擠壓膨化糙米香氣物質(zhì)的頂空固相微萃取條件優(yōu)化

陳焱芳，張雁，鄧媛元，魏振承，唐小俊，劉光，張名位

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510610）

全谷物糙米中蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維以及游離態(tài)的鈣、鐵、鋅等重要礦物元素的含量均高于精白米。此外，糙米還富含許多精白米不含或含量很少的功能性營養(yǎng)因子，如γ-氨基丁酸、谷胱甘肽和谷維素等，這些功能性成分使糙米具有預(yù)防心腦血管疾病、降血糖、降血脂、改善新陳代謝和增強(qiáng)免疫力等一系列保健功效[1]。然而，糙米的糠層含有大量糠蠟和纖維等物質(zhì)，直接食用不僅口感粗糙[2]、香氣也十分清淡[3]，消費(fèi)者接受程度并不高。

研究發(fā)現(xiàn)，香氣物質(zhì)對糙米的可接受性起著重要作用[4-5]。擠壓膨化技術(shù)集混合、攪拌、破碎、加熱、殺菌、膨化及成型等過程為一體[6]，物料在加工過程中會發(fā)生分解、降解、變性和交聯(lián)作用以及氧化、聚合、水解等各種化學(xué)反應(yīng)。擠壓膨化處理可以提高糙米的適口性和風(fēng)味，是糙米加工前景廣闊的重要技術(shù)[7]。HE F等[8]研究發(fā)現(xiàn)糙米經(jīng)擠壓膨化處理后，2-乙?；量┻?、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛等化合物的風(fēng)味稀釋（flavor dilution，F(xiàn)D）因子顯著升高，并認(rèn)為這些化合物可能對擠壓膨化糙米的香氣有更大的貢獻(xiàn)。

頂空-固相微萃?。╤eadspace-solid phase microextraction，HS-SPME）技術(shù)具有操作簡便、萃取速度快、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)[9]。SPME吸附揮發(fā)性物質(zhì)是一個動態(tài)平衡的過程，其吸附效果易受萃取溫度和時(shí)間等條件的影響[10-11]。HS-SPME提取揮發(fā)性物質(zhì)的報(bào)道主要集中于稻米[11-12]或煮熟米飯[13-16]，而有關(guān)糙米及擠壓膨化糙米香氣物質(zhì)的提取卻鮮有報(bào)道，或是報(bào)道的方法并未考慮提取的化合物是否具有氣味活性[17-18]。實(shí)際上絕大多數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)對糙米香氣幾乎沒有貢獻(xiàn)[19]。本課題組前期用溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)技術(shù)與氣質(zhì)聯(lián)用鑒定出糙米及擠壓膨化糙米中的71種揮發(fā)性風(fēng)味化合物[8]，本試驗(yàn)以其中16種經(jīng)過氣相色譜-嗅味（gas chromatography-olfactometry，GC-O）鑒定的具有香氣的化合物作為分析指標(biāo)，采用HS-SPME和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）對其萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為擠壓膨化糙米中香氣物質(zhì)的進(jìn)一步定量分析打下基礎(chǔ)，有助于更好地在生產(chǎn)和貯藏過程中調(diào)控糙米及其加工產(chǎn)物的風(fēng)味。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

五常長粒糙米：市售；C5～C25正構(gòu)烷烴混標(biāo)：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；氦氣（99.999%）：廣州龍奧氣體設(shè)備有限公司；氯化鈉（分析純）：福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃取手動進(jìn)樣手柄（57330U）、固相微萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS，57328U）：美國 Supelco公司；20 mm鉗口100 mL透明頂空樣品瓶：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890B/5977B MSD）：美國 Agilent公司；色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm HP-5MS）：美國Agilent J&W公司；嗅聞儀（ODP3）：德國Gerstel公司；集熱式恒溫磁力攪拌浴（HWCL-5）：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；雙螺桿膨化機(jī)（DS30-Ⅱ型）：山東賽信膨化機(jī)械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 擠壓膨化工藝參數(shù)

糙米水分含量調(diào)節(jié)為10%，擠壓機(jī)前端、中端和末端溫度分別60、98、134℃，螺桿轉(zhuǎn)速29.6 Hz。擠出樣品粉碎后過60目篩，冷卻至室溫（25℃）后樣品含水量約為9%，所有樣品用聚乙烯食品包裝袋密封后保存于-18℃冷庫中以備后續(xù)試驗(yàn)分析。

1.3.2 萃取方法

取3.0 g擠壓膨化糙米粉，倒入體積100 mL頂空樣品瓶中，加入21 mL飽和NaCl溶液，放入轉(zhuǎn)子后鉗緊瓶蓋。頂空瓶立即放入恒溫磁力攪拌浴中，平衡和萃取溫度均為55℃，平衡20 min，然后插入SPME纖維頭，頂空萃取45 min。萃取完畢后，將SPME纖維頭插入GC-MS進(jìn)樣口，于250℃解吸5 min。

1.3.3 GC-MS參數(shù)條件及分析

色譜條件：HP-5MS 型（30 m×250 μm×0.25 μm）毛細(xì)管柱；載氣為高純氦氣（99.999%）；恒流恒壓模式，流量為 1.7 mL/min，壓力為 13.3 Psi，分流比為 5∶1；進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序：初始溫度40℃，保持5 min，以3℃/min升至185℃，保持 5 min，以5℃/min升至130℃，保持1 min，以15℃/min升至230℃，保持3 min，總運(yùn)行時(shí)間約為45 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（electron impact，EI），電子能量70eV；傳輸線溫度250℃，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，接口溫度280℃；掃描質(zhì)量范圍35～400 m/z。

1.3.4 定性與定量分析

1）定性分析：未知揮發(fā)性化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索與NIST14標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫匹配，選擇匹配度大于80的化合物進(jìn)行保留指數(shù)（retention index，RI）計(jì)算。于1.3.3所述條件下對C5～C25正構(gòu)烷烴混標(biāo)進(jìn)行GC-MS分析，記錄各正構(gòu)烷烴保留時(shí)間，根據(jù)程序升溫公式（式1）計(jì)算各化合物的RI，并與參考文獻(xiàn)中的RI值進(jìn)行對比，從而確定化合物的種類。

式中：tn和tn+1為碳原子數(shù)為n和n+1的正烷烴流出峰的保留時(shí)間，min；tx為被分析組分流出峰的保留時(shí)間，min，且 tn＜tx＜tn+1。

2）定量分析：采用峰面積歸一化法對化合物進(jìn)行定量。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選定樣品量為3.0 g，對料液比[1 ∶3、1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9、1 ∶11（g/mL）]，萃取溫度（35、45、55、65、75 ℃），平衡時(shí)間（15、20、25、30、35 min）及吸附時(shí)間（35、40、45、50、55 min）做單因素試驗(yàn)，初步找到優(yōu)化萃取條件。以16種氣味活性化合物的離子色譜總峰面積來表征不同萃取條件的萃取效果，總峰面積越大表明萃取效果越好。

1.3.6 響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化HSSPME萃取擠壓膨化糙米香氣物質(zhì)的條件，最終得到最優(yōu)固相微萃取條件。通過單因素試驗(yàn)，確定了料液比、萃取溫度、平衡時(shí)間及吸附時(shí)間4個單因素的優(yōu)化條件。為確定各因素之間的最佳比例，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取若干因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，以香氣物質(zhì)的離子色譜總峰面積作為響應(yīng)指標(biāo)。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

每個樣品重復(fù)3次試驗(yàn)，各指標(biāo)差異顯著性分析采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），并采用Duncan法進(jìn)行多組樣本間比較。數(shù)據(jù)處理及制圖采用SPSS 20、Origin 9和Design Expert 8.0等軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析

圖1為擠壓膨化糙米香氣物質(zhì)的GC-MS總離子流色譜圖，序號1～16分別為16種氣味活性化合物，其保留指數(shù)及氣味描述見表1。試驗(yàn)以16種氣味活性化合物的離子色譜總峰面積來表征不同萃取條件的萃取效果，總峰面積越大表明萃取效果越好。

為了驗(yàn)證試驗(yàn)GC-MS參數(shù)設(shè)置是否合理以及定性試驗(yàn)誤差是否在可接受范圍內(nèi)，由文獻(xiàn)RI參考值與試驗(yàn)RI值的擬合曲線對比圖（圖2）可以看出，圖中y1為RI參考值擬合線方程，y2為RI試驗(yàn)值擬合線方程，RI參考值（R2=0.954 1）和 RI試驗(yàn)值（R2=0.952 3）具有很好的擬合性，且各保留時(shí)間下RI試驗(yàn)值與RI參考值相近，表明GC-MS參數(shù)設(shè)置合理，RI參考值與RI試驗(yàn)值之間具有高度相關(guān)性，定性試驗(yàn)誤差小。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比的選擇

選擇料液比 1 ∶3、1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9、1 ∶11（g/mL）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，得到擠壓膨化糙米中香氣物質(zhì)離子色譜總峰面積如圖3所示。

圖1 香氣物質(zhì)的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of aroma compounds

表1 香氣物質(zhì)的保留指數(shù)及氣味描述Table 1 Retention index and odor description of aroma compounds

圖2 RI參考值與RI試驗(yàn)值擬合曲線比較Fig.2 Fitting line comparison between reference retention indices and experimental retention indices

圖3 料液比與香氣物質(zhì)總峰面積之間的關(guān)系Fig.3 The relationship between the ratio of material to liquid and the total peak area of aroma compounds

由圖3可知，當(dāng)料液比為1∶3（g/mL）時(shí)，樣品體系偏濃稠，平衡時(shí)攪拌不充分、水浴受熱不均勻，香氣物質(zhì)不能很好地?fù)]發(fā)出來；當(dāng)料液比為1∶11（g/mL）時(shí)糙米粉稀釋倍數(shù)較大，加之萃取溫度不高，香氣物質(zhì)可能難以逸出溶液體系；料液比 1 ∶5、1∶7、1∶9（g/mL）時(shí)香氣物質(zhì)的離子色譜總峰面積分別為（312.95±2.80）×106、（315.69±2.78）×106、（309.65±3.80）×106，三者無顯著性差異、萃取效果相當(dāng)，但料液比為1∶7（g/mL）時(shí)峰面積更高且相對偏差更小，萃取效果更加穩(wěn)定，因此選擇料液比1∶7（g/mL）為最佳值。

2.2.2 萃取溫度的選擇

選擇萃取溫度 35、45、55、65、75 ℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測得萃取溫度與香氣物質(zhì)的離子色譜總峰面積關(guān)系如圖4所示。

圖4 萃取溫度與香氣物質(zhì)總峰面積之間的關(guān)系Fig.4 The relationship between the extraction temperature and the total peak area of aroma compounds

隨著萃取溫度升高，氣體分子運(yùn)動加快，有利于香氣物質(zhì)到達(dá)萃取纖維表面；但溫度過高可能會導(dǎo)致更多無香氣化合物的產(chǎn)生與吸附、不穩(wěn)定香氣物質(zhì)的吸附減少、萃取纖維吸附能力降低等情況的發(fā)生，從而影響吸附效果[11]。從圖4可以看出，萃取溫度對萃取效果影響顯著，當(dāng)萃取溫度為55℃時(shí)，香氣物質(zhì)總峰面積最大，因此取萃取溫度55℃為最佳值。

2.2.3 平衡時(shí)間的選擇

選擇平衡時(shí)間 15、20、25、30、35 min 進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測得平衡時(shí)間與香氣物質(zhì)的離子色譜總峰面積關(guān)系如圖5所示。平衡時(shí)間的長短影響樣品體系揮發(fā)性成分的動態(tài)平衡，進(jìn)而影響萃取纖維的吸附量和達(dá)到吸附飽和的時(shí)間。

圖5 平衡時(shí)間與香氣物質(zhì)總峰面積之間的關(guān)系Fig.5 The relationship between the equilibrium time and the total peak area of aroma compounds

從圖5可以看出，香氣物質(zhì)的總峰面積隨著平衡時(shí)間的延長而增大，在20 min時(shí)達(dá)到吸附飽和，香氣物質(zhì)總峰面積為（315.69±2.78）×106，25、30min 時(shí)香氣物質(zhì)總峰面積分別為（311.49±2.04）×106、（307.45±2.08）×106。平衡時(shí)間為20、25、30 min時(shí)香氣物質(zhì)總峰面積無顯著性差異，但平衡20 min后香氣物質(zhì)總峰面積呈緩慢下降趨勢，由此推測平衡時(shí)間20 min為最佳值。

2.2.4 吸附時(shí)間的選擇

選擇吸附時(shí)間 35、40、45、50、55 min 進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測得吸附時(shí)間與香氣物質(zhì)的離子色譜總峰面積關(guān)系如圖6所示。

圖6 吸附時(shí)間與香氣物質(zhì)總峰面積之間的關(guān)系Fig.6 The relationship between the adsorption time and the total peak area of aroma compounds

由圖6可知，吸附時(shí)間不足45 min時(shí)，隨著吸附時(shí)間的延長，萃取纖維吸附的香氣物質(zhì)逐漸增多；45 min時(shí)香氣物質(zhì)的總峰面積達(dá)到最大為（315.69±2.78）×106，而吸附時(shí)間超過45 min后總峰面積不斷減小，這可能是由于萃取纖維在吸附飽和的情況下，受熱吸附時(shí)間過長導(dǎo)致熱穩(wěn)定性低的香氣物質(zhì)分解和吸附到更多無香氣化合物所致，因此取吸附時(shí)間45 min為最佳值。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面因素的確定及試驗(yàn)方案

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，樣品質(zhì)量 3.0 g；料液比 1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9（g/mL）對萃取效果影響無顯著性差異，但料液比1∶7（g/mL）時(shí)香氣物質(zhì)的總峰面積更高且相對偏差更小，因此固定料液比為1∶7（g/mL）。選取萃取溫度（A）、平衡時(shí)間（B）、吸附時(shí)間（C）為自變量，以固相微萃取的香氣物質(zhì)的離子色譜總峰面積作為響應(yīng)指標(biāo)（Y），進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

2.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸分析

以香氣物質(zhì)離子色譜總峰面積為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)為交叉試驗(yàn)12個，零點(diǎn)試驗(yàn)5個。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，回歸分析結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Response surface design arrangement and experimental results

表4 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert 8.0對表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到擠壓膨化糙米中香氣物質(zhì)的離子色譜總峰面積（Y）對萃取溫度（A）、平衡時(shí)間（B）、吸附時(shí)間（C）的二次回歸方程模型為：Y=3.165×108-9.963×106A-7.229×105B-7.747×106C-8.116×106AB-3.931×105AC＋1.409×107BC-1.254×107A2-1.624×107B2-1.923×107C2

回歸模型整體為高度顯著（p=0.000 1＜0.001），回歸模型的失擬項(xiàng)不顯著（p=0.576 1＞0.05），說明該模型擬合度好，是可信的，可以用此模型檢驗(yàn)使用HSSPME提取擠壓膨化糙米中香氣物質(zhì)的效果，探究因素的最優(yōu)響應(yīng)水平。通過軟件分析該回歸模型，R2=0.978 1，R2Adj=0.949 8，說明相應(yīng)指標(biāo)的變化有94.98%來源于優(yōu)化的因素即萃取溫度、平衡時(shí)間和吸附時(shí)間，回歸方程與實(shí)際值具有很高的擬合性，因此回歸方程可以代替真實(shí)值解釋響應(yīng)指標(biāo)的結(jié)果。

由表4可知，所選因素中萃取溫度A對萃取效果高度顯著，吸附時(shí)間對萃取效果極顯著，萃取溫度A2、平衡時(shí)間B2、吸附時(shí)間C2的二次項(xiàng)對萃取效果高度顯著，兩兩因素交互，即萃取溫度與平衡時(shí)間AB、平衡時(shí)間與吸附時(shí)間BC對萃取效果影響極顯著或高度顯著，說明了萃取溫度以及吸附時(shí)間對香氣物質(zhì)固相微萃取效果影響顯著，而平衡時(shí)間、交互項(xiàng)萃取溫度與吸附時(shí)間對固相微萃取效果影響不顯著，說明這些條件對香氣物質(zhì)提取效果的影響并不是簡單的線性關(guān)系。

2.3.3 響應(yīng)面曲面分析

通過Design-Expert 8.0得出響應(yīng)面的立體圖如圖7～圖9所示，可以直觀的看出各因素對響應(yīng)指標(biāo)的影響，以及最優(yōu)和最佳因素水平。

圖7 萃取溫度和平衡時(shí)間對總峰面積影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour map of the influence of extraction temperature and equilibrium time on the total peak area

圖8 萃取溫度和吸附時(shí)間對總峰面積影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.8 Response surface and contour map of the influence of extraction temperature and adsorption time on the total peak area

圖9 吸附時(shí)間和平衡時(shí)間對總峰面積影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.9 Response surface and contour map of the influence of adsorption time and equilibrium time on the total peak area

圖7是吸附時(shí)間為45 min時(shí)，萃取溫度和平衡時(shí)間對香氣物質(zhì)的離子色譜總峰面積影響的響應(yīng)曲面，隨著萃取溫度的升高，總峰面積先增加后迅速減少；隨著平衡時(shí)間的延長，總峰面積先增后減的趨勢相對較為平緩。圖8是萃取溫度和吸附時(shí)間對總峰面積交互影響的響應(yīng)曲面，隨著萃取溫度的升高或平衡時(shí)間的延長，總峰面積均有明顯先增后減的變化趨勢。圖9是平衡時(shí)間和吸附時(shí)間對總峰面積交互影響的響應(yīng)曲面，隨著平衡時(shí)間的延長，總峰面積先增后減、且減少段變化趨勢更加明顯；隨著吸附時(shí)間的延長，總峰面積同樣先增后減、但增加段變化趨勢更加明顯。與表4中得出的方差分析結(jié)果相似，從響應(yīng)曲面圖可以看出對香氣物質(zhì)離子色譜總峰面積影響最大的因素是萃取溫度，其次是吸附時(shí)間，然后是平衡時(shí)間。

根據(jù)Design-Expert 8.0中最大值優(yōu)化法，在模型范圍中選擇最高點(diǎn)為出發(fā)點(diǎn)，優(yōu)化得到HS-SPME提取香氣物質(zhì)的最優(yōu)條件為萃取溫度51.11℃，平衡時(shí)間19.94 min，吸附時(shí)間43.99 min，預(yù)測該條件下測得香氣物質(zhì)的總峰面積為3.190×108?？紤]到實(shí)際情況，進(jìn)行略微調(diào)整后的最優(yōu)萃取條件為：樣品量3.0 g，料液比 1∶7（g/mL），萃取溫度 51℃，平衡時(shí)間 20 min，吸附時(shí)間44 min。采用上述條件做驗(yàn)證試驗(yàn)，萃取的香氣物質(zhì)的離子色譜總峰面積為3.215×108，相對誤差為0.78%、與預(yù)測值相差較??；同時(shí)單因素試驗(yàn)得到的香氣物質(zhì)的總峰面積最大值為3.157×108，小于最優(yōu)萃取條件下得到的數(shù)值，說明該模型優(yōu)化所得的萃取條件的參數(shù)可信度高，且優(yōu)化萃取條件是更加合理可行的。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以16種香氣物質(zhì)的總峰面積為優(yōu)化指標(biāo)，更加符合研究糙米揮發(fā)性風(fēng)味化合物的實(shí)際意義。首先對萃取條件中的料液比、萃取溫度、平衡時(shí)間及吸附時(shí)間做單因素試驗(yàn)，在初步得到優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，對萃取溫度（45、55、65 ℃）、平衡時(shí)間（15、20、25 min）和吸附時(shí)間（40、45、50 min）做三因素三水平的響應(yīng)面分析。響應(yīng)面二次回歸方程模型整體為高度顯著，擬合度好、可信度高。所選因素中萃取溫度、交互項(xiàng)的平衡時(shí)間與吸附時(shí)間對萃取效果影響高度顯著，吸附時(shí)間、交互項(xiàng)的萃取溫度與平衡時(shí)間對萃取效果影響極顯著，而平衡時(shí)間以及交互項(xiàng)的萃取溫度與吸附時(shí)間對萃取效果影響不顯著，說明這些條件對香氣物質(zhì)提取效果的影響并不是簡單的線性關(guān)系。

最終得到的擠壓膨化糙米HS-SPME最佳條件為樣品量 3.0 g，料液比 1∶7（g/mL），萃取溫度 51℃，平衡時(shí)間20 min，吸附時(shí)間44 min。驗(yàn)證試驗(yàn)中得到的香氣物質(zhì)的離子色譜總峰面積為3.215×108，與預(yù)測值（3.190×108）的相對誤差為0.78%，說明該模型優(yōu)化所得的萃取條件參數(shù)是合理可行的，具有實(shí)用價(jià)值，有利于擠壓膨化糙米中香氣物質(zhì)的進(jìn)一步定性、定量分析。