超聲波輔助液-液萃取結合GC檢測單萜化合物工藝優(yōu)化

劉 琦 祝 霞 趙丹丹 王璐璐 韓舜愈 楊學山

(1甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院,甘肅 蘭州 730070;2甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅 蘭州 730070;3 甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室,甘肅 蘭州 730070)

品種香氣決定了葡萄酒的特點和典型性[1],構成品種香氣的物質主要包括萜烯類化合物、降異戊二烯等。其中,單萜化合物感官閾值較低,具有濃郁的花香、果香味[2-3],如芳樟醇具有輕微的柑橘味和淡淡的玫瑰花香,α-萜品醇具有類似紫丁香花香、百合花香,香茅醇具有檸檬和柑橘香,香葉醇具有玫瑰花香,且它們的感官閾值在18～400 μg·L-1,遠低于葡萄酒中其他香氣物質,是葡萄酒品種香氣最主要的貢獻者[4-5]。早期研究認為,葡萄酒中的單萜化合物主要來自釀酒葡萄原料本身,而主導葡萄酒發(fā)酵的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞內不存在單萜合成酶,不能合成單萜化合物[6-7]。但Camesasca 等[8]研究發(fā)現釀酒酵母BY4743 菌株可在不含單萜前體物質的模擬葡萄汁中從頭合成單萜化合物。此外,Carrau 等[9]將釀酒酵母菌株M522 接種到化學合成的模擬葡萄汁中,發(fā)酵結束后在其發(fā)酵液中檢出了葡萄酒中常見的芳樟醇、α-萜品醇、香葉醇、香茅醇等4種單萜化合物,且適當增加模擬汁中可同化氮含量以及減少發(fā)酵過程中通氧量均有利于單萜物質的積累。但釀酒酵母產生的單萜化合物含量較少[8-9],因此,建立準確、高效、重復性高的單萜物質檢測方法將有助于進一步深入研究其代謝機制。

氣相色譜(gas chromatography,GC)具有操作簡單、儀器價格和樣品檢測費用較低以及易于實現等優(yōu)點,現已被廣泛應用于葡萄酒香氣分析領域[10]。通常在氣相色譜分析之前需對樣品中的香氣物質進行富集處理,以滿足分析檢測,目前主要使用的香氣富集方法有頂空固相微萃取 (headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)[11]、低沸點有機溶劑的液-液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)[12]、固相微萃取[13]等。LLE 主要利用“相似相溶”原理對香氣物質進行富集濃縮,由于單萜化合物在有機相中的分配系數較高,因而可用于單萜化合物的萃取研究。Andujar-Ortiz 等[14]結合氣相色譜- 質譜聯用儀(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)技術,比較了LLE、固相萃取(solid-phase extraction,SPE)以及HS-SPME 3種前處理方法在葡萄酒香氣物質檢測中的效果,結果表明,LLE 顯現出良好的線性與重復性,萃取效果較好。然而,LLE 也存在一些弊端,如使用有機溶劑量大、操作步驟繁瑣且耗時長等[15]。目前,超聲波在分離提取研究中應用較多,主要是利用超聲波產生的“空化效應、熱效應、強化擴散”等多種效應增強萃取過程中的傳質作用,增大待分離物質分子運動頻率和速度,使目標成分更容易進入溶劑,從而提高萃取效率[16-17]。羅靜等[18]利用超聲輔助處理提取鮮桃果實中揮發(fā)性物質,Porto 等[19]比較單純浸漬與超聲輔助法提取大麻中揮發(fā)性萜類化合物,Li 等[20]利用超聲輔助法提取葡萄果皮中花青素,上述研究均表明,超聲輔助提取能明顯提高目標成分的提取含量,大大縮短提取時間。但目前超聲波輔助提取技術在葡萄酒香氣富集前處理中應用較少。

在葡萄酒發(fā)酵過程中,葡萄果實中的單萜化合物前體物質會被釀酒酵母菌株產生的β-糖苷酶水解釋放,會對釀酒酵母菌株合成單萜化合物的檢測產生影響。故本試驗擬采用無糖苷前體的模擬葡萄汁體系,通過單因素及響應面試驗優(yōu)化超聲輔助LLE的香氣檢測前處理工藝,并結合GC 外標定量法,建立一種相對準確、高效、可同時檢測多種單萜化合物的方法,探討釀酒酵母菌株從頭合成單萜化合物的能力,旨在為深入研究釀酒酵母菌株單萜化合物合成機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

釀酒酵母菌株LA-FR,購自上海鼎唐國際貿易有限公司。

1.2 試劑與儀器

主要試劑:芳樟醇、α-萜品醇、香葉醇、香茅醇標準品,均購自美國Sigma公司;二氯甲烷,國產色譜純;NaCl為國產分析純。

主要儀器:PHS-3C pH 計,上海雷磁有限責任公司;PAL-2數顯手持糖度計,日本愛宕ATAGO公司;L550 臺式低速離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司;JY96-IIN 超聲波細胞粉碎機,寧波新芝生物科技股份有限公司;RE600A型旋轉蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;Clarus500 GC-FID,美國PerkinElmer公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 模擬葡萄汁的配制 參考劉琦等[21]的方法。碳源:葡萄糖200 g·L-1、纖維二糖0.2 g·L-1;氮源:磷酸氫二銨1.5 g·L-1;酸:酒石酸氫鉀2.5 g·L-1、L-蘋果酸3.0 g·L-1、檸檬酸0.2 g·L-1;礦物質:磷酸氫二鉀1.14 g·L-1、硫酸鎂1.23 g·L-1,SO2添加量為40 mg·L-1。

1.3.2 釀酒酵母菌株活化與模擬汁發(fā)酵 參考王媛等[22]的方法并略做修改。將釀酒酵母干粉溶于10倍體積無菌水中,37℃靜置溶解20 min,再加入等體積的模擬葡萄汁于28℃活化25 min,按推薦用量(0.2 g·L-1)將活化好的釀酒酵母菌株接種到模擬葡萄汁中,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵5 d,待發(fā)酵結束后取模擬酒樣離心(4 000 r·min-1、15 min),取上清液用于后續(xù)試驗。

1.3.3 氣相色譜- 氫火焰離子化檢測器(gas chromatography-hydrogen flame ionization detector,GCFID)分析條件 參考李艷等[10]的方法并略作修改。色譜柱為DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:氮氣,流速2 mL·min-1;升溫程序:初始溫度為40℃,保持5 min,以15℃·min-1升溫至180℃,保持1 min,以15℃·min-1升溫至230℃,保持1 min;1 μL 樣品分流進樣,分流比為5 ∶1;進樣口溫度:250℃;檢測溫度:280℃;尾吹:25 mL·min-1;氫氣流量:45 mL·min-1,空氣流量:450 mL·min-1。

1.3.4 單萜化合物標準曲線的建立 以二氯甲烷為溶劑配制不同種類單萜化合物的標準品溶液,先配制濃度為5 μL·mL-1的母液,再將其用二氯甲烷分別稀釋2、10、20、100、200和1 000倍,利用GC-FID 測定相應的峰面積,以標準品質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線,試驗重復3次。

1.3.5 單萜化合物含量計算 根據GC-FID所測模擬酒樣品中芳樟醇、α-萜品醇、香茅醇、香葉醇4種單萜物質的峰面積,結合標準曲線計算得到測定樣品中各單萜化合物的含量,并以樣品中檢出的單萜化合物的總量作為考查指標進行LLE 工藝條件優(yōu)化。

1.3.6 單因素試驗設計

1.3.6.1 超聲功率對單萜化合物萃取的影響 取1.3.2 獲得的模擬酒樣上清液15 mL 于50 mL 錐形瓶中,加入等體積的二氯甲烷和4.5 g NaCl,渦旋震蕩5 min,超聲萃取15 min,超聲功率分別為300、400、500、600 W。然后將萃取體系4 000 r·min-1離心10 min,抽提得到上層水相并重復上述操作進行第二次萃取,合并2次萃取后的有機相,旋蒸(20℃)濃縮至約1 mL,再用二氯甲烷復溶至3 mL,吸取復溶液1 μL進行氣相色譜分析。試驗重復3次,比較單萜含量,確定較佳超聲功率值。

1.3.6.2 超聲時間對單萜萃取的影響 取1.3.2 獲得的模擬酒樣上清液15 mL 于50 mL 錐形瓶中,加入等體積的二氯甲烷和4.5 g NaCl,渦旋震蕩5 min,超聲萃取,超聲功率400 W,超聲時間分別為5、10、15、20 min。其余操作同1.3.6.1,比較單萜含量,確定較佳超聲時間。

1.3.6.3 NaCl 添加量對單萜萃取的影響 取1.3.2獲得的模擬酒樣上清液15 mL 于50 mL 錐形瓶中,加入等體積的二氯甲烷,NaCl的添加量分別為3.0、4.5、6.0、7.5 g,渦旋震蕩5 min,超聲時間15 min,超聲功率400 W。其余操作同1.3.6.1,比較單萜含量,確定較佳NaCl 添加量。

1.3.6.4 萃取劑體積對單萜萃取的影響 取1.3.2獲得的模擬酒樣上清液15 mL 于50 mL 錐形瓶中,分別加入5、10、15、20 mL 二氯甲烷和4.5 g NaCl,渦旋震蕩5 min,超聲時間15 min,超聲功率400 W。其余操作同1.3.6.1,比較單萜含量,確定較佳萃取劑體積。

1.3.7 響應面試驗設計 在單因素試驗結果的基礎上,利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應面試驗設計,以單萜含量為響應值,設計4 因素3水平響應面試驗進行萃取條件的優(yōu)化(表1)。

表1 響應面試驗因素與水平Table1 Factors and levels of response surface test

1.4 數據處理

利用Microsoft Excel 2010 對試驗所得數據進行分析和制圖,用IBM SPSS Statistics 20進行顯著性分析(Duncan 法,P＜0.05),采用Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應面試驗設計及回歸分析。

2 結果與分析

2.1 單萜物質的標準曲線

由表2可知,4種單萜化合物標準曲線線性范圍滿足檢測要求,且其決定系數(R2)均在0.996 2～0.999 6 范圍內,表明線性關系良好。試驗的重復性用相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)來表示,4種單萜標準曲線的RSD 在6.35%～10.06%范圍內,表明試驗重復性較好,可用于這4種單萜物質的定量分析。

表2 單萜物質的GC-FID 分析結果Table2 GC-FID analysis results of monoterpenes

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 超聲功率對單萜化合物萃取的影響 由圖1-A可知,隨著超聲功率從300 W 增大至600 W,單萜含量呈先增加后減小的趨勢,且超聲功率為400 W時,單萜含量達到最大,為41.003 μg·L-1。超聲輔助提取主要是利用超聲波產生的機械作用和空化效應促使有效成分進入溶劑,但當超聲功率過高時可能會破壞有效成分的結構,同時可能有其他雜質溶入,導致提取效果降低[23-24],因此后續(xù)試驗的超聲功率選擇400 W 較適宜。

2.2.2 超聲時間對單萜化合物萃取的影響 由圖1-B可知,隨著超聲時間的延長,單萜含量緩慢上升,當超聲時間為15 min時,單萜含量最高,但當超聲時間超過15 min時,單萜含量降低,這可能是由于超聲時間過長,超聲過程中產生的熱量導致溶液溫度升高,增加了單萜物質的揮發(fā),從而造成檢出的單萜含量降低,所以后續(xù)試驗的超聲時間選擇15 min 較佳。

2.2.3 NaCl 添加量對單萜化合物萃取的影響 在LLE 過程中添加無機鹽是常見的提高萃取效率的措施,無機鹽在水相中以水合離子的形式存在,促使水相中微量的香氣物質進入有機相,從而提高萃取效果[25-26]。由圖1-C可知,當NaCl 添加量從3.0 g 增加至4.5 g時,單萜含量增加了91.27%,當繼續(xù)加大NaCl 添加量,單萜含量變化較小。添加適量的NaCl能明顯提高萃取效果,這主要是由于中性鹽溶于水相后形成的陰陽離子會破壞香氣物質在水相中的溶解平衡,降低其在水相中的溶解度,且NaCl 溶于水會增加溶液的極性,促使水相中極性較低的香氣物質聚集和釋放[27-28]。當添加4.5 g NaCl時,溶液已接近飽和狀態(tài),繼續(xù)添加NaCl 對萃取效率提升較小,因此萃取過程中添加4.5 g NaCl 較為合適。

2.2.4 萃取劑體積對單萜化合物萃取的影響 由圖1-D可知,單萜含量隨萃取劑體積的增加而迅速升高,且當二氯甲烷體積為15 mL時單萜含量最高,此時單萜含量為43.15 μg·L-1,當二氯甲烷體積超過15 mL時,單萜含量出現略微下降,這可能是由于LLE的步驟較多,且二氯甲烷沸點低、易揮發(fā),隨著萃取劑體積的增加,萃取過程中溶劑損失也隨之增加,導致可檢測出的單萜含量減少,因此選擇二氯甲烷體積為15 mL較為適宜。

圖1 單因素試驗結果Fig.1 Results of the single factor test

2.3 響應面法優(yōu)化LLE 工藝

2.3.1 響應面試驗結果 以單因素試驗結果為基礎,通過響應面試驗優(yōu)化模擬酒樣中單萜化合物的萃取工藝,響應面的具體因素水平組合及試驗結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計及結果Table3 Response surface test design and results

2.3.2 響應面回歸模型的方差分析及顯著性檢驗 利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表3所得結果進行回歸建模分析,并對所得回歸模型做方差分析及顯著性檢驗,結果如表4所示,其中交互項AB、AC、AD、BC的P值均大于0.05,說明它們之間的交互作用不顯著,屬于模型中的冗余參數,因而需對回歸模型進一步優(yōu)化。回歸模型經逐步優(yōu)化后得到表5,相比優(yōu)化前的回歸模型,其矯正決定系數變大,變異系數變小,表明模型更優(yōu),對試驗結果的擬合度更高。由表5和表6可知,模型通過檢驗(P＜0.000 1),具有統(tǒng)計學意義。模型失擬項不顯著,即試驗中的數據可以用模型來解釋。決定系數R2=0.970 7,矯正決定系數表明回歸方程對該試驗數據的擬合度較高,能解釋試驗中97.07%的全部變異進一步說明該模型具有良好的可信度,因而可利用該模型進行LLE的工藝參數優(yōu)化。經回歸建模分析,最終得到的響應面回歸方程為Y= - 356.263 + 1.108A+ 9.361B+21.187C+ 7.010D-0.010AC-0.077BD-0.227CD-0.001A2-0.271B2-1.395C2-0.153D2,由回歸分析結果可知,4個因素對萃取效率影響的主次順序為超聲功率＞NaCl 添加量＞萃取劑體積＞超聲時間。

2.3.3 響應面交互作用分析結果 響應面分析圖中,顏色從藍色到紅色變化表示單萜含量從低到高,響應面為凸面表示試驗指標具有最大值,響應面坡度越大,即因素對試驗結果的影響越顯著;等高線的形狀可直觀反映因素間交互作用的強弱,橢圓表示因素間交互作用較強,接近圓形則表示因素間交互作用較弱[29-30]。圖2-a 沿A 軸方向較陡,沿C 軸方向較為平緩,表明與NaCl 添加量相比,超聲功率對單萜含量影響更大,且在不同NaCl 添加量的條件下,超聲功率變化對單萜含量影響較小,即超聲功率與NaCl 添加量2個因素間的交互作用較弱。由圖2-b可知,隨著超聲時間的延長,單萜含量呈先增大后減小的趨勢,并在15 min 附近具有最大值。當萃取劑體積增加到約15 mL時,單萜含量達到最大值,繼續(xù)增加萃取劑體積,單萜含量變化較小。在不同超聲時間下,萃取劑體積對單萜含量影響較大,即超聲時間和萃取劑體積間的交互作用較強。由圖2-c可知,NaCl 添加量和萃取劑體積對單萜含量影響的趨勢相似,均對單萜含量影響較大,等高線為橢圓,說明二者交互作用明顯,且響應圖中所反映的因素間的交互作用與回歸方程的顯著性分析結果一致。

表6 回歸模型可信度分析Table6 Confidence analysis of regression model

2.3.4 響應面工藝優(yōu)化與驗證試驗 對回歸方程進行最大值求解得到最優(yōu)工藝參數,為了驗證回歸模型所確定的最優(yōu)條件的正確性,結合實際操作對最優(yōu)參數略作調整后進行3次驗證試驗,驗證試驗所得單萜含量為44.06 μg·L-1,與理論預測值相近,誤差較小(表7)。由此可見,該回歸模型所優(yōu)化的工藝參數具有較高的可行性,可應用于實際萃取。

表7 最優(yōu)工藝參數及驗證試驗結果Table7 Optimal process parameters and results of verification tests

3 討論

定性定量分析依舊是葡萄酒香氣研究的熱點與難點,盡管現已開發(fā)出多種新型香氣富集設備和方法,但各有優(yōu)缺點。LLE 作為一種傳統(tǒng)技術在揮發(fā)性物質萃取中已有廣泛應用。牛云蔚等[31]比較了LLE、攪拌棒吸附萃取HS-SPME3種香氣富集方法對櫻桃酒香氣成分的影響,結果表明,用3種方法萃取后經GC-MS 檢出的香氣物質差異較大,其中HS-SPEM處理后檢出的香氣物質總量最高,LLE處理后檢出的香氣物質種類最多。Ivanova 等[32]通過LLE 結合GC-MS 技術建立了一種分離和檢測葡萄酒中揮發(fā)性成分的分析方法,利用該方法繪制的標準曲線R2在0.995 1～0.999 2范圍內,且樣品檢測RSD＜10%,表明該方法重復性較好。Cabredo-Pinillos 等[33]在進行葡萄酒中揮發(fā)性化合物的提取研究中比較己烷、石油醚、戊烷、二氯甲烷和乙醚5種有機溶劑的萃取效果,其中二氯甲烷萃取效果最佳。此外,不同溶劑在萃取過程中基質效應差異較大,對目標物質分析產生的干擾也明顯不同,影響分析結果的準確性[34]。二氯甲烷與單萜化合物極性相似,萃取過程中產生的基質效應較弱,當選用乙醇、丙酮、石油醚等溶劑萃取時,基質效應較強,導致萃取效果不佳,因此本研究選擇二氯甲烷作為單萜化合物的萃取劑。

圖2 各因素間交互作用對單萜含量影響的響應面Fig.2 Response surface of interaction between various factors on monoterpene content

前人研究表明,葡萄酒中的單萜化合物絕大部分來自葡萄果實中以糖苷態(tài)形式存在的單萜前體物質,在發(fā)酵過程中經釀酒酵母產生的糖苷酶將其水解并釋放[1,35]。近年來有文獻報道,葡萄酒中的單萜化合物并非只來自葡萄原料本身,酵母細胞也可能合成少量單萜化合物。早前有學者指出,僅有幾種非釀酒酵母(non-Saccharomyces cerevisiae)可以合成微量單萜化合物,如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、戴爾有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)、檸檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)、美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)等[9]。原苗苗等[36]在模擬葡萄汁中比較了3株非釀酒酵母的產香特性,在其發(fā)酵液中共檢測出7種單萜化合物,表明非釀酒酵母確實能從頭合成單萜化合物,且不同非釀酒酵母合成單萜化合物的能力也有差異,其中淺白隱球酵母產單萜能力最強,在其發(fā)酵液中共檢測到0.70 mg·L-1的單萜化合物;此研究選用的對照菌株為釀酒酵母DV10,在其發(fā)酵液中也檢測到單萜化合物,且單萜物質的含量高于3種非釀酒酵母,所以釀酒酵母也可以從頭合成單萜物質。在本研究中檢測到44.06 μg·L-1的單萜化合物,進一步證實釀酒酵母菌株可以從頭合成單萜化合物,但釀酒酵母合成單萜化合物的合成途徑與內在機制尚不清楚。Carrau 等[9]在研究釀酒酵母合成單萜化合物時發(fā)現,釀酒酵母細胞內存在與甲基巴豆酰-CoA 羧化酶(methyl crotonyl-CoA carboxylase,MCC)具有同源性的幾種蛋白序列,該酶是亮氨酸分解代謝以及單萜化合物合成的關鍵酶,對釀酒酵母蛋白質序列進行Blast 比對發(fā)現,釀酒酵母細胞中確實存在與其他物種MCC 同源的蛋白序列,因而推測釀酒酵母合成單萜化合物可能與其細胞內亮氨酸分解代謝有關,但該途徑尚未得到進一步證實。此外,釀酒酵母還具有代謝補充單萜的能力,如香葉醇可在發(fā)酵過程中轉化為香茅醇,香茅醇可轉化為芳樟醇,少量香葉醇也可異位成芳樟醇[37-38],還有文獻報道,芳樟醇可環(huán)化成α-萜品醇,橙花醇可異構成香葉醇和α-萜品醇等[39]。因此本研究在模擬葡萄汁中檢出的單萜化合物可能有不同的來源,有些單萜可能是酵母從頭合成,有些單萜可能是其他單萜經釀酒酵母生物轉化而來,釀酒酵母菌株合成與轉化單萜化合物的內在機制尚不清楚,有待后續(xù)深入探究。

4 結論

本試驗利用氣相色譜建立了芳樟醇、α-萜品醇、香葉醇、香茅醇4種單萜化合物的標準曲線,通過單因素和響應面試驗對模擬酒中單萜化合物的萃取工藝進行優(yōu)化,得到的最優(yōu)萃取工藝參數為:超聲功率405 W,超聲時間15 min,NaCl 添加量4.9 g,萃取劑體積15.5 mL,在此條件下結合GC檢測,建立了一種相對高效且準確性、重復性高的單萜化合物檢測方法。利用本試驗建立的方法,在模擬葡萄酒中檢測到有少量單萜化合物生成,證實了LA-FR 釀酒酵母菌株可以從頭合成單萜化合物,進而為深入研究單萜化合物合成機制奠定了一定的理論基礎。