黃秋葵花、果、莖葉中有效成分提取和測(cè)定

吳比，孫源，魏亮，馮冰玉，姜守剛※

（東北林業(yè)大學(xué)，a.森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.生物資源生態(tài)利用國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

黃秋葵（Hibiscus esculentus L.）別名秋葵、羊角豆，為錦葵科秋葵屬1年生草本植物[1]。自20世紀(jì)90年代初引入我國(guó)，現(xiàn)國(guó)內(nèi)各地均有栽培。黃秋葵果實(shí)具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，其莖、葉、花、種子也具有一定的開發(fā)利用價(jià)值，也可以作為園林綠化觀賞植物。

黃秋葵果味甘滑，有健脾益胃、潤(rùn)燥利腸之功效，可治脾虛乏力、腸燥便秘等癥，經(jīng)常食用黃秋葵能幫助消化、健胃、整腸，對(duì)胃炎、胃潰瘍、肝臟等疾病均有療效[2]。此外，黃秋葵還具有增強(qiáng)免疫力、保肝、治療燒傷和燙傷等其他作用[3～6]。黃秋葵嫩莢、花中均富含植物黃酮（黃秋葵花中黃酮含量是大豆葉子的300倍左右）。黃秋葵果實(shí)富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維，同時(shí)還富含黃酮、多糖等有效成分。黃阿根等[7～10]報(bào)道，烘干后的黃秋葵嫩果中含蛋白質(zhì)22.98%、總糖19.92%（其中多糖占總糖的2.00%）、脂肪9.40%、黃酮2.56%。WoolfeJA等[11]通過測(cè)定黃酮浸提液的吸光度，確定最佳提取時(shí)間為25min。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器與試劑

722s型可見光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；ALC-1104型分析天平（北京賽利多斯儀器系統(tǒng)有限公司）；B-220型水浴鍋、RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞萊生化儀器廠）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工有限公司）；FDU-1200型冷凍干燥箱（上海愛郎儀器有限公司）；LG10-2.4A型離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）。

濃硫酸、過氧化氫、硝酸鋁、95%乙醇、亞硝酸鈉、苯酚、濃鹽酸、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為自制超純水。

1.2 材料與試劑

試驗(yàn)所用的黃秋葵樣品購(gòu)自中國(guó)湖南省岳陽縣步仙鄉(xiāng)廣福村，經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室姜守剛副教授鑒定為野生黃秋葵。試驗(yàn)前對(duì)所采購(gòu)的黃秋葵干燥樣品粉碎后（過60目篩）置于玻璃樣品瓶中作為供試樣品備用。

2 試驗(yàn)方法

2.1 黃秋葵有效成分的提取方法

2.1.1 多糖的提取方法 分別精確稱取黃秋葵花、果、莖葉供試樣品 20g，用超純水浸泡（料液比為1∶10）12h后，在100℃煎煮3h，趁熱過濾，保留濾液。濾渣再次煎煮3h，合并2次濾液，加熱濃縮至100mL。濃縮液冷卻后置于玻璃容器中，加入95%乙醇，使其醇沉濃度為85%時(shí)止，用封口膜封好，靜置48h。吸出上清液，5 000r/min離心10min，并回收乙醇。將沉淀物置于室溫下晾干48h，所得物為粗多糖樣品。

2.1.2 黃酮的提取方法 分別精確稱取黃秋葵花、果、莖葉供試樣品 20g，加入60%乙醇（料液比為1∶25）進(jìn)行超聲波輔助浸提（65℃，250W，25min，）。提取液過濾后再5 000r/min離心10min，取上清液，蒸發(fā)濃縮成浸膏狀，將乙醇浸膏冷凍干燥后得到提取物為黃酮樣品。

2.2 多糖含量測(cè)定

2.2.1 葡萄糖回歸曲線繪制及回歸方程的建立 準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用雙蒸水將其定容至100mL，得0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取 0.0mL（空白對(duì)照）、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25mL比色管中，用雙蒸水補(bǔ)足至2.0mL，分別加入5%的苯酚1.0mL、濃硫酸5.0mL，搖勻、靜置、冷卻至室溫。490nm條件下測(cè)定待測(cè)樣品吸光度。以葡萄糖含量（Yp）為橫坐標(biāo)、吸光度值（Xp）為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of Glucose

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線得出了多糖回歸方程為 Yp=11.659xp+0.028 1，R2=0.999 5。

2.2.2 多糖含量測(cè)定方法 精密稱取提取的黃秋葵花、果、莖葉干燥多糖各0.01g，分別用雙蒸水溶解后，定容于10mL的容量瓶，分別取定容后的多糖溶液0.3mL于3支試管中，分別加入雙蒸水1.7mL、5%苯酚溶液1.0mL、濃硫酸5.0mL，沸水中煮15min后冷卻至室溫，在490nm條件下測(cè)定吸光度。

2.3 黃酮含量測(cè)定

2.3.1 蘆丁回歸曲線繪制及回歸方程的建立 準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1g，用30%乙醇定容至100mL；再取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品乙醇溶液5mL，用雙蒸水定容至100mL，配制出0.5mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確量取0mL（空白對(duì)照）、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于25mL的比色管中，然后分別用30%乙醇溶液稀釋到10mL，加入5%NaNO2 0.7mL，混勻后靜置6min，再加入10%的Al（NO3）30.7mL，混勻后靜置6min，加入4%NaOH 5.0mL，再用30%乙醇定容至25mL，混勻后靜置15min。510nm條件下測(cè)定待測(cè)樣品吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度（Yf）為橫坐標(biāo)、吸光度值（Xf）為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Rutin standard curve

根據(jù)蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出黃酮的回歸方程為Yf=0.384 6Xf+0.006 3，R2=0.999 8。

2.3.2 黃酮含量的測(cè)定方法 準(zhǔn)確稱取已提取的黃秋葵花、果、莖葉干燥黃酮各1g，用30%乙醇定容至100mL。取乙醇黃酮溶液5mL定容至100mL，分別配制出0.5mg/mL的黃秋葵花、果、莖葉黃酮溶液。取0.5mg/mL的花、果、莖葉黃酮溶液各1mL于試管中，分別用 30%乙醇稀釋至 10mL，加入 5%NaNO2 0.7mL，混勻后靜置 6min，加 10%Al（NO3）30.7mL，混勻后靜置6min，加4%NaOH 5mL，再用30%乙醇定容至25mL，混勻、靜置15min，510nm條件下測(cè)吸光度。

3 結(jié)果

3.1 多糖

3.1.1 多糖的提取 采用“2.1.1”項(xiàng)下方法，從黃秋葵花、果、莖葉各20g樣品中分別提取了3.32g、1.16g、1.23g粗多糖。

3.1.2 多糖含量的測(cè)定 的黃秋葵粗多糖經(jīng)“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定結(jié)果，根據(jù)多糖回歸方程計(jì)算得出多糖含量，黃秋葵花、果、莖葉多糖吸光度和多糖含量結(jié)果見表1。

表1 多糖含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination of polysaccharide content

根據(jù)表1得知，黃秋葵花、果、莖葉中多糖含量分別為27.75%、39.05%、43.74%；黃秋葵各器官中多糖含量依次為莖葉＞果＞花，莖葉中多糖含量最高。

3.2 黃酮

3.2.1 黃酮的提取 采用“2.1.2”方法，從黃秋葵花、果、莖葉20g樣品中分別提取出了0.86g、2.66g、0.95g粗黃酮。

3.2.2 黃酮含量測(cè)定 提取的黃秋葵粗多糖經(jīng)“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定結(jié)果，根據(jù)黃酮回歸方程，計(jì)算得出黃酮含量，黃秋葵花、果、莖葉多糖吸光度和黃酮含量結(jié)果見表2。

表2 黃酮含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of flavonoid determination

根據(jù)上表可以得出，黃秋葵花、果、莖葉中黃酮的含量分別為26.25%、27.50%、26.93%；黃秋葵果中黃酮含量最高，各器官黃酮含量依次為：果＞莖葉＞花。