銀杏葉提取物防治內(nèi)耳疾病作用機制的研究進展

王青玲， 張夢嫻， 王慶林， 郭向東

(1.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046；2.河南醫(yī)學高等專科學校，河南 鄭州 451191；3.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

銀杏葉提取物(extract ofGinkgobiloba，EGB)是從銀杏的干燥葉中提取的含有黃酮類、萜類內(nèi)酯、有機酸等在內(nèi)的一百多種化學成分的混合物。EGB761是國際上按德國Schwabe專利工藝生產(chǎn)的標準銀杏葉提取物，商品名為金納多。它是利用醇溶液從銀杏的葉中提取出的混合物，成分復(fù)雜，含有24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內(nèi)酯。既往研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可通過清除自由基、改善凝血功能和血流動力學、降低炎癥反應(yīng)等多種機制延緩神經(jīng)退行性疾病、心腦血管疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物在治療感音神經(jīng)性耳聾、耳源性眩暈等內(nèi)耳疾病方面療效顯著，但其對內(nèi)耳疾病的保護機制尚不明確，因此，本文就銀杏葉提取物防治內(nèi)耳疾病的作用機制進行綜述。

1 銀杏葉提取物對老年性耳聾的保護作用

老年性耳聾主要分為感音性、神經(jīng)性、血管性、耳蝸傳導性四種類型。感音性老年性耳聾病變損傷在內(nèi)、外毛細胞(hair cell，HC)，神經(jīng)性老年性耳聾是耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(spiral ganglion cell，SGC)和神經(jīng)纖維的退行性變，血管性老年性耳聾病變在血管紋，耳蝸傳導性老年性耳聾病變在基底膜。老年性耳聾與內(nèi)耳微循環(huán)、谷氨酸過度釋放、氧化應(yīng)激介導的炎癥反應(yīng)、細胞凋亡增加和自噬降低等密切相關(guān)。杜政德等[1]發(fā)現(xiàn)，老年性耳聾大鼠的氧化應(yīng)激蛋白表達升高而抗氧化蛋白明顯下調(diào)，表明老年性耳聾與氧化應(yīng)激存在密切的關(guān)系。He等[2]認為，衰老會激發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)從而損傷耳蝸，這種炎癥反應(yīng)主要是通過各種耳蝸細胞(螺旋韌帶纖維細胞、HC和鄰近的支持細胞等)引起炎癥介質(zhì)的上調(diào)，其次是通過內(nèi)淋巴囊或螺旋靜脈從循環(huán)系統(tǒng)中迅速募集和浸潤炎癥細胞，表明炎癥反應(yīng)在老年性耳聾病程中起著不可忽略的作用。銀杏葉提取物可通過上述多重途徑降低耳蝸HC、SGC及血管紋等的損害，最終延緩老年性耳聾的發(fā)生發(fā)展過程。

楊琴等[3]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物聯(lián)合巴曲酶治療老年性耳聾能改善患者的聽功能和血液黏稠度。吳毅超[4]發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物和耳聾左慈丸治療能穩(wěn)定老年性耳聾患者的血流動力學、改善血管內(nèi)皮細胞功能，保障耳蝸組織的養(yǎng)分供給，有效提高治療有效率。銀杏葉提取物可能是通過減輕耳蝸血管閉塞，減少炎性因子釋放，提高線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合體I、IV和V的活性和氧化磷酸化水平，恢復(fù)耳蝸氧化還原平衡功能，改善衰老耳蝸微循環(huán)，進而延緩聽力損失和耳蝸損傷[5]。另外，老年性耳聾患者體內(nèi)谷氨酸釋放增加，導致Na+、Ca2+大量內(nèi)流，少量K+流出，伴有Cl-和水分子進入細胞內(nèi)，導致樹突急性水腫，從而引起內(nèi)耳細胞損傷和功能障礙，銀杏葉提取物可競爭性拮抗血小板活性因子(platelet-activating factor，PAF)的膜受體，阻斷PAF誘導的谷氨酸過度釋放，對抗興奮性神經(jīng)毒素誘發(fā)的組織學和形態(tài)學改變，進而降低內(nèi)耳神經(jīng)細胞對谷氨酸引起的神經(jīng)毒性的敏感性[6]。黃海林等[7]發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可減少mtDNA的氧化損傷，抑制老年大鼠聽覺器官線粒體DNA4834bp缺失突變，維持神經(jīng)元細胞線粒體的形態(tài)和數(shù)目,從而延緩大鼠老年性耳聾的進展。炎性因子(如IL-1等)易誘發(fā)耳蝸神經(jīng)細胞的凋亡，銀杏葉提取物可降低耳蝸神經(jīng)細胞炎性因子的釋放，抑制線粒體介導的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)的活性來阻止衰老耳蝸的細胞凋亡[8]。同時，c-Jun氨基末端激酶(c-JNK)參與衰老耳蝸的凋亡過程，其加速線粒體釋放細胞色素C(Cyt c)，促進細胞凋亡。銀杏葉提取物一方面是通過抑制ROS的聚集及線粒體去極化，顯著減輕氧化應(yīng)激，降低Cyt c釋放；另一方面是通過抑制IL-1誘導的趨化因子，減少Cyt c釋放。Cyt c下調(diào)抑制caspase-3的啟動及級聯(lián)放大反應(yīng)，促進抗凋亡因子Bcl-2轉(zhuǎn)錄，抑制促凋亡因子Bax釋放，使促凋亡的c-JNK失活和降解，從而“關(guān)閉”下游靶c-JNK，抑制凋亡途徑，保護老化的耳蝸神經(jīng)元細胞[9]。研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可通過激活A(yù)kt/mTOR途徑來調(diào)控自噬，增加神經(jīng)突起生長，從而改善阿爾茨海默病的癥狀[10]，但銀杏葉提取物能否通過增強耳蝸神經(jīng)細胞的自噬，進而延緩老年性耳聾的研究尚未見報道，需要進一步的研究。

2 銀杏葉提取物對突發(fā)性耳聾的保護作用

突發(fā)性耳聾是耳鼻喉科常見的急性癥狀，其發(fā)病機制尚不清楚。據(jù)報道，免疫系統(tǒng)障礙及電解質(zhì)紊亂誘導的耳蝸微循環(huán)異?？赡芘c突發(fā)性耳聾的生理病理機制息息相關(guān)[11]。細胞因子(如IL-1β、IL-2和TNF-α)及炎性細胞包括巨噬細胞、T淋巴細胞等，在調(diào)節(jié)內(nèi)耳的免疫反應(yīng)中起著重要作用。這些細胞因子或炎性細胞被刺激釋放后，部分被循環(huán)系統(tǒng)招募進入內(nèi)耳，進而對內(nèi)耳組織造成不可逆性損傷[12]。血管紋和血管周圍駐留的黑素細胞樣巨噬細胞構(gòu)成的血迷路屏障，是維持耳蝸內(nèi)電位所必需的，兩者均具有Na+-K+-ATP酶、Na+-K+-2Cl-轉(zhuǎn)運蛋白，K+通過一系列離子通道及轉(zhuǎn)運蛋白進入內(nèi)淋巴，使內(nèi)淋巴液維持低Na+和高K+狀態(tài)，從而維持內(nèi)耳穩(wěn)態(tài)。當上述K+離子的循環(huán)代謝發(fā)生障礙時，會使耳蝸內(nèi)電位(endocochlear potential，EP)改變，最終誘發(fā)突發(fā)性耳聾。

近年來，通過多中心、大樣本的臨床研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物治療突發(fā)性耳聾的臨床效果令人滿意。北京腦血管病防治協(xié)會[13]推薦采用銀杏葉提取物聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療突發(fā)性耳聾患者，可以明顯改善耳聾、耳鳴癥狀，且不良反應(yīng)少。同時，國外一項隨機、雙盲、多中心的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，EGB761聯(lián)合類固醇治療突發(fā)性耳聾患者，可顯著提高患者的言語識別率且具有很好的安全性[14]。王洪波等[15]發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可作用于細胞膜上的PAF，拮抗PAF誘導的血小板聚集及血栓形成，刺激內(nèi)皮舒張因子舒張迷路動脈，減輕供血不足導致的內(nèi)耳損傷，對于突發(fā)性耳聾的療效優(yōu)于丹參。同樣，王慧敏等[16]發(fā)現(xiàn)突發(fā)性耳聾患者血清免疫球蛋白和C反應(yīng)蛋白(CRP)表達升高，NO和超氧化物歧化酶(SOD)合成釋放降低，提示突發(fā)性耳聾的發(fā)病機制與免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)有關(guān)，而銀杏葉提取物聯(lián)合高壓氧治療突發(fā)性耳聾患者后，患者體內(nèi)免疫球蛋白及CRP水平較低，NO、SOD水平升高，說明銀杏葉提取物聯(lián)合高壓氧治療可提高血清抗體濃度，具有改善免疫功能、減輕炎癥反應(yīng)、降低氧化應(yīng)激、抑制細胞膜脂質(zhì)過氧化等作用，從而減輕聽力損失和耳蝸損傷。黃巧等[17]通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺獲取銀杏葉提取物的主要藥理學成分包括槲皮素、兒茶素、銀杏內(nèi)酯等活性化合物，從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得銀杏葉提取物活性成分對應(yīng)的靶點及突發(fā)性耳聾相關(guān)的靶點，構(gòu)建藥物成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物可能靶向作用于鉀電壓門控通道、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、脂聯(lián)素、一氧化氮合酶、caspase-3等多個靶點，參與細胞穩(wěn)態(tài)、凋亡與自噬的調(diào)控等多個生物學過程，并通過AMPK、TNF、p53、T細胞受體、PPAR等多條信號通路調(diào)節(jié)內(nèi)耳K+和Ga2+平衡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能、細胞凋亡，進而達到治療突發(fā)性耳聾的目的。雖然銀杏葉提取物已被列入突發(fā)性耳聾的診療指南，但由于目前缺乏有效的突發(fā)性耳聾動物模型，針對銀杏葉提取物作用于突發(fā)性耳聾機制方面的研究多局限于臨床研究，阻礙了銀杏葉提取物治療突發(fā)性耳聾機制的深入研究。

3 銀杏葉提取物對藥物性耳聾的保護作用

藥物性耳聾是指某些藥物的耳毒性所導致的內(nèi)耳細胞變性和聽覺障礙。大量報道發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物對順鉑、水楊酸鈉、慶大霉素等耳毒性藥物所致的聽力損傷有保護作用，其作用機制如下。

3.1 順鉑 順鉑是一種高效、應(yīng)用廣泛的化療藥物，但順鉑可損傷耳蝸HC，誘導SGC變性，間質(zhì)細胞丟失，導致不可逆的感音神經(jīng)性聽力損失[18]。

Dias等[19]對接受順鉑治療的癌癥患者進行前瞻性、雙盲、安慰劑試驗研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGB761具有顯著的抗氧化作用，對順鉑導致的聽力損傷具有一定療效。銀杏葉提取物可能是通過p53/NOX4/p66shc[20]、AMPK/SIRT1[21]和Akt-Nrf2-HO-1[22]等信號通路降低了耳蝸細胞的氧化應(yīng)激水平，保護耳蝸組織免受順鉑的損傷。Ma等[20]發(fā)現(xiàn)，p53在調(diào)節(jié)HC中ROS的生成、解毒及細胞凋亡方面起著重要作用，順鉑治療后，NOX4和p66shc的表達隨著p53表達的增加而上調(diào)，從而產(chǎn)生細胞毒性作用。銀杏內(nèi)酯B可通過p53介導的NOX4/p66shc信號通路減少超氧化物的產(chǎn)生，降低內(nèi)耳細胞凋亡，對順鉑誘導的耳聾起到保護作用。雷文靜等[21]發(fā)現(xiàn)AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能調(diào)節(jié)能量代謝、細胞穩(wěn)態(tài)及氧化應(yīng)激；SIRT1是AMPK下游的效應(yīng)蛋白，與細胞的氧化應(yīng)激、能量代謝密切相關(guān)。銀杏葉提取物可通過激活A(yù)MPK/SIRT1信號通路，使HEI-OC1細胞的氧化應(yīng)激水平降低，細胞活性提高，細胞凋亡減輕。研究表明核因子紅細胞系2相關(guān)因子(Nrf2)及其下游的血紅素加氧酶-1(HO-1)在細胞抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，Akt可激活Nrf2-HO-1抗氧化途徑。順鉑耳毒性抑制Akt活性，降低耳蝸HEI-OC1中Nrf2的表達，抑制Nrf2轉(zhuǎn)錄，阻斷Nrf2-HO-1途徑，導致ROS大量聚集，誘發(fā)氧化應(yīng)激[23]。Ma等[22]發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B對順鉑所致大鼠聽力損失和前庭功能障礙有明顯的保護作用，其可能是通過激活A(yù)kt信號，增強Nrf2-HO-1的抗氧化功能，減少ROS的產(chǎn)生，從而抑制線粒體凋亡，最終減輕順鉑對內(nèi)耳的損傷。

3.2 水楊酸鈉 水楊酸鈉是阿司匹林的有效成分，易穿過血腦屏障，長期使用水楊酸鈉會引起諸如感音神經(jīng)性聽力損失和耳鳴等副作用。N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA-R)是位于內(nèi)毛細胞(inner hair cell，IHC)和初級傳入神經(jīng)元之間的一種離子型谷氨酸受體，在水楊酸鈉致聾大鼠模型中，大劑量水楊酸鈉活化NMDA-R，伴隨Ca2+表達上調(diào)，刺激Ca2+依賴性酶，鈣超載降低線粒體膜電位，導致ATP合成受阻，能量供應(yīng)不足，進而損害內(nèi)耳神經(jīng)細胞[24]。耳蝸SGC上NMDA-R被激活后，損傷線粒體，促進Cyt c等凋亡因子釋放，誘發(fā)細胞凋亡，導致SGC毒性損傷，產(chǎn)生耳聾和耳鳴。銀杏葉提取物對水楊酸鈉引起耳聾的保護作用可能與抑制NMDA-R表達，降低Ca2+內(nèi)流，維持線粒體膜穩(wěn)定性，拮抗細胞凋亡等有關(guān)[25]。

3.3 慶大霉素 慶大霉素是最常用的氨基糖苷類藥物，其耳毒性為人們所熟知。Sagit等[26]用雌性SD大鼠觀察槲皮素對慶大霉素所致耳毒性的作用，發(fā)現(xiàn)槲皮素具有降低聽性腦干反應(yīng)(ABR)閾值和減弱HEI-OC1中caspase-3、caspase-9表達，表明槲皮素可減輕慶大霉素誘導的大鼠耳毒性和組織病理學損傷，對耳蝸細胞具有保護作用。

4 銀杏葉提取物對噪聲性聾的保護作用

噪聲性聾是導致成年人耳聾最常見的原因之一，近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物具有抗炎和抗氧化活性，并能保護耳蝸免受噪音誘發(fā)的聽力損失[27]。

譚君武等[28]將56例爆震性聾患者隨機分為對照組與治療組，與對照組比較，銀杏葉提取物聯(lián)合傳統(tǒng)高壓氧治療組耳聾、耳鳴的癥狀明顯改善，總有效率顯著提高。Sjostrand等[29]發(fā)現(xiàn)，噪音暴露后，雌性SD大鼠耳蝸內(nèi)ROS水平升高，引起細胞膜DNA突變和脂質(zhì)過氧化，最終導致內(nèi)耳的氧化應(yīng)激損傷。EGB761可通過清除耳蝸中過量的ROS，終止自由基連鎖反應(yīng)鏈，減弱其對膜蛋白的攻擊，減輕DNA損傷，促進DNA修復(fù)，從而延緩噪聲性聾的發(fā)生和發(fā)展。Castaneda等[30]發(fā)現(xiàn)，噪音暴露后，耳蝸線粒體呼吸鏈被破壞,線粒體膜電位低于閾值，ATP生成受到抑制，能量供應(yīng)不足會導致內(nèi)耳神經(jīng)細胞的損傷。EGB761治療后可改善線粒體的水腫并減輕其損傷，從而緩解噪聲性聾患者的聽力損失并抑制耳鳴。Krauss等[31]使用EGB761治療噪音暴露后的蒙古沙鼠，發(fā)現(xiàn)EGB761可通過維持線粒體膜穩(wěn)定性，降低血液黏度，改善耳蝸血液循環(huán)，進而延緩耳聾、耳鳴的發(fā)生。董穎婕等[32]發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物能通過增強錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性，抑制ROS產(chǎn)生，減輕HC氧化應(yīng)激，提高HC存活率，進而緩解脈沖所致噪聲性聾大鼠的聽功能下降。最近，該課題組人員通過對miR-183家族的研究，進一步證實EGB761對脈沖噪音所致大鼠聽力損傷具有保護效應(yīng)。miR-183家族表達下調(diào)可能是噪音性聽力損失的重要因素，EGB761是通過增強噪音暴露后耳蝸miR-183的表達、減輕耳蝸機械損傷，從而保護和修復(fù)聽力的[33]。另外，噪音后內(nèi)耳中的促炎細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平升高，這些炎癥因子可加重耳蝸HC損傷，銀杏葉提取物對噪聲性聾具有一定的保護作用，其機制可能與抑制IL-1β、IL-6、TNF-α釋放有關(guān)[34]?？傮w來說，銀杏葉提取物是通過降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平、調(diào)控micRNA等來保護耳蝸細胞免受噪音的損傷，然而噪聲性聾的發(fā)病機制相當復(fù)雜，還與谷氨酸的興奮性毒性及表觀遺傳學改變等引發(fā)的耳蝸帶狀突觸病相關(guān)，因此銀杏葉提取物對于噪聲性聾的保護機制仍需進一步的研究。

5 銀杏葉提取物對耳源性眩暈的保護作用

耳源性眩暈是指外周前庭系統(tǒng)感受異常引起的眩暈，涉及耳蝸、前庭、以及迷路外病變，主要包括良性陣發(fā)性位置性眩暈(BPPV)、梅尼埃病、迷路炎、前庭神經(jīng)元炎等。耳源性眩暈的病因涉及內(nèi)淋巴代謝障礙、免疫因素、感染等，其中血液流變學異常是耳源性眩暈病因之一。

臨床上應(yīng)用銀杏葉提取物治療耳源性眩暈已有數(shù)十年的歷史并取得了較好的臨床療效。研究發(fā)現(xiàn)，EGB761可抑制血管平滑肌細胞與交感神經(jīng)末梢釋放去甲腎上腺素，舒張血管平滑肌，增加內(nèi)耳末梢小動脈流量，降低血液黏稠度及血液運行阻力，改善前庭器官微循環(huán)，減輕眩暈癥狀，保護前庭功能[35]。BPPV是耳源性眩暈中發(fā)病率最高的一種疾病，耳石復(fù)位法是目前治療BPPV最安全、有效的方法，但部分患者復(fù)位成功后仍有頭暈等殘余癥狀存在。姚琦等[36]的研究證實EGB761能進一步改善患者的殘留頭暈癥狀，其增加紅細胞變形能力，抑制血小板凝集、提高血管壁彈性，從而改善前庭的微循環(huán)障礙、減輕內(nèi)耳代謝失常和橢圓囊的損傷、促進耳石在內(nèi)淋巴液中的吸收，起到對前庭神經(jīng)細胞保護作用。Lindner等[37]發(fā)現(xiàn)健康SD大鼠單側(cè)迷路切除術(shù)(unilateral labyrinthectomy，UL)后會導致前庭失衡，出現(xiàn)自發(fā)性眼球震顫、姿勢不對稱、眩暈等特征性體征，EGB761治療可能是通過調(diào)節(jié)前庭-眼球運動、前庭-脊髓等神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，提高運動行為和活動能力來改善前庭功能，從而促進UL后大鼠眼球震顫和姿勢不對稱的代償。目前對于銀杏葉提取物改善前庭功能、促進前庭代償?shù)臋C制研究多局限于血液流變學和功能學方面，今后需要從電生理和分子生物學的角度深入研究銀杏葉提取物對于前庭器官和前庭細胞的保護作用。

綜上所述，銀杏葉提取物針對內(nèi)耳疾病的防護是通過消除自由基、維持線粒體膜穩(wěn)定性、改善血液流變學、抑制炎癥因子釋放、抗細胞凋亡、減輕谷氨酸細胞毒性等多種機制共同發(fā)揮作用，由于內(nèi)耳疾病的發(fā)病機制復(fù)雜，最新研究發(fā)現(xiàn)miRNA及相關(guān)信號通路調(diào)控的細胞自噬也參與到了多種內(nèi)耳疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中，因此，還需要更多的臨床研究和基礎(chǔ)實驗來全方位、多層次、多角度探討銀杏葉提取物保護內(nèi)耳的機制，為臨床上使用銀杏葉提取物治療內(nèi)耳疾病提供更多的參考依據(jù)。