MicroRNA調(diào)控卵巢顆粒細胞功能的研究進展

何曉，沈豪飛，姚瑩，張學(xué)紅

卵巢顆粒細胞在卵泡形成竇腔時，分化為卵丘細胞(cumulus cells,CC)和壁層顆粒細胞(mural granulosa cells,MGC)。CC突起的尖端穿過透明帶，終止于卵母細胞膜,從而形成卵丘-卵母細胞復(fù)合體。CC通過縫隙連接與卵母細胞進行雙向信息傳遞，進而有助于卵母細胞的成熟、受精與早期胚胎發(fā)育[1]。MGC表面存在多種受體，并且能夠分泌多種激素和細胞因子，以自分泌和旁分泌的方式調(diào)節(jié)卵泡生長發(fā)育和成熟[2]。研究表明，在卵母顆粒細胞復(fù)合物中加入顆粒細胞可改善卵母細胞的代謝，有助于其在體外生長[3]。還有其他實驗支持顆粒細胞質(zhì)量的下降和凋亡的增多會影響卵母細胞質(zhì)量以及受精率和妊娠率[4]。由此可見，對顆粒細胞功能的研究很必要。MicroRNA(miRNA)是一類高度保守的小型非編碼RNA，大小一般為18～24個核苷酸，通過互補結(jié)合其靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)，從而參與轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡、腫瘤形成等生物學(xué)過程。目前在生殖領(lǐng)域中，對其研究主要集中在以下三個方面：① miRNA調(diào)節(jié)卵母細胞發(fā)育和成熟的方式[5]。② miRNA在卵母細胞和顆粒細胞雙向通信過程中的作用[1]。③ miRNA在子宮內(nèi)膜異位癥等生殖疾病中的作用[6]。在查閱大量文獻后發(fā)現(xiàn)，之前研究大多停留在miRNA在卵巢顆粒細胞不同階段中的差異性表達，以及對細胞功能的影響，但具體調(diào)控機制和下游因子改變的認識較淺，因此本文就近年來miRNA在顆粒細胞凋亡、增殖和類固醇激素合成中的作用和調(diào)控機制予以綜述。

1 miRNA對顆粒細胞凋亡的調(diào)控

凋亡是一種程序性的細胞死亡，半胱天冬酶(caspase)又稱凋亡蛋白酶，凋亡相關(guān)因子通過caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)DNA片段化，導(dǎo)致細胞凋亡。顆粒細胞凋亡是卵泡閉鎖的主要原因之一，而閉鎖是卵泡生長發(fā)育和維持的重要環(huán)節(jié)。卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)指40歲之前因卵巢功能衰竭所致的閉經(jīng)，伴隨血促性腺激素過多和雌激素過少，顆粒細胞凋亡在POF發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，通過研究卵巢顆粒細胞凋亡的調(diào)控機制可對POF的診療提供幫助。

1.1 促進顆粒細胞凋亡的miRNA

Zhou等[7]發(fā)現(xiàn)miR-150促進綿羊卵巢顆粒細胞的凋亡，在體外過表達miR-150增加促凋亡因子Bax和caspase3的表達，減少類固醇生成性急性調(diào)節(jié)蛋白的表達，與黃體期顆粒細胞相比miR-150在卵泡期顆粒細胞中的表達增加，這與黃體期顆粒細胞凋亡增多引起卵泡閉鎖相吻合。此現(xiàn)象引導(dǎo)研究者們繼續(xù)探索miRNA對顆粒細胞凋亡的影響。過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha,PPARGC1A)是線粒體合成的關(guān)鍵因子，其可通過多種途徑減輕氧自由基損傷、抑制炎癥反應(yīng)、抑制凋亡。過氧化氫處理后的山羊顆粒細胞凋亡，miR-1197-3p表達顯著上升而PPARGC1A表達顯著下降，miR-1197-3p抑制劑可減輕過氧化氫對細胞的凋亡并增加PPARGC1A的表達。miR-1197-3p可能通過線粒體依賴性細胞凋亡途徑靶向PPARGC1A調(diào)控細胞凋亡[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-31和miR-143通過抑制卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)受體的miRNA和蛋白質(zhì)表達促進牛顆粒細胞的凋亡，此外過表達miR-31減少孕酮的合成，過表達miR-143同時減少孕酮和雌激素的合成，miR-31和miR-143的抑制劑對激素水平起反作用[9]。在基因轉(zhuǎn)錄過程中轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮重要的調(diào)控作用，類固醇生成因子1(steroidogenic factor 1,SF1)通過結(jié)合編碼miR-202-5p基因附近啟動子區(qū)域，激活轉(zhuǎn)化生長因子βII型受體(transforming growth factor receptor 2,TGFβR2)，在mRNA和蛋白質(zhì)水平上降解TGFβR2減弱TGFβ/Smad信號通路傳導(dǎo)，從而誘導(dǎo)山羊顆粒細胞凋亡并抑制細胞增殖[10]。卵泡閉鎖是卵泡發(fā)育、成熟和正常排卵中重要的生理過程，卵泡閉鎖的加快導(dǎo)致POF患者異常排卵或不排卵，在收集臨床標本后，Chen等[11]發(fā)現(xiàn)miR146a在POF患者血漿和卵巢顆粒細胞表達顯著高于正常女性，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR146a同時靶向白介素1受體相關(guān)激酶和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6促進顆粒細胞凋亡，此外，caspase抑制劑可減弱miR146a對卵巢顆粒細胞凋亡的影響。由此可推測miR146a通過調(diào)控顆粒細胞凋亡參與POF的發(fā)病，但能否作為POF的預(yù)測和診斷依據(jù)，尚需結(jié)合臨床進行深入研究。由上可知，miRNA通過調(diào)控靶基因促進顆粒細胞凋亡，進而參與卵泡閉鎖及POF發(fā)生發(fā)展等過程，或許miRNA能夠作為POF等疾病的臨床指標和治療策略。

1.2 抑制顆粒細胞凋亡的miRNA

目前研究發(fā)現(xiàn)抑制顆粒細胞凋亡的miRNA相比促進顆粒細胞凋亡的miRNA較少，現(xiàn)總結(jié)目前研究最透徹的三種miRNA：miR-181b、miR-222、miR-21。

Smads家族在TGFβ信號通路中扮演重要角色，不同Smad對TGFβ信號通路有不同的影響。Smad7影響TGFβR1的穩(wěn)定性并阻礙TGFβR1與Smad2/3的結(jié)合，最終破壞TGFβ信號通路，該通路異常會影響顆粒細胞功能和卵母細胞成熟。在豬卵泡閉鎖過程中下調(diào)的miR-181b可直接作用于Smad7基因，抑制顆粒細胞凋亡[12]。miR-222直接靶向血小板凝血酶蛋白1(thrombospondin1,THBS1)的3′UTR，miR-222模擬物抑制THBS1的mRNA和蛋白質(zhì)，并導(dǎo)致抗凋亡因子Bcl-2上調(diào)，促凋亡因子caspase3下調(diào)；miR-222抑制劑促進THBS1表達，減少Bcl-2表達，但對caspase3無明顯影響。miR-222通過影響THBS1抑制豬顆粒細胞凋亡[13]。當發(fā)現(xiàn)miR-21可抑制顆粒細胞凋亡后，研究者在體外用miR-21轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)與化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠POF顆粒細胞共培養(yǎng)，可有效抑制顆粒細胞的凋亡，同時磷酸酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)和程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)表達下調(diào)。下調(diào)的磷酸化PTEN激活蛋白激酶B途徑，誘導(dǎo)細胞生長和增殖，并抑制細胞凋亡。PDCD4通過脂多糖介導(dǎo)的信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡，PDCD4的下調(diào)保護細胞免受DNA損傷所致的凋亡。體內(nèi)實驗將miR-21轉(zhuǎn)染的MSC移植到大鼠雙側(cè)卵巢，結(jié)果表明大鼠卵巢重量和不同階段卵泡數(shù)目增加，雌激素水平增加而FSH水平降低。這意味著過表達miR-21促進MSC對POF的修復(fù)作用，這對POF患者改善卵巢功能提供了新的診療思路[14]。

2 miRNA對顆粒細胞增殖的調(diào)控

顆粒細胞的增殖功能對于卵泡發(fā)育、成熟和閉鎖至關(guān)重要。多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是常見的因排卵障礙引起的不孕類型，已觀察到PCOS患者顆粒細胞的增殖率顯著上升，通過總結(jié)顆粒細胞增殖與miRNA的關(guān)系，為PCOS的發(fā)病機制和診療提供幫助。

2.1 miRNA在正常顆粒細胞增殖中的作用

為證明miR-320在顆粒細胞增殖中的作用，Yin等[15]在體內(nèi)和體外鼠顆粒細胞中過表達miR-320，均表現(xiàn)為顆粒細胞增殖受抑制，并且miR-383能夠增強miR-320對顆粒細胞增殖的抑制作用。miR-10b通過靶向腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotropic factor,BDNF)抑制山羊顆粒細胞的增殖，BDNF具有促進細胞增殖的作用，進一步研究將miR-10b與BDNF聯(lián)合治療發(fā)現(xiàn)促進顆粒細胞的增殖，可見miR-10b的抑制作用可通過BDNF的重新加入而逆轉(zhuǎn)[16]，可考慮使用靶基因制劑去改善miRNA對顆粒細胞增殖的抑制作用。miR-224可通過靶向Smad4抑制小鼠顆粒細胞的增殖和雌激素的釋放，Liang等[17]在此基礎(chǔ)從轉(zhuǎn)錄水平出發(fā)，發(fā)現(xiàn)p53和p65因子通過結(jié)合miRNA-22的宿主基因GABAA受體ε亞基啟動子下調(diào)miR-224，上調(diào)靶基因，由此思考是否可反調(diào)控miRNA來治療相關(guān)疾病。miR-181a通過靶向激活素受體IIA(activin receptor IIA,AcvrIIa)減少增殖細胞核抗原的積累抑制顆粒細胞增殖[18]。特別的是Yan等[19]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-145通過靶向AcvrIb抑制小鼠顆粒細胞增殖，而Xu等[20]發(fā)現(xiàn)miR-145通過靶向Krüppel樣因子4保護小鼠顆粒細胞免受氧化應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡，因此miR-145在小鼠顆粒細胞中的作用仍需要更多的研究去證實。

2.2 miRNA在多囊卵巢綜合征患者顆粒細胞增殖中的作用

miR-93在PCOS患者中過表達，通過靶向細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A增強永生化人顆粒腫瘤細胞的增殖，但不能排除高胰島素血癥和高雄激素對miR-93的影響，此現(xiàn)象僅在PCOS患者中發(fā)現(xiàn)，因此miR-93對健康顆粒細胞是否有調(diào)節(jié)作用仍需更加全面的研究[21]。PCOS患者中上調(diào)的miRNA還有miR-3940-5p、miR-140、miR-129和miR-17-5p等[17,22-25]。相反，在PCOS患者中低表達的miR-145、miR-483和miR-483-5p分別通過靶向胰島素受體底物1、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)、IGF2抑制顆粒細胞增殖[26-28]。近期研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者中低表達的miR-129和miR-17-5p，當過表達兩者時可見顆粒細胞增殖增加凋亡減少[22-23]。這些結(jié)果提示miRNA可作為改善PCOS患者顆粒細胞功能的新型分子靶標。

3 miRNA對顆粒細胞類固醇激素合成的調(diào)控

MGC產(chǎn)生多種類固醇激素和生長因子，通過影響顆粒細胞增殖與凋亡以及卵泡液的形成影響卵泡生長發(fā)育[2]，最重要的類固醇激素有雌激素和孕激素，他們通過負反饋下丘腦垂體性腺軸調(diào)控卵巢功能，雌、孕激素也是主要的抗凋亡因子。我們通過研究miRNA對類固醇激素的調(diào)控不但可以間接解釋顆粒細胞凋亡，還對調(diào)控卵泡生長發(fā)育提供理論支持。

芳香化酶(CYP19A1)是體內(nèi)雌激素合成的限速酶，直接影響體內(nèi)雌激素的水平。研究發(fā)現(xiàn)miR-378直接靶向豬卵丘細胞CYP19A1抑制雌激素合成，從而影響卵母細胞成熟[29]；miR-1275則是通過靶向肝受體同源蛋白1影響CYP19A1表達從而抑制豬顆粒細胞雌激素合成[30]；Zhang等[31]發(fā)現(xiàn)過表達miR-205抑制小鼠顆粒細胞雌激素釋放并促進細胞凋亡，作用機制與miR-205靶向環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)原件結(jié)合蛋白1(cyclic adenosine monophosphate responsive element binding protein 1,CREB1)調(diào)控caspase和CYP19A1軸有關(guān)，CREB1上調(diào)可部分挽救miR-205所致的細胞凋亡和雌激素抑制；相反miR-132靶向CYP19A1負向調(diào)節(jié)劑神經(jīng)元相關(guān)受體1促進小鼠顆粒細胞雌激素的合成[32]。miR-320通過轉(zhuǎn)錄因子E2F1和SF1兩個靶基因抑制小鼠顆粒細胞雌激素產(chǎn)生，同時部分促進孕酮和睪丸激素產(chǎn)生[15]。Mohammed等[33]在人顆粒細胞中發(fā)現(xiàn)miR-96通過抑制叉頭轉(zhuǎn)錄因子1促進顆粒細胞孕激素產(chǎn)生。由上可知，miRNA在顆粒細胞雌、孕激素合成過程中起重要的調(diào)控作用，而雌孕激素對卵母細胞發(fā)育和胚胎成功著床極為重要，在輔助生殖技術(shù)中，我們可考慮通過檢測顆粒細胞中與激素合成相關(guān)的特異miRNA初步評估卵泡質(zhì)量和子宮內(nèi)膜情況。

4 結(jié)語與展望

以上，我們總結(jié)miRNA在顆粒細胞凋亡、增殖和類固醇激素合成中的作用，miRNA與靶基因的特異性結(jié)合，引起靶基因和/或下游通路因子miRNA和蛋白質(zhì)水平變化，進而調(diào)控顆粒細胞功能。目前研究的卵巢顆粒細胞多數(shù)取材于動物，無法準確反映miRNA對人顆粒細胞功能的調(diào)控，但對解釋兩者間機制提供一定方向，以后仍需要更多以人顆粒細胞為模型的研究為臨床試驗奠定理論基礎(chǔ)。在今后的研究我們應(yīng)多分析探索miRNA的多元化特征，深究其在顆粒細胞中的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，另外物種差異性和組織特異性問題也不容忽視。人類對新事物的認識是一個從宏觀到微觀，再從微觀到宏觀的過程，研究miRNA對顆粒細胞的調(diào)控機制為以后宏觀調(diào)節(jié)顆粒細胞功能奠定了分子基礎(chǔ)。異常顆粒細胞miRNA的研究為相關(guān)疾病提供新的診療思路，miRNA合成劑與抑制劑以及相應(yīng)靶基因類似藥物也將有望成為治療不孕癥相關(guān)疾病的新方法。此外，在人類輔助生殖技術(shù)中，是否可將miRNA作為微創(chuàng)診斷生物標記物預(yù)測卵母細胞和胚胎質(zhì)量，更需要我們進一步的探索。