迷迭香精油在不同蒸餾時(shí)段的化學(xué)成分及抗氧化活性

周旭凱， 張 倩， 田玉紅*， 陳房姣， 陸 苑

(1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣西 柳州 545006)

迷迭香RosmarinusofficinalisL.屬唇形科迷迭香屬常綠灌木，具有提神醒腦、增強(qiáng)記憶力的功效，含有黃酮類、二萜酚類成分，可用作抗氧化、抗腫瘤、抗艾滋病、治療阿爾茨海默病藥物的研發(fā)[1-6]。現(xiàn)代藥理研究表明，迷迭香精油具有多種生物活性，因而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和農(nóng)藥領(lǐng)域[7-12]。

精油是植物新陳代謝過(guò)程中形成的次生產(chǎn)物，常以“油”的狀態(tài)存在于植物體內(nèi)某些特殊器官，目前大多采用水蒸氣蒸餾法[13]，但不同蒸餾時(shí)段精油的品質(zhì)和化學(xué)組成有所不同[14]。目前，市面上有多種化學(xué)合成的抗氧化劑，但長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的潛在毒性，而植物精油毒性較低，可用于天然抗氧化劑的研發(fā)[15-17]。本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法從迷迭香中提取精油，通過(guò)控制提取時(shí)間獲得不同蒸餾時(shí)段迷迭香精油，對(duì)其化學(xué)組成和抗氧化活性進(jìn)行考察，以期為該植物進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

TRACE1300-ISQ QD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；HP-5石英毛細(xì)色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)(美國(guó)Agilent公司)；1788揮發(fā)油提取器(湖州申玻儀器有限公司)；722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)。2，2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、二胺鹽自由基(ABTS+·)(瑞士Adamas公司)；過(guò)硫酸鉀(K2S2O5)(汕頭市西隴科學(xué)股份有限公司)；乙醇(C2H6O)(廣東光華科技股份有限公司)；2，2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基(DPPH·)、維生素C(C6H8O6，維生素C)、丁基羥基茴香醚(BHA)、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)(美國(guó)Sigma公司)，以上試劑均為分析純。迷迭香(干葉)購(gòu)自玉林市詩(shī)舒原生中草藥購(gòu)銷部(產(chǎn)地廣西)，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)玉林食品藥品檢驗(yàn)所專家鑒定為正品。

2 方法

2.1 精油提取 準(zhǔn)確稱取100 g藥材，置于揮發(fā)油提取器中，加入2 000 mL蒸餾水，水蒸氣蒸餾法提取0～10、10～30、30～60、60～360 min 4個(gè)蒸餾時(shí)段精油及0～360 min全蒸餾時(shí)段精油，冷卻后讀取體積，稱定質(zhì)量，計(jì)算提取率，公式為提取率=(不同蒸餾時(shí)段精油質(zhì)量/藥材質(zhì)量)×100%，無(wú)水硫酸鈉干燥后保存在棕色瓶中，置于4 ℃冰箱中備用。

2.2 GC-MS分析條件

2.2.1 GC HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣高純氦氣；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比1∶150；進(jìn)樣口溫度280 ℃；接口溫度280 ℃，程序升溫(60 ℃保持5 min，2 ℃/min升至260 ℃，保持5 min)。

2.2.2 MS EI電離源；電子能量70 eV；電子倍增器電壓1.5 kV；掃描范圍m/z50～550；全掃描方式。

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 對(duì)DPPH自由基(DPPH·)的清除能力 無(wú)水乙醇溶解DPPH·制得0.02 mg/mL溶液，避光保存。取不同質(zhì)量濃度精油與DPPH·溶液各2 mL，充分混勻，確定反應(yīng)時(shí)間為1 h，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度Ai；以無(wú)水乙醇分別代替精油、DPPH·溶液，測(cè)定其吸光度Ac、Aj，重復(fù)3次，取平均值，以維生素C、BHA、TBHQ為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算DPPH·清除率，公式為清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

2.3.2 對(duì)ABTS自由基陽(yáng)離子(ABTS+·)的清除能力 將7 mmol/L ABTS+·溶液與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液等比例混合，常溫避光保存24 h后制得母液，無(wú)水乙醇調(diào)節(jié)其734 nm波長(zhǎng)處吸光度至0.70±0.002，得到工作液。取不同質(zhì)量濃度精油與ABTS+·工作液各2 mL，充分混勻，避光6 min后測(cè)定其吸光度Ai；以無(wú)水乙醇代替精油，測(cè)定其吸光度A0，重復(fù)3次，取平均值，以維生素C、BHA、TBHQ為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算ABTS+·清除率，公式為清除率=[(A0-Ai)/A0]×100%。

3 結(jié)果

3.1 精油提取率 在0～10、10～30、30～60、60～360 min，精油提取率分別為(1.09±0.04)%、(0.42±0.04)%、(0.29±0.01)%、(0.33±0.01)%，可知其出油速度較快，10 min內(nèi)就提取了48.83%，而1 h內(nèi)達(dá)78.70%。

3.2 GC-MS分析 在0～10 min鑒定了50種成分，占總峰面積的99.09%；10～30 min鑒定了48種成分，占總峰面積的98.99%；30～60 min鑒定了47種成分，占總峰面積的97.76%；60～360 min鑒定了59種成分，占總峰面積的90.28%；0～360 min鑒定了56種成分，占總峰面積的96.66%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同蒸餾時(shí)段精油化學(xué)成分

由此可知，0～10 min精油中碳?xì)浠衔?6種，占總峰面積的24.61%；醇類成分9種，占總峰面積的12.56%；醚類成分2種，占總峰面積的38.49%；醛類成分1種，占總峰面積的0.11%；酮類成分5種，占總峰面積的22.45%；酯類成分1種，占總峰面積的0.70%；酚類4種，占總峰面積的0.11%；環(huán)氧化合物2種，占總峰面積的0.06%，其主要成分為桉葉油素(38.45%)、D-樟腦(22.31%)、α-蒎烯(12.03%)、莰烯(5.99%)。10～30 min精油中碳?xì)浠衔?5種，占總峰面積的13.99%；醇類成分8種，占總峰面積的20.59%；醚類成分3種，占總峰面積的34.66%；醛類成分1種，占總峰面積的0.16%；酮類成分5種，占總峰面積的28.07%；酯類成分1種，占總峰面積的0.99%；酚類4種，占總峰面積的0.33%；環(huán)氧化合物3種，占總峰面積的0.20%，其主要成分為桉葉油素(34.52%)、D-樟腦(27.83%)、冰片(8.35%)、α-松油醇(7.51%)。30～60 min精油中碳?xì)浠衔?2種，占總峰面積的19.79%；醇類成分8種，占總峰面積的25.54%；醚類成分3種，占總峰面積的24.80%；醛類成分1種，占總峰面積的0.22%；酮類成分5種，占總峰面積的24.79%；酯類成分1種，占總峰面積的1.32%；酚類4種，占總峰面積的0.80%；環(huán)氧化合物3種，占總峰面積的0.50%，其主要成分為桉葉油素(24.56%)、D-樟腦(24.52%)、α-松油醇(10.91%)、冰片(10.64%)。60～360 min精油中碳?xì)浠衔?1種，占總峰面積的39.85%；醇類成分11種，占總峰面積的20.22%；醚類成分3種，占總峰面積的14.06%；醛類成分1種，占總峰面積的0.15%；酮類成分5種，占總峰面積的9.89%；酯類成分1種，占總峰面積的1.47%；酚類4種，占總峰面積的2.48%；環(huán)氧化合物3種，占總峰面積的2.16%，其主要成分為桉葉油素(13.65%)、α-蒎烯(12.77%)、D-樟腦(9.14%)、α-松油醇(8.59%)。0～360 min精油中碳?xì)浠衔?9種，占總峰面積的23.44%；醇類成分9種，占總峰面積的15.78%；醚類成分3種，占總峰面積的34.23%；醛類成分1種，占總峰面積的0.13%；酮類成分6種，占總峰面積的21.00%；酯類成分1種，占總峰面積的0.96%；酚類4種，占總峰面積的0.65%；環(huán)氧化合物3種，占總峰面積的0.47%，其主要成分為桉葉油素(34.06%)、D-樟腦(20.72%)、α-蒎烯(10.83%)、冰片(6.44%)。4個(gè)蒸餾時(shí)段及全精油中含量最高的成分均為桉葉油素，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，該成分有樟腦氣息和清涼的草藥味道，具有殺菌、殺蟲(chóng)作用，大多用于醫(yī)藥和食品香料，還常用作防腐劑[18]。Verma等[19]采用氣相色譜-火焰電離檢測(cè)儀(GC-FID)和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS)分析印度北部亞熱帶地區(qū)不同生長(zhǎng)階段(150、165、180、195、210、225 d)的迷迭香精油，發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)階段其主要成分相同，均為樟腦(23.9%～33.2%)、桉葉油素(20.4%～23.9%)、α-蒎烯(8.5%～14.4%)、馬芐烯酮(6.9%～10.1%)，但其相對(duì)含量存在差異。Jardak等[20]使用GC-MS在突尼斯迷迭香精油中鑒定了36個(gè)化合物，主要為桉葉油素(23.56%)、莰烯(12.78%)、樟腦(12.55%)。前期報(bào)道，精油成分受植物產(chǎn)地氣候、土壤、收獲后制備方法、貯存時(shí)間等因素的影響[21]。

不同蒸餾時(shí)段精油成分主要為萜類，0～10 min其含量為97.50%，其中單萜烯12種，占總峰面積的22.11%；含氧單萜15種，占總峰面積的74.05%；倍半萜烯11種，占總峰面積的1.25%，含氧倍半萜3種，占總峰面積的0.09%。10～30 min其含量為97.05%，其中單萜烯13種，占總峰面積的12.32%；含氧單萜15種，占總峰面積的84.14%；倍半萜烯6種，占總峰面積的0.32%；含氧倍半萜4種，占總峰面積的0.27%。30～60 min其含量為93.46%，其中單萜烯13種，占總峰面積的15.94%；含氧單萜14種，占總峰面積的76.29%；倍半萜烯6種，占總峰面積的0.57%；含氧倍半萜4種，占總峰面積的0.65%。60～360 min其含量為79.70%，其中單萜烯15種，占總峰面積的27.18%；含氧單萜14種，占總峰面積的41.79%；倍半萜烯11種，占總峰面積的4.93%；含氧倍半萜8種，占總峰面積的5.65%。0～360 min其含量為93.96%，其中單萜烯14種，占總峰面積的19.99%；含氧單萜15種，占總峰面積的71.66%；倍半萜烯12種，占總峰面積的1.67%；含氧倍半萜5種，占總峰面積的0.62%。

同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在0～10、10～30、30～60 min單萜含量較高，而倍半萜含量較低；在60～360 min單萜含量明顯降低，而倍半萜含量明顯升高。田玉紅等[22]報(bào)道，蒸餾初期赤桉葉油成分以單萜為主，之后倍半萜種類和含量逐漸升高?，F(xiàn)有研究表明，揮發(fā)性萜是揮發(fā)油中生物活性較強(qiáng)或具有芳香性氣味的主要成分，因其具有抗氧化、抗病毒、抗菌、殺蟲(chóng)等作用，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、保健、農(nóng)藥等領(lǐng)域[23-25]。

3.3 精油對(duì)DPPH·的清除作用 由圖1、表2可知，隨著精油質(zhì)量濃度升高，對(duì)DPPH·的清除效果增強(qiáng)，即呈量效關(guān)系；在0～10、10～30、30～60、60～360 min的IC50值分別為20.78、14.29、5.27、2.23 mg/mL，即各蒸餾時(shí)段的清除效果依次為60～360 min>30～60 min>10～30 min>0～10 min。

表2 不同蒸餾時(shí)段精油的抗氧化活性

3.4 精油對(duì)ABTS+·的清除作用 由圖2、表2可知，隨著精油質(zhì)量濃度升高，對(duì)ABTS+·的清除效果增強(qiáng)；在0～10、10～30、30～60、60～360、0～360 min的IC50值分別為2.43、1.40、0.49、0.20 mg/mL，即各蒸餾時(shí)段的清除效果依次為60～360 min>30～60 min>10～30 min>0～10 min。

4 討論與結(jié)論

研究表明，酚類可能是植物精油具有抗氧化活性的主要物質(zhì)[26-28]，其清除自由基的機(jī)理為酚(苯氧)自由基1個(gè)電子的還原電位顯著低于氧自由基，兩者發(fā)生反應(yīng)，將后者氧化為苯氧基；苯氧基的反應(yīng)性低于氧基，能直接清除有害的反應(yīng)氧中間體，并將后者鈍化而不會(huì)發(fā)生進(jìn)一步的氧化反應(yīng)[29]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，迷迭香精油中0～10、10～30、30～60、60～360 min 4個(gè)蒸餾時(shí)段及0～360 min全蒸餾時(shí)段鑒定出來(lái)的酚類主要為麝香草酚、3-甲基-4-異丙基苯酚、香芹酚、丁香酚，總含量分別為0.11%、0.33%、0.80%、2.48%、0.65%，并且其數(shù)值越高，清除DPPH·、ABTS+·的能力越強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)分別提取了0～10、10～30、30～60、60～360 min 4個(gè)蒸餾時(shí)段迷迭香精油，并采用GC-MS法對(duì)其成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)以萜類為主，在0～10、10～30、30～60 min時(shí)單萜含量較高，倍半萜類成分含量較低，而在60～360 min時(shí)后者含量明顯升高；不同蒸餾時(shí)段迷迭香精油中含量最高的成分均為桉葉油醇，但其相對(duì)含量變化較大，分別為38.45%、34.52%、24.56%、13.65%。另外，不同蒸餾時(shí)段精油清除DPPH·、ABTS+·自由基的能力依次為60～360 min>30～60 min>10～30 min>0～10 min，表明酚類含量越高，清除DPPH·、ABTS+·的能力越強(qiáng)。