中生菌素對Erwinia amylovora抑菌效果及庫爾勒香梨生長安全性評價

摘" 要：【目的】研究不同濃度梯度下中生菌素對梨火疫病的抑制效果，以及在庫爾勒香梨發(fā)育的不同時期是否產(chǎn)生藥害，旨在評價中生菌素對梨火疫病菌的抑菌效果及其對庫爾勒香梨生長的安全性影響，為中生菌素在果樹病害防治中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。【方法】采用抑菌圈法分析42.62%中生菌素原藥在100、200、400、800和1 600稀釋倍數(shù)條件下的抑菌圈直徑大小、抑菌率和對梨火疫病菌的毒力，并對不同稀釋后的抑菌效果做了安全性評價。【結(jié)果】結(jié)果顯示，稀釋倍數(shù)在100～1 600倍范圍內(nèi)其對梨火疫病抑菌率為65.34%～77.67%，抑制圈平均直徑和抑菌率隨著中生菌素原藥稀釋倍數(shù)的增加呈現(xiàn)下降變化趨勢，100～400倍稀釋條件下抑菌圈平均直徑差異不顯著，800～1 600稀釋條件下抑菌圈平均直徑顯著或極顯著下降；噴藥結(jié)束后的第120 h時中生菌素藥害趨于穩(wěn)定，EC50值為23.021 mg/L；隨著稀釋倍數(shù)的不斷增加，藥害指數(shù)在花芽萌動期、花期和幼果期均表現(xiàn)為下降變化，且藥害指數(shù)在0～200倍稀釋范圍內(nèi)的下降速率顯著高于200～1 200倍稀釋范圍?！窘Y(jié)論】結(jié)合中生菌素對梨火疫病菌的抑菌效果和中生菌素對梨火疫病菌的毒力比較可以確定，42.62%中生菌素在200～400倍稀釋范圍內(nèi)使用對庫爾勒香梨火疫病菌防治效果最佳。

關(guān)鍵詞：庫爾勒香梨；火疫病菌；中生菌素；毒力測定；安全性評價

文章編號：2096-8108（2024）06-0030-05" 中圖分類號：S661.2中圖分類號" 文獻標(biāo)識碼：A文獻標(biāo)志碼

收稿日期：2024-08-10中文收稿日期

基金項目：兵團財政科技計劃資助重點領(lǐng)域科技攻關(guān)計劃項目（2018AB038）

第一作者簡介：何家靜（1998-），女，碩士研究生，主要從事植物病害防治研究。E-mail： 1486135382@qq.com

*通信作者：張王斌（1974-），男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail： zwbzky@163.com

Evaluation of Antibacterial Effect of Zhongshengmycin on Erwinia amylovora and Growth Safety of Korla Fragrant Pear

HE" Jiajing，MA" Xiangyu，LIU" Zhenya，LI" Yapeng，ZHANG Wangbin*

（Tarim University， The nationa land local joint engineering laboratory of high efficiency and superior-quality cultivation and fruit deep processing technology of characteristic fruit treesin SouthXinjiang; Key lab of Xinjiang production and construction corps in comprehensive agricultural pest management in Southern Xinjiang; Scientific observing and experimental station of crop pests in Alar， Ministry of agriculture and rural affairs， Alar Xinjiang 843300， China）

Abstract： 【Objective】The inhibitory effect of Zhongshengmycin on pear fire blight bacteria under different concentration gradients and whether it caused phytotoxicity at different stages of Korla fragrant pear development were studied. The purpose was to evaluate the antibacterial effect of Zhongshengmycin on pear fire blight bacteria and its safety effect on the growth of Korla fragrant pear， and to provide scientific basis for the application of Zhongshengmycin in the prevention and control of fruit tree diseases.【Methods】 The size of the inhibition， the virulence of 4200，200，100，100，800 and 1 600， and the safety of different dilutions was evaluated.【Results】The results show that， from 100 to 1 600 times， 65.34% to 77.67%， The average diameter of the inhibitory circle and the antibacterial rate showed a decreasing trend with the increase of the dilution ratio of Zhongshengmycin， No significant difference in mean coil diameter between 100 to 400-fold dilution， The average diameter of the bacteriosphere was significantly or significantly decreased between 800 and 1 600 dilutions; At 120 h after the end of spraying， The EC50 value is 23.021 mg/L; With the increasing dilution ratio， The drug damage index showed decreasing changes in the budding， flowering and young flower stage， Moreover， the decrease rate of the drug harm index in the 0-to 200-fold dilution range was significantly higher than the 200-to 1，200-fold dilution range.【Conclusion】Combine the antibacterial effect of isocin on pear fire blight bacteria and the virulence of mesocin on pear fire blight bacteria. 42.62% of isocin had the best control effect in 200 to the 400 times dilution range.

Keywords：Korla fragrant pear; fire blight bacteria; Zhongshengmycin; virulence determination; safety evaluation

梨火疫病是由解淀粉歐文氏桿菌（Erwinia amylovora）引起的危害性較強的植物病害［1］，能夠?qū)е露喾N薔薇科植物的毀滅性病害［2］，被我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為一類農(nóng)作物病害。庫爾勒香梨是新疆地區(qū)重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟支持型樹種，當(dāng)前梨火疫病在新疆各地逐步擴散，給香梨生產(chǎn)帶來重創(chuàng)以及不可估量的經(jīng)濟損失［3-4］。因此，科學(xué)有效的防治該梨火疫病對新疆果業(yè)發(fā)展具有重要意義。

目前國內(nèi)對梨火疫病的防治大多采用農(nóng)用抗生素化學(xué)藥劑［5］，但許多藥劑的藥害副作用很大，對生態(tài)環(huán)境影響以及香梨的生長發(fā)育帶來了諸多不良影響。前人對多種抑制藥劑做出研究與測評，劉朋飛等［6］采用比濁法對梨火疫病菌6種殺菌劑毒力進行測定，發(fā)現(xiàn)6種殺菌在對抗梨火疫病菌均有很強的毒力作用。呂振豪等［7］為篩選出防治梨火疫病高效低毒藥劑，選用等10種藥劑進行田間實驗，發(fā)現(xiàn)4%春雷霉素對梨火疫病的防治效果最優(yōu)。Georg等［8］對29種藥劑的進行有篩選，并未篩選出比鏈霉素更有效的防治藥劑。出于對環(huán)境和人類健康的考慮，一些國家對部分藥劑做出禁止規(guī)定［9］。因此選取低毒且有效的防治藥劑十分必要。中生菌素是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究所創(chuàng)制的生物農(nóng)藥品種［10］，作為一種廣譜的抗生素，對農(nóng)作物細(xì)菌性病害及某些真菌性病害具有良好的防治效果，能夠有效地控制庫爾勒香梨梨火疫病害的發(fā)生。鑒于此，本文探討了不同濃度梯度下中生菌素對梨火疫病的抑制效果，以及在庫爾勒香梨發(fā)育過程中不同時期是否產(chǎn)生藥害，旨在評價中生菌素對梨火疫病菌的抑菌效果及其對庫爾勒香梨生長的安全性影響，為中生菌素在果樹病害防治中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

1.1.1" 供試菌株

梨火疫病原菌（Erwinia amylovora）由中國檢驗檢疫研究院提供。試驗前先將梨火疫病菌（4 ℃冰箱保存）在LB固體培養(yǎng)基上復(fù)壯，經(jīng)純化后接種到LB液體培養(yǎng)基中，最后在220 r/min、28 ℃的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)48 h備用。

1.1.2" 試驗藥劑

42.62%中生菌素原藥，陜西麥可羅生物科技有限公司，100 g，粉劑。

1.1.3" 培養(yǎng)基

1）Luria-Bertani固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉15 g，加無菌水至1 L，調(diào)pH值至7.0左右，121 ℃高溫滅菌20 min。

2）Luria-Bertani液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加無菌水至1 L，將pH值調(diào)至7.0，最后在121 ℃高溫條件下滅菌20 min。

1.1.4" 菌懸液

用移液槍槍頭刮取菌種至裝有Luria-Bertani液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，設(shè)置搖床溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速為220 r/min培養(yǎng)48 h，搖好的菌液倒入50 mL離心管中用冷凍離心機5 000 r/min離心10 min，倒出上清液，加入無菌水，配成菌懸液，以無菌水為對照，分光光度儀固定波長600 nm，測得OD值為0.3～0.4。

1.2" 試驗方法

1.2.1" 試驗設(shè)計

1）室內(nèi)毒力測定試驗。試驗采用抑菌圈法，根據(jù)前期試驗確定中生菌素對梨火疫病菌的有效抑制濃度范圍，將42.62%中生菌素原藥在有效抑制濃度范圍稀釋到625、1 250、2 500、5 000和10 000 mg/L5個不同濃度處理，并以無菌水作為對照處理。將Luria-Bertani固體培養(yǎng)基融化后冷卻至45 ℃，后與菌懸液以10∶1的體積比混合并充分震蕩搖勻制成帶菌的Luria-Bertani固體培養(yǎng)基，后倒入平板培養(yǎng)皿并用0.6 cm打孔器在培養(yǎng)皿中心打孔，用移液槍吸取10 ul的供試藥劑打在孔洞中，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后用十字測量法測量抑菌圈大小，每個處理重復(fù)4次。

2）藥劑對庫爾勒香梨生長期安全性評價試驗。試驗在塔里木大學(xué)園藝試驗站（40°32′ N，81°17′ E）梨樹園進行。該梨園面積約2 500 m2，主栽品種庫爾勒香梨，株行距1.5 m×4.5 m，樹形為主干型，多年生，在樹行距種植豆科植物長毛野豌豆和三葉草。該地區(qū)屬于暖溫帶大陸性干旱氣候區(qū)，海拔為1 012 m，年平均氣溫為11.72 ℃，年平均無霜期為213 d，年降水量為25.30" mm。

根據(jù)室內(nèi)毒力測定結(jié)果確定藥劑濃度梯度，將42.62%中生菌素原藥在有效區(qū)間內(nèi)按照其有效濃度分別稀釋至6個不同濃度，藥劑有效成分濃度由高到低分別為66 666、22 222、7 407、2 469、823、400 mg/L，以清水作為對照，不同濃度藥劑裝入噴壺中備用。

采用單對角線取樣法選擇試驗梨樹，將梨園均勻地劃成數(shù)個小區(qū)，然后在小區(qū)的一條對角線上均勻選擇2～3株果樹。在果樹的花芽萌動期（3月27日）、花期（3月30日）、幼果期（4月19日）分別進行噴藥。每株庫爾勒香梨樹東西南北4個方位選擇數(shù)量均勻的花簇進行噴藥，每個濃度藥劑噴灑10簇花序為一組，每組重復(fù)3次并掛牌標(biāo)記，每次施藥保證施藥部位出現(xiàn)薄薄的水膜，盡量避免施藥部位大量藥水堆積，水分蒸發(fā)后局部區(qū)域藥劑濃度升高產(chǎn)生藥害，使用統(tǒng)一規(guī)格噴瓶，每次噴藥量為0.1 mL，花芽萌動期因為花芽較小，每個花芽噴灑0.1 mL即可形成水膜，花期花簇面積較大噴灑0.5 mL即可形成水膜，幼果期每個幼果噴灑0.2 mL即可形成水膜。每次噴藥后24 h、48 h和120 h進行調(diào)查。

1.2.2" 調(diào)查方法

1）根據(jù)調(diào)查結(jié)果，記錄各處理濃度的抑菌圈直徑（cm），以0.6 cm作為基準(zhǔn)，結(jié)果保留小數(shù)點后兩位。

抑菌率/%=（藥劑處理組抑菌圈直徑-對照組抑菌圈直徑）/藥劑處理組抑菌圈直徑×100

2）按植物器官藥害分級對藥害情況進行記錄，并且使用Excel軟件整理數(shù)據(jù)計算藥害指數(shù)，使用Origin軟件進行作圖，觀察分析藥害指數(shù)隨藥劑稀釋倍數(shù)變化情況（見表1）。

藥害指數(shù)=［∑（藥害器官數(shù)×相應(yīng)藥害級數(shù)）/（調(diào)查總器官數(shù)×最高藥害級數(shù)）］×100

1.3" 數(shù)據(jù)處理

使用Excel、SPSS軟件整理數(shù)據(jù)計算抑菌率，根據(jù)藥劑濃度和抑菌率作回歸分析，計算出每種藥劑的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r、決定系數(shù)R2和EC50值。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 中生菌素對梨火疫病菌的抑菌效果

由表2可知，從相關(guān)系數(shù)r可以看出，中生菌素對梨火疫病菌具有顯著抑制作用，稀釋倍數(shù)100～1 600倍范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)達0.921～0.946，具有顯著正相關(guān)關(guān)系。隨著中生菌素原藥隨著稀釋倍數(shù)的增加其有效成分濃度呈現(xiàn)下降變化，抑制圈平均直徑和抑菌率也隨之呈現(xiàn)降低變化。不同稀釋倍數(shù)條件下抑制圈平均直徑和抑菌率變化幅度不同，在100～400倍稀釋條件下抑菌圈平均直徑變化不顯著，抑菌率僅下降2.67%，在800～1 600稀釋條件下抑菌圈平均直徑則會顯著或極顯著下降，且抑菌率降幅較400倍稀釋條件下增加了3.74%～9.66%。

2.2" 中生菌素對梨火疫病菌的毒力比較

通過對試驗數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在噴藥結(jié)束后的第120 h時中生菌素藥害趨于穩(wěn)定（見表3），中生菌素毒力回歸方程的決定系數(shù)R2達到0.910，這說明試驗數(shù)據(jù)與毒力回歸方程的擬合度高，毒力回歸方程具有較高的可信度。同時結(jié)果還顯示42.62%中生菌素的EC50值為23.021 mg/L，即中生菌素對梨火疫病菌具有較好的防治效果，因此，結(jié)合中生菌素對梨火疫病菌的抑菌效果可以看出，中生菌素對梨火疫病菌具有較好的的抑制作用，100～400倍稀釋倍數(shù)下抑抑菌效果不存在顯著性差異。

2.3" 中生菌素制劑對庫爾勒香梨生長期安全性評價

為進一步評價中生菌素制劑對庫爾勒香梨不同生長期的安全性，對數(shù)據(jù)進行了藥害指數(shù)分析，結(jié)果如圖1所示，隨著稀釋倍數(shù)的不斷增加，藥害指數(shù)在庫爾勒香梨花芽萌動期、花期和幼果期均表現(xiàn)為下降變化。藥害指數(shù)在0～200倍稀釋范圍內(nèi)（藥害指數(shù)為9.5%～100%）的下降速率顯著高于200～1 200倍稀釋范圍（藥害指數(shù)為0%～24.0%），0～200倍稀釋范圍內(nèi)花芽萌動期的藥害最嚴(yán)重，其次是花期，幼果期最弱。200～1 200倍稀釋范圍幼果期的藥害最嚴(yán)重，其次是花芽萌動期，花期最弱。因此，結(jié)合中生菌素對梨火疫病菌的抑菌效果和中生菌素對梨火疫病菌的毒力比較知道，在200～400倍稀釋范圍內(nèi)使用中生菌素對庫爾勒香梨火疫病菌防治效果最佳。

3" 討論與結(jié)論

李東旭等［11］對中生菌素等4種藥劑進行田間實驗，發(fā)現(xiàn)中生菌素對梨火疫病菌的抑制效果最好。白鵬華等［12］利用2種生物殺菌劑對蘋果病害的防治進行評價，結(jié)果表明3%中生菌素可濕性粉劑對干腐病菌和腐爛病菌有較強的抑菌活性。王佼［13］對蘋果疫腐病防治進行藥劑篩選，并對果實的生長情況進行了田間跟蹤調(diào)查，使用中生菌素類的農(nóng)用抗生素，未發(fā)現(xiàn)藥害及果實發(fā)育和葉片生長的不良現(xiàn)象，并且成熟果實的風(fēng)味品質(zhì)也未受影響。本研究結(jié)果顯示，42.62%中生菌素原藥稀釋倍數(shù)在100～1 600倍范圍內(nèi)其對梨火疫病菌均具有顯著抑菌效果（抑菌率65.34%～77.67%），在200～400倍稀釋范圍內(nèi)使用中生菌素對庫爾勒香梨火疫病菌防治效果最佳，此時對花芽萌動期、花期和幼果期的藥害均低于24%，這表明中生菌素對庫爾勒香梨的生長和發(fā)育沒有明顯的不良影響。孟威［14］通過對中生菌素的有效組分、作用機理及安全性分析也證實了中生菌素對作物的安全性，是生產(chǎn)綠色食品較好的藥劑，這與本試驗結(jié)果基本一致。綜上所述，中生菌素對梨火疫病菌具有顯著的抑菌效果，且在適宜使用濃度下對庫爾勒香梨的生長是安全的。在實際生產(chǎn)中，若只考慮抑菌效果，可選擇200～400倍稀釋范圍噴施，若要考慮藥害程度則可使稀釋倍數(shù)高于1 000倍，并進行多次噴施。另，本研究僅在室內(nèi)和田間進行了中生菌素對梨火疫病菌的抑菌效果和庫爾勒香梨生長安全性的評價，實際應(yīng)用中的效果可能會受到環(huán)境因素和其他微生物的影響，其次我們僅評估了中生菌素的短期影響，對于其長期使用可能帶來的生態(tài)風(fēng)險還需要進一步研究。為了更好地評估中生菌素的應(yīng)用效果和安全性［15］，還需開展長期的田間試驗和生態(tài)風(fēng)險評估。

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