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    羊種布魯氏菌NN1202和LA1105株OPM25和OPM31蛋白B細(xì)胞抗原表位分析

    2015-09-10 21:11:30李軍李常挺潘艷等
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年8期
    關(guān)鍵詞:布魯氏菌

    李軍+李常挺+潘艷等

    摘要: 應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)羊種布魯氏菌NN1202和LA1105株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示,NN1202和LA1105株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因在布魯氏菌種間高度保守。應(yīng)用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析OMP25和OMP31蛋白的α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角區(qū)域和卷曲區(qū)域;應(yīng)用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析蛋白的氨基酸親水性、蛋白柔性區(qū)域、溶劑表面可及性和抗原指數(shù)。對(duì)各方法的結(jié)果綜合分析,OMP25蛋白的27~34、59~65、69~75、101~107、148~154、182~189、197~202區(qū)域以及OMP31蛋白的25~32、50~58、63~70、102~111、125~130、166~173、176~183區(qū)域可能是優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位。

    關(guān)鍵詞: 布魯氏菌;OMP25;OMP31;抗原表位

    中圖分類號(hào): S858.26 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2015)08-0038-04

    布魯氏菌是一種感染人、家畜、野生動(dòng)物等60多種動(dòng)物的人獸共患病原菌,根據(jù)宿主和致病性的差異,分為羊種布魯氏菌(Brucella melitensis)、牛種布魯氏菌(B. abortus)、豬種布魯氏菌(B.suis)、綿羊附睪種布魯氏菌(B. ovis)、犬種布魯氏菌(B. canis)和沙林鼠種布魯氏菌(B. neotomae)6個(gè)種;此外,還從海洋動(dòng)物中分離到在致病性和分子特征上有別于前6種的海豚布魯氏菌(B. cetacease)和海豹布魯氏菌(B. pinnipediae) [1]。在這8種布魯氏菌中,以羊種布魯氏菌對(duì)人的致病性最強(qiáng)。布魯氏菌的外膜由外膜蛋白、脂多糖和磷脂層構(gòu)成。外膜蛋白為一類與毒力密切相關(guān)的免疫原性蛋白 [2-3],其中,分子量分別為25 ku(OMP25)和31 ku(OMP31)的2種外膜蛋白是布魯氏菌的主要外膜蛋白 [4-5]。OMP25蛋白和OPM31蛋白免疫小鼠后,能分別誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG2a 和IgG1類型的抗體,是一種抗原免疫保護(hù)蛋白 [6-7]。Bowden等證實(shí)OMP31的單克隆抗體與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體存在競(jìng)爭(zhēng)抑制現(xiàn)象,表明OMP31存在抗原表位 [8]。本研究擬對(duì)廣西分離的2株羊種布魯氏菌NN1202、LA1105菌株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因進(jìn)行克隆、測(cè)序,運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)二者的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析,為后續(xù)的合成肽疫苗研究提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 羊種布魯氏菌NN1202和LA1105菌株由廣西獸醫(yī)研究所細(xì)菌研究室分離、鑒定和保存 [9]。羊種布氏菌5號(hào)疫苗為PCR擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照菌株。

    1.1.2 試劑 布氏瓊脂粉購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司;馬血清購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒及PCR反應(yīng)所用試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1OMP25和OMP31 基因的PCR擴(kuò)增和克隆 取保存的羊種布魯氏菌NN1202株和LA1105株凍干菌種,每支菌種加入0.2 mL無(wú)菌水溶解,接種棒蘸取菌液接種于含10%馬血清布氏瓊脂斜面培養(yǎng)基,置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 72 h。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA,以細(xì)菌DNA為模板對(duì)[WTBX][WTBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以羊種布氏菌5號(hào)疫苗為陽(yáng)性對(duì)照。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min,60 ℃(57 ℃) 1 min,72 ℃ 1 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。擴(kuò)增預(yù)期片段分別為650 bp和750 bp。引物序列分別為PM25-F:5′-GAATTCATGCGCACTCTTAAGTCTCTC-3′;OPM25-R:5′-GTCGACTTAGAACTTGTAGCCGATGCC-3′;OPM31 -F:5′-GCGAATTCATGAAGTCCGTAATT-3′;OPM31-R:5′-GCCTCGAGTTAGAACTTGTAGTT-3。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

    DNA膠回收試劑盒純化、回收目的片段后,與pMD-18T載體4 ℃過(guò)夜連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,PCR鑒定正確的陽(yáng)性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

    1.2.2 OMP25和OMP31基因的核苷酸同源性分析 應(yīng)用MegAlign軟件對(duì)測(cè)序獲得的OMP25和OMP31基因的核苷酸序列與GenBank上登錄的已知序列進(jìn)行同源性比較,分析它們之間的親緣關(guān)系。

    1.2.3 OMP25蛋白和OMP31蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 運(yùn)用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角區(qū)域和卷曲區(qū)域 [10-11]。

    1.2.4 OMP25蛋白和OMP31蛋白B細(xì)胞抗原表位分析 應(yīng)用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的氨基酸親水性、蛋白柔性區(qū)域、溶劑表面可及性和抗原指數(shù),綜合各方法的結(jié)果并結(jié)合B細(xì)胞表位網(wǎng)上預(yù)測(cè)(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)來(lái)分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的B細(xì)胞抗原表位 [12-15]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1OMP25和OMP31基因的PCR擴(kuò)增

    提取羊種布魯氏菌NN1202株和LA1105株的DNA,分別對(duì)OMP25和OMP31 [STBZ]基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到650 bp和750 bp的擴(kuò)增片段,大小與陽(yáng)性對(duì)照羊種布魯氏菌5號(hào)疫苗的擴(kuò)增結(jié)果一致(圖1)。

    2.2 OMP25和OMP31 基因的核苷酸同源性分析

    NN1202株和LA1105株的陽(yáng)性O(shè)MP25質(zhì)粒測(cè)序后證實(shí)擴(kuò)增片段大小為650 bp,內(nèi)含1個(gè)642 bp的開放閱讀框,編碼213個(gè)氨基酸,它們的核苷酸序列已登錄GenBank,登錄號(hào)分別為KJ720202和KJ720201。將它們的核苷酸序列與GenBank登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比較,NN1202株和LA1105株OMP25之間的同源性為100%,與羊種布魯氏菌M5-90(CP001852)、豬種布魯氏菌S2(CP006961)、牛種布魯氏菌S19(CP000887)、犬種布魯氏菌ATCC23365(CP000872)、綿羊附睪種ATCC25840(CP000708)的同源性均為100%。

    NN1202株和LA1105株的陽(yáng)性O(shè)MP31 質(zhì)粒測(cè)序后證實(shí)擴(kuò)增片段大小為750 bp,內(nèi)含1個(gè)723 bp的開放閱讀框,編碼240個(gè)氨基酸,它們的核苷酸序列已登錄GenBank,登錄號(hào)分別為KJ720203和KJ720204。將它們的核苷酸序列與GenBank登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比較,NN1202株、LA1105株和羊種布魯氏菌M5-90(CP001852)[OMP25 之間的同源性均為100%;與豬種布魯氏菌S2(CP006961)、犬種布魯氏菌ATCC23365(CP000872)、綿羊附睪種ATCC25840(CP000708)的同源性為99%。

    2.3 OMP25蛋白和OMP31蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

    綜合Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法的分析,OMP25蛋白有4個(gè)α-螺旋區(qū)域(13~29、75~79、100~104、109~114),9個(gè)β-折疊區(qū)域(6~10、49~55、62~67、86~91、130~144、154~159、173~181、190~196、204~207)。在α-螺旋和β-折疊區(qū)域的間隙分布著長(zhǎng)短不一的13個(gè)轉(zhuǎn)角區(qū)域和11個(gè)卷曲區(qū)域(圖2)。OMP31蛋白有4個(gè)α-螺旋區(qū)域(4~21、121~134、144~145、172~176),9個(gè)β-折疊區(qū)域(22~25、75~77、82~88、97~102、112~115、135~139、147~152、156~163、230~240)。在α-螺旋和β-折疊區(qū)域的間隙分布著長(zhǎng)短不一的17個(gè)轉(zhuǎn)角區(qū)域和12個(gè)卷曲區(qū)域(圖3)。

    2.4 OMP25蛋白和OMP31蛋白的氨基酸親水性分析

    Kyte-Doolittle方法分析表明,OMP25蛋白有較多的親水[CM(25]性區(qū)域(≥0.5),分布較為均勻,主要有27~32、44~46、

    2.5 OMP25蛋白和OMP31蛋白的柔性區(qū)域分析

    2.6 OMP25蛋白和OMP31蛋白的溶劑表面可及性分析

    Emini方法分析表明,59~63、70~75、101~107、177~189和196~202區(qū)域出現(xiàn)在OMP25蛋白溶劑表面可及性較大(≥1)(圖8)。OMP31蛋白的溶劑表面可及性區(qū)域較少,只有2個(gè)區(qū)域(63~69和177~182)(圖9)。

    2.7 OMP25蛋白和OMP31蛋白的抗原指數(shù)分析

    Jameson-Wolf方法分析表明,OMP25蛋白抗原指數(shù)較高的區(qū)域(≥0)有:26~33、56~65、68~75、93~99、101~105、117~127、143~156、165~179、183~190、195~207,以C端區(qū)域的抗原指數(shù)較高,跨度較大,存在抗原表位的可能性也較大(圖10)。OMP31蛋白抗原指數(shù)較高的區(qū)域(≥0)分布較均勻,以23~33、51~75、102~111、118~130、136~147、167~173、177~184和206~227區(qū)域存在抗原表位的可能性較大(圖11)。

    2.8 OMP25蛋白和OMP31蛋白B細(xì)胞表位綜合分析

    應(yīng)用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法并結(jié)合B細(xì)胞表位網(wǎng)上預(yù)測(cè)分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/),OMP25蛋白的27~34、59~65、69~75、101~107、148~154、182~189、197~202[CM(21*2/3]區(qū)域以及OMP31蛋白的25~32、50~58、63~70、

    102~111、125~130、166~173、176~183區(qū)域均具有較好的親水性、柔性和溶劑表面可及性,抗原指數(shù)也較高,結(jié)合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)上含有容易形成抗原表位的轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)域,因此,這些區(qū)域極有可能是OMP25蛋白和OMP31蛋白的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位。

    3 討論

    研究證實(shí),布魯氏菌[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 基因是免疫原性基因,它們編碼的蛋白對(duì)小鼠具有免疫保護(hù)作用 [6-7]。本研究對(duì)羊種NN1202株和LA1105株[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 基因核苷酸同源性比較結(jié)果表明,[OMP25和OMP31 基因在布魯氏菌種間高度保守,OMP25和OMP31蛋白可以作為布魯氏菌合成肽疫苗的候選靶蛋白。

    利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)病原微生物的抗原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析是研制合成肽疫苗的基礎(chǔ) [16]。研究表明,B細(xì)胞抗原表位的形成取決于蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。蛋白在形成立體構(gòu)象時(shí),多肽鏈中的α-螺旋和β-折疊的氫鍵鍵能高,形成穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu),在蛋白內(nèi)部中起著“骨架”作用,不易與抗體結(jié)合,成為B細(xì)胞抗原表位的幾率低。相反,轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)域的氫鍵鍵能低,形成盤旋、扭曲等松散的柔性結(jié)構(gòu)暴露在蛋白表面,與抗體結(jié)合的幾率大,成為B細(xì)胞抗原表位的可能性高 [17]。此外,氨基酸的親水性、極性也決定了其是否暴露在蛋白表面,因此,蛋白的親水部位和溶劑表面可及性也與B細(xì)胞抗原表位有密切關(guān)系。

    B細(xì)胞抗原表位的分析方法主要有蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析、氨基酸親水性分析、蛋白柔性區(qū)域分析、溶劑表面可及性分析 [10-14]。Jamson等將上述4種方法綜合,以蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析占40%、氨基酸親水性分析占30%、蛋白柔性區(qū)域分析占15%、溶劑表面可及性分析占15%的計(jì)算模式,提出一種抗原指數(shù)分析法 [15]。根據(jù)該方法分析,發(fā)現(xiàn)OMP25蛋白的26~33、56~65、68~75、93~99、101~105、117~127、143~156、165~179、183~190、195~207區(qū)域以及OMP31蛋白的23~33、51~75、102~111、118~130、136~147、167~173、177~184和206~227區(qū)域存在抗原表位的可能性較大,但由于蛋白在形成立體構(gòu)象時(shí),蛋白表面的氨基酸會(huì)遮蓋一些抗原指數(shù)較高的區(qū)域,使其不能成為優(yōu)勢(shì)抗原表位,因此,根據(jù)綜合分析,筆者選擇OMP25蛋白的27~34、59~65、69~75、101~107、148~154、182~189、197~202區(qū)域以及OMP31蛋白的25~32、50~58、63~70、102~111、125~130、166~173、176~183區(qū)域作為后續(xù)合成肽疫苗研究的靶位點(diǎn)。

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