡中會有一個卵泡定向發(fā)育成優(yōu)勢卵泡，同時還擁有排卵能力，這一過程被稱為優(yōu)勢卵泡的選擇。優(yōu)勢卵泡繼續(xù)生長發(fā)育，其余卵泡則自行退化，發(fā)生閉鎖。

在哺乳動物卵泡發(fā)育的各個時期，不僅在形狀大小和功能上發(fā)生改變，而且也會受到一些與之相關(guān)的分子及信號通路的調(diào)控，包括雌激素（E）、卵泡刺激素（FSH）及黃體生成素（LH）等激素以及表皮生長因子（EGF）、神經(jīng)生長因子（NGF）等相關(guān)細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠卵泡內(nèi)顆粒細胞發(fā)生過早黃素化與卵泡內(nèi)的LH水平較高相關(guān)，結(jié)果導致卵母細胞減數(shù)分裂提早發(fā)生，進而使信號轉(zhuǎn)導發(fā)生變化，最終引發(fā)卵泡閉鎖[2]。在大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，EGF可以促進顆粒細胞的增殖[3]。同時，激活素/抑制素作用通路、BMP/Smad信號通路、NPPC/NPR2信號通路、Nodal信號通路及FGF信號通路等也發(fā)揮著積極的作用。目前，人們對于相關(guān)的研究尚有欠缺，特別是信號通路中受體和細胞內(nèi)信號分子等關(guān)鍵因子在哺乳動物卵泡發(fā)育不同時期顆粒細胞中的定量表達情況尚未明確，有待更進一步地深入研究。本文主要從激活素/抑制素作用通路、BMP/Smad信號通路以及NPPC/NPR2信號通路3種信號通路進行相關(guān)闡述。

2 卵泡發(fā)育調(diào)控的分子機制

2.1 激活素/抑制素信號通路

激活素（Activin）作為轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factor s，TGF-s）超家族的成員，是一種主要由顆粒細胞分泌的細胞間信號分子，同時也是垂體分泌FSH的激動劑。激活素由編碼的亞單位基因翻譯而來[4]，在結(jié)構(gòu)上，激活素是同源異構(gòu)二聚體的半胱氨酸結(jié)合蛋白，共享1個 亞單位。激活素類型主要包括激活素A、激活素B和激活素AB 3種。從結(jié)構(gòu)上講，激活素A和B是由二硫鍵相連的二聚體，由2個 亞單位構(gòu)成，分別為 A和 B；而激活素 AB是 A-B異質(zhì)二聚體。激活素蛋白作為一種生長因子，參與哺乳動物卵巢內(nèi)多種生物學功能的改變，包括生殖細胞的生存和原始卵泡的募集、促進顆粒細胞增殖及卵泡刺激素受體（FSHR）的表達、延遲卵泡黃體化和閉鎖及參與黃體溶解等[5～7]。

激活素在發(fā)揮作用時必須要有其靶細胞表面的特異性受體（Act R）的參與，與其形成三元受體復合物。激活素的受體類型主要有I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶2種。當信號開始轉(zhuǎn)導時，激活素與II型受體結(jié)合，開始磷酸化進程，之后激活I型受體，下游的信號分子（R-Smads）磷酸化，受體Smad會與磷酸化的R-Smads結(jié)合發(fā)生位置轉(zhuǎn)移，進入到細胞核內(nèi)與特異性受體結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控作用（圖1）。

干細胞因子（Stem cell factor，SCF，也稱為Kit配體，KL）由卵巢顆粒細胞分泌，并通過卵母細胞表面受體c-Kit與卵母細胞發(fā)揮作用[8]。SCF及c-Kit作為顆粒細胞和卵母細胞發(fā)生作用的紐帶有重要的作用[9]。激活素可以通過SCF及c-Kit的紐帶作用，間接促進卵母細胞發(fā)育。研究證明，大鼠卵巢內(nèi)的激活素 A通過 smad2/ERK5/nur77信號通路促進顆粒細胞的增殖并提高其活性，使SCF分泌增多，然后與c-Kit發(fā)生特異性的結(jié)合，結(jié)合后的SCF/c-Kit在大鼠卵巢內(nèi)的表達水平提高，從而促進卵母細胞的發(fā)育[10]。

同樣作為TGF-超家族成員之一的抑制素（Inhibin）是性腺分泌的一類大分子糖蛋白質(zhì)激素，其結(jié)構(gòu)與激活素相似，只不過它是一種異二聚體結(jié)構(gòu)，沒有共享1個 亞單位，而是分別亞基和 亞基2種亞單位通過二硫鍵相連。抑制素的生理作用主要是與激活素一起調(diào)控垂體FSH的合成和分泌。許多研究表明，抑制素通過內(nèi)分泌作用調(diào)節(jié)雌激素的分泌，進而調(diào)控垂體FSH的分泌[11，12]。該二硫鍵發(fā)揮著非常重要的作用，單獨存在亞單位和 亞單位是沒有生物活性的[13]。 亞單位有兩種類型，即 A和 B，它們結(jié)構(gòu)上類似，但性質(zhì)上有些差異，所以，抑制素有抑制素A（基和B亞基組成）兩種存在形式[14]。對于抑制素A，在卵基和 A亞基組成）和抑制素B（泡發(fā)育的不同階段均發(fā)揮作用，但在優(yōu)勢卵泡發(fā)育階段和黃體形成階段表達較高。在優(yōu)勢卵泡發(fā)育階段，抑制素A的濃度增加，加大了優(yōu)勢卵泡對FSH的敏感性，防止優(yōu)勢卵泡發(fā)生閉鎖；在黃體形成階段，抑制素A的主要作用是促進卵泡黃體化，抑制素B主要在中、小竇卵泡中表達，并在早期卵泡發(fā)育階段發(fā)揮重要作用。抑制素B可以強化FSH抑制非優(yōu)勢卵泡進入排卵前期，有利于優(yōu)勢卵泡篩選[15]，此外，低濃度的抑制素B與生殖機能老化也有關(guān)，如卵泡發(fā)育異常及卵泡囊腫等。研究發(fā)現(xiàn)，多囊卵巢綜合癥患者卵泡液中抑制素B水平顯著下降[16]。因此，抑制素的作用對于調(diào)節(jié)顆粒細胞的生長、發(fā)育以及調(diào)控卵母細胞的成熟方式等，最終調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育發(fā)揮著重要的作用[17]。

抑制素它在阻礙激活素的作用通路方面效果顯著，抑制素通過 亞基競爭性與激活素II型受體結(jié)合，導致激活素I型受體磷酸化受阻，進而R-Smads激活也被阻斷，起到一種拮抗的效果。Tgfbr3是TGF-超家族的受體，也被稱作是Betaglycan，現(xiàn)在被認為是抑制素的共受體[18]，它與抑制素結(jié)合能增強抑制素與激活素II型受體結(jié)合，從而增強抑制素阻斷激活素作用通路[19]。

圖1 激活素/抑制素作用信號通路[20]Figure1 Activins and inhibins and their mechanism of signaling pathway

2.2 BMP/Smad信號通路

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein，Bmps）是一種與骨及神經(jīng)組織等形成有關(guān)的蛋白，它可以誘導未分化的間充質(zhì)定向分化成骨細胞，骨細胞進一步分化成鈣化骨組織[21]。Bmps是TGF-超家族中一個重要成員，對于哺乳動物骨骼形成及發(fā)育等有重要的作用。合成Bmps過程中，首先合成的是前體，前體蛋白主要包括N端引導序列（也稱為信號肽）、C端成熟區(qū)以及中間區(qū)域（也稱為前肽）3個區(qū)域。其中，C端成熟區(qū)參與多肽鏈內(nèi)部與肽鏈間二硫鍵的形成，由其所含的保守半胱氨酸執(zhí)行，并將2個多肽鏈合成未成熟的二聚體結(jié)構(gòu)，然后在蛋白水解酶的作用下形成具有活性的成熟二聚體，再與對應的受體結(jié)合來發(fā)揮作用[22]。

哺乳動物的Bmps受體是一種膜蛋白受體，其分子結(jié)構(gòu)主要有細胞外區(qū)、內(nèi)區(qū)以及中間部分的跨膜區(qū)等幾個部分。目前，我們所知道的主要有2種，分別為 I型和 II型受體。其中，I型受體主要包括 I A（BMPR-A 或ALK-3）和 I B（BMPR-IB或ALK-6）2個亞型；II型受體有5種，分別是BMPR-II、ActR-IIA、ActR-IIB、AMHR-II和 T13R-II[23]。Bmp信號通路就是通過配體與這2種受體結(jié)合形成異源復合物，進而發(fā)揮其生物學功能[24]。

Bmps家族的信號轉(zhuǎn)導主要分為2種途徑，分別為Smads依賴型通路和磷脂酰肌醇3激酶（Phosphoinositide protein kinase PI3K）等非Smads依賴型通路。對于Smads家族，最初是從果蠅和線蟲的相關(guān)蛋白中提取得到的，Smads家族的每個成員在信號轉(zhuǎn)導通路中行使的功能會有所不同，大概可分為3種類型：受體調(diào)節(jié)型 Smads，包括 Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8和Smad9；共同介導型Smads，包括Smad4；抑制型Smads，包括Smad6、Smad7，且它們主要起拮抗因子的作用[25]。哺乳動物卵泡的生長發(fā)育調(diào)控機制主要受到上述Smads依賴性通路的調(diào)控，即Bmps/Smads信號通路。

Bmps家族成員及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導對于哺乳動物卵泡的生長、顆粒細胞生長分化以及卵母細胞成熟、排卵等有重要的調(diào)控作用。對于 Bmps/Smads信號通路，其信號轉(zhuǎn)導模式為Bmps與細胞膜上的BMPR-II受體結(jié)合，進而使其發(fā)生磷酸化過程，磷酸化的BMPR-II受體與 BMP-I型受體結(jié)合形成復合物，BMP-I型受體被相應的蛋白激酶激活發(fā)生磷酸化過程，然后激活Smads信號分子，被激活的R-Smads（主要有 Smadl、Smad5、Smad8）結(jié)合共用型的 CoSmad4共同形成Smad蛋白復合物，進入到細胞核與特異的DNA序列結(jié)合，啟動下游靶基因的啟動子，使下游基因開始進行轉(zhuǎn)錄[26～28]，下游信號分子 R-Smads在BMP/Smad信號通路中也占有重要地位。敲除Smad4后的小鼠，類固醇類激素調(diào)節(jié)被阻斷，血漿孕酮水平上升，顆粒細胞發(fā)生早熟性黃體化，最終導致卵巢功能早衰[29]。所以，進一步認識BMP/Smad信號通路的調(diào)控機理對于解決哺乳動物卵泡發(fā)育機制及生殖不孕等關(guān)鍵問題具有深遠意義。

2.3 NPPC/NPR2信號通路

鈉尿肽家族廣泛存在于動物大腦、心臟等各類組織和器官中，具有維持血壓及血容量的穩(wěn)定、促進脂肪代謝和軟骨生長等多個功能[30]。該家族在哺乳動物中主要由3種配體和3種特異性受體組成。配體以前體肽形式存在，分別是心房鈉尿肽（Atrial natriuretic peptide，ANP，又稱為NPPA）、腦鈉尿肽（Brain natriuretic peptide，BNP，又稱為NPPB）、C-型鈉肽（C-type natriuretic peptide，CNP，又稱為 NPPC）；特異性受體以二聚體形式存在，分別是鈉尿肽受體A（Natriuretic peptide receptor A，NPRA，又稱為 NPR1）、鈉尿肽受體 B（Natriuretic peptide receptor B，NPRB，又稱為 NPR2）、鈉尿肽受體 C（Natriuretic peptide receptor C，NPRC，又稱為 NPR3）[31]。NPPA 和 NPPB 在哺乳動物心臟內(nèi)合成，主要是通過與血液中的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)拮抗來達到保持體內(nèi)電解質(zhì)的平衡，進而使心血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[32]；NPPC是一種有生物活性的小分子多肽，由22個氨基酸構(gòu)成，所編碼的基因具有高度的保守性，在哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂方面具有重要作用，它與NPR2有較好的親和性，可以與其特異性結(jié)合而發(fā)揮作用。3種鈉尿肽受體在哺乳動物中均有1個細胞外配體結(jié)合域和1個單跨膜結(jié)構(gòu)，其中，NPR1和NPR2同為鳥苷酸環(huán)化酶偶聯(lián)受體，催化GTP生成細胞內(nèi)第二信使，進而介導利鈉肽發(fā)揮作用；NPR3為鈉肽清除受體，與利鈉肽的清除有關(guān)[33]。

NPPC/NPR2信號通路在抑制哺乳動物卵母細胞過早成熟方面發(fā)揮著巨大的作用。卵泡壁層顆粒細胞產(chǎn)生的 NPPC與 NPR2結(jié)合刺激產(chǎn)生了 cGMP，cGMP通過卵母細胞和顆粒細胞的間隙鏈接進入到卵母細胞中[34]，使磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE3A）的活性被抑制，cAMP的水解程度也隨之下降，從而穩(wěn)定在一個較高的水平，cAMP依賴的蛋白激酶PKA通過磷酸酶細胞周期蛋白（Phosphatase cell division cycle 25，CDC25）、weel激酶和髓磷脂轉(zhuǎn)錄因子Myt1，調(diào)節(jié)促成熟因子（Maturation-promoting factor，MPF）的活性，CDC25脫磷酸化周期蛋白依賴性激酶 1（Cyclin-dependent kinase 1，CDK1），weel和Myt1磷酸化CDK1，磷酸化的CDK1以及相關(guān)復合體失活，最終抑制了卵母細胞的成熟（圖2）。

圖2 NPPC及NPR2抑制卵母細胞成熟的分子機制[35]Figure 2 Mechanism of NPPC and NPR2 in the maintenance of oocyte meiotic arrest

3 展望

如今，哺乳動物卵泡發(fā)育分子機制的相關(guān)研究已取得了巨大的成果。目前，已經(jīng)證明了許多信號通路在卵泡生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用，并且其中一些信號通路的研究已經(jīng)非常透徹。但是，還有一些信號通路的研究，如哺乳動物是如何啟動原始卵泡發(fā)育以及在信號轉(zhuǎn)導途徑中又有哪些下游靶基因進行了參與等相關(guān)的問題仍未解決。因此，深入了解哺乳動物卵泡發(fā)育分子機制的調(diào)控仍然需要對卵泡發(fā)育相關(guān)生物學及有關(guān)基因表達繼續(xù)研究，這對于治療哺乳動物生殖不孕等疾病有重要意義。