膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）對梨果采后青霉病、灰霉病的控制效果

束兆林　楊紅?！￡惣t州等

摘要： 研究膠紅酵母對梨果采后貯存過程中青霉菌、灰霉菌的控制效果，采用生長速率法分別測定了膠紅酵母對這2種霉菌的室內(nèi)抑菌毒力。測定結(jié)果表明：膠紅酵母對青霉菌、灰霉菌的LD50分別為2 560萬、2 940萬CFU/mL，LD95分別為156億、251億CFU/mL。由結(jié)果看出，膠紅酵母濃度越高，抑菌效果越好。

關(guān)鍵詞： 膠紅酵母；梨果；青霉菌；灰霉菌；毒力測定

中圖分類號：S436.612.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2015）08-0110-02

水果在采摘、運(yùn)銷、儲藏過程中因腐爛造成的損失是巨大的，也是全球關(guān)注的問題 [1]。梨是我國主栽水果之一，營養(yǎng)價值很高，但是由于梨果實(shí)含水量大、表皮脆弱、內(nèi)含物豐富，采摘貯存過程中主要易受青霉、灰霉等植物病原真菌的侵染 [1-2]，在貯存時容易腐爛、變質(zhì)等。因此，要大范圍流通梨果，儲運(yùn)保鮮問題日益突出。長期以來，世界對水果病害包括采后病害的控制主要依賴于化學(xué)殺菌劑。隨著人們生活水平不斷提高，人們對食品安全的要求越來越強(qiáng)烈，因此研究并開發(fā)新的水果采后防腐途徑，采用生物防治顯得具有重要意義。梨果采收后容易受到青霉菌及灰霉菌的侵染造成爛果，許多酵母品種作為一類拮抗微生物，對果蔬采后青霉菌、灰霉菌等引起的病害都具有明顯的防治作用。從檸檬果實(shí)表面分離得到的漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），在11℃或22℃條件下，能夠抑制青霉病菌時間長達(dá)21 d [3]；假絲酵母對蘋果采后灰霉病的防治也具有很好的效果，并且發(fā)現(xiàn)Ca 2+對這種防治效果具有促進(jìn)作用 [4]；用隱球酵母屬的Cryptococcus infirmo-miniatus、紅酵母屬的Rhodotorula glutinis在采收前1 d對梨進(jìn)行處理，能夠有效地控制梨采后腐爛 [5]。膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）是一種拮抗酵母菌，研究表明，膠紅酵母對梨灰霉?。ㄓ葿otrytis cinerea引起）、桃果青霉?。ㄓ蒔enicillium expansum引起）都表現(xiàn)出顯著的拮抗效果，是被證明能有效控制水果采后病害的酵母拮抗菌 [1]。本研究通過果實(shí)室內(nèi)毒力試驗(yàn)，研究膠紅酵母對青霉菌、灰霉菌的控制效果，以期為梨果采后貯存及保鮮提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料為正常成熟的梨果實(shí)，品種為幸水，購自江蘇省句容市豐之源梨園，選擇無機(jī)械損傷、未感染、大小、成熟度等外觀品質(zhì)基本一致的果實(shí)，分組待用。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa） 由江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；青霉菌（Penicillium italicum）、灰霉菌（Botrytis cinerea）從腐爛的梨果果實(shí)上分離得到。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司）；高速離心機(jī)（Thermo）；千分之一電子天平（臺灣櫻花股份有限公司）；恒溫箱（寧波江南儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種處理 在250 mL的三角瓶中裝入50 mL的 NYDB （8 g牛肉浸膏、5 g酵母浸膏、10 g葡萄糖、1 000 mL水）培養(yǎng)基，用接種環(huán)接入2環(huán)活化的膠紅酵母，37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)20 h；將上述培養(yǎng)混合物在28°C、7 000 g 條件下離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌2次，去除培養(yǎng)介質(zhì)，并用無菌生理鹽水重新懸浮酵母細(xì)胞；用血球記數(shù)板調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為24億 CFU/mL，再將濃度為24億CFU/mL的酵母細(xì)胞懸浮液用無菌生理鹽水依次稀釋10、100、1 000、10 000倍。將青霉菌、灰霉菌分別接種在PDA培養(yǎng)基（將200 g 去皮馬鈴薯加水煮沸20 min后過濾，濾液中加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂，用蒸餾水定容至1 000 mL）中，于28°C培養(yǎng) 7 d 后，將其懸浮在無菌水中，用血球計數(shù)板在顯微鏡下對病原菌孢子數(shù)進(jìn)行測定，用無菌水調(diào)節(jié)孢子濃度至7萬個/mL。

1.2.2 室內(nèi)毒力測定 先用0.1%次氯酸鈉（NaClO）溶液將梨果浸泡30 s，用無菌水沖洗果實(shí)后，再用毛巾抹干果實(shí)，后用消過毒的打孔器在每個果實(shí)表面赤道部位制造直徑5 mm、深3 mm的傷口。每個傷口處等量加入30 μL以下濃度膠紅酵母孢子懸浮液溶液：24.0億、2.4億、2 400.0萬、240.0萬、24.0萬CFU/mL的酵母菌溶液，以及無菌水（空白對照）。3 h 后在每個傷口處接種30 μL等量的青霉菌或灰霉菌原菌孢子液，自然晾干后，將果實(shí)放入塑料筐并用保鮮膜密封，于恒溫、恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（溫度25 ℃，相對濕度95%）。每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)設(shè)10個果實(shí)。經(jīng)過5 d的培養(yǎng)，分別測量各處理病斑直徑，計算抑制率，并根據(jù)病斑直徑抑制率、濃度對數(shù)計算膠紅酵母LD50，以此評價膠紅酵母對梨果上2種常見霉菌的抑制效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理中用到的公式為：

病斑直徑抑制率=（空白對照病斑直徑-膠紅酵母處理病斑直徑）/空白對照病斑直徑×100%。

采用DPS 13.0專業(yè)版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，以病斑直徑抑制率值作為縱坐標(biāo)、藥劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)化為對數(shù)值作為橫坐標(biāo)，根據(jù)斑直徑抑制率值（y）與質(zhì)量濃度對數(shù)（x）之間的線性回歸關(guān)系，求毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)，并計算LD50、LD95及其95%置信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠紅酵母對梨果采后貯存過程中2種霉菌病斑生長的影響

從表1、表2可以看出，不同濃度的膠紅酵母對梨果上青霉菌、灰霉菌病斑生長都有一定的抑制作用。經(jīng)過5 d培養(yǎng)，對照梨果上接種青霉菌處理組的病斑沿接種中心向四周擴(kuò)張，出現(xiàn)水漬狀軟腐，接種灰霉菌處理組由中心向四周出現(xiàn)淺黃褐色不規(guī)則形軟腐病病斑，2類病斑直徑分別為10.00、13.01 mm；而經(jīng)過濃度為24.0億CFU/mL膠紅酵母處理后，青霉病斑直徑僅為1.35 mm，灰霉病斑直徑為5.81 mm，病斑直徑抑制率分別達(dá)到86.5%、55.3%；膠紅酵母溶液稀釋10、100、1 000、10 000倍后對梨果上2種霉菌病斑直徑抑制率分別為72.9%、52.0%、27.3%、10.7%，69.0%、53.7%、27.5%、10.6%，均明顯優(yōu)于對照，且濃度越高，菌斑抑制效果越好。

2.2 膠紅酵母對梨果采后貯存過程中2種霉菌的毒力測定結(jié)果

由表3可知，根據(jù)病斑直徑抑制率與膠紅酵母濃度對數(shù)建立的線性關(guān)系，膠紅酵母對青霉菌、灰霉菌的LD50分別為2 560萬、2 940萬CFU/mL，LD95分別為156億、251億CFU/mL，膠紅酵母濃度對數(shù)與2種霉菌病斑抑制率之間有很強(qiáng)的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99以上。

3 結(jié)論與討論

酵母菌通過以下3種途徑發(fā)揮其對病原菌拮抗作用：（1）拮抗酵母菌通過與病原菌競爭果實(shí)表面的營養(yǎng)及侵染位點(diǎn)，在果實(shí)表面形成保護(hù)屏障，有效抵抗病原菌的侵入 [6]；（2）拮抗酵母菌繁殖速度快，對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，能有效利用果蔬表面低營養(yǎng)物質(zhì)而迅速擴(kuò)大種群數(shù)量，使病原菌得不到足夠的營養(yǎng)與空間條件，不能生長增殖，達(dá)到抑制病害發(fā)生的目的；（3）酵母菌的拮抗機(jī)制還有寄生和誘導(dǎo)抗性 [7]，本試驗(yàn)人為在梨果表面形成傷口，接入2種梨果貯藏期常見的病菌，結(jié)果表明，膠紅酵母對青霉菌、灰霉菌2種霉菌的抑菌LD50分別為2 560萬、2 940萬CFU/mL，LD95分別為156億、251億CFU/mL，且濃度越高，抑菌效果越好。有研究表明，23 ℃條件下黏紅酵母（Rhodotorula glutinis）濃度達(dá)到10億CFU/mL時能完全抑制柑橘上青霉病的發(fā)生 [8]，25 ℃ 條件下絲孢酵母（Trichosporon sp.）懸浮液濃度為1億CFU/mL時能顯著抑制蘋果果實(shí)表面?zhèn)谔幥嗝咕?、灰霉菌的發(fā)生 [9]。引起果實(shí)腐爛的病原微生物大多腐生性強(qiáng)，一般通過果實(shí)上的皮孔、氣孔或是機(jī)械損傷形成的傷口侵入，其孢子萌發(fā)和致病活動需要大量的外源營養(yǎng)。本試驗(yàn)中，酵母對2種病原菌在前3 d抑制效果好，7 d后開始下降，這可能是部分病原菌突破酵母保護(hù)層，侵入果實(shí)而導(dǎo)致發(fā)病腐爛，進(jìn)一步說明膠紅酵母對梨果的保護(hù)效果主要源于酵母細(xì)胞在傷口表面的快速繁殖而阻止病原菌的侵入。酵母的抑菌效果跟自身菌體數(shù)量相關(guān)，而菌體濾液不能抑制病斑的擴(kuò)展，所以拮抗酵母抑菌機(jī)制不是靠產(chǎn)生抗生素，而可能是與病菌在傷口處具有較強(qiáng)的營養(yǎng)競爭有關(guān) [10-11]。

雖然許多酵母菌已被證實(shí)對水果病原菌具有拮抗作用，但到目前為止，我國仍未進(jìn)行商業(yè)化應(yīng)用，其主要原因是在實(shí)際生產(chǎn)條件下，由于環(huán)境條件的不確定性，其防治效果往往達(dá)不到要求或者不穩(wěn)定。但由于膠紅酵母具有諸多優(yōu)點(diǎn)，隨著研究理論的不斷深入、生防技術(shù)的日趨完善，膠紅酵母等拮抗菌極有可能填補(bǔ)果蔬采后病害防治技術(shù)方面的不足，膠紅酵母在果蔬采后防腐保鮮領(lǐng)域有著廣闊的發(fā)展空間。

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