• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    羊種布魯氏菌NN1202和LA1105株OPM25和OPM31蛋白B細(xì)胞抗原表位分析

    2015-09-10 21:11:30李軍李常挺潘艷等
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年8期
    關(guān)鍵詞:布魯氏菌

    李軍+李常挺+潘艷等

    摘要: 應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)羊種布魯氏菌NN1202和LA1105株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示,NN1202和LA1105株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因在布魯氏菌種間高度保守。應(yīng)用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析OMP25和OMP31蛋白的α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角區(qū)域和卷曲區(qū)域;應(yīng)用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析蛋白的氨基酸親水性、蛋白柔性區(qū)域、溶劑表面可及性和抗原指數(shù)。對(duì)各方法的結(jié)果綜合分析,OMP25蛋白的27~34、59~65、69~75、101~107、148~154、182~189、197~202區(qū)域以及OMP31蛋白的25~32、50~58、63~70、102~111、125~130、166~173、176~183區(qū)域可能是優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位。

    關(guān)鍵詞: 布魯氏菌;OMP25;OMP31;抗原表位

    中圖分類號(hào): S858.26 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2015)08-0038-04

    布魯氏菌是一種感染人、家畜、野生動(dòng)物等60多種動(dòng)物的人獸共患病原菌,根據(jù)宿主和致病性的差異,分為羊種布魯氏菌(Brucella melitensis)、牛種布魯氏菌(B. abortus)、豬種布魯氏菌(B.suis)、綿羊附睪種布魯氏菌(B. ovis)、犬種布魯氏菌(B. canis)和沙林鼠種布魯氏菌(B. neotomae)6個(gè)種;此外,還從海洋動(dòng)物中分離到在致病性和分子特征上有別于前6種的海豚布魯氏菌(B. cetacease)和海豹布魯氏菌(B. pinnipediae) [1]。在這8種布魯氏菌中,以羊種布魯氏菌對(duì)人的致病性最強(qiáng)。布魯氏菌的外膜由外膜蛋白、脂多糖和磷脂層構(gòu)成。外膜蛋白為一類與毒力密切相關(guān)的免疫原性蛋白 [2-3],其中,分子量分別為25 ku(OMP25)和31 ku(OMP31)的2種外膜蛋白是布魯氏菌的主要外膜蛋白 [4-5]。OMP25蛋白和OPM31蛋白免疫小鼠后,能分別誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG2a 和IgG1類型的抗體,是一種抗原免疫保護(hù)蛋白 [6-7]。Bowden等證實(shí)OMP31的單克隆抗體與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體存在競(jìng)爭(zhēng)抑制現(xiàn)象,表明OMP31存在抗原表位 [8]。本研究擬對(duì)廣西分離的2株羊種布魯氏菌NN1202、LA1105菌株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因進(jìn)行克隆、測(cè)序,運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)二者的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析,為后續(xù)的合成肽疫苗研究提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 羊種布魯氏菌NN1202和LA1105菌株由廣西獸醫(yī)研究所細(xì)菌研究室分離、鑒定和保存 [9]。羊種布氏菌5號(hào)疫苗為PCR擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照菌株。

    1.1.2 試劑 布氏瓊脂粉購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司;馬血清購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒及PCR反應(yīng)所用試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1OMP25和OMP31 基因的PCR擴(kuò)增和克隆 取保存的羊種布魯氏菌NN1202株和LA1105株凍干菌種,每支菌種加入0.2 mL無(wú)菌水溶解,接種棒蘸取菌液接種于含10%馬血清布氏瓊脂斜面培養(yǎng)基,置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 72 h。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA,以細(xì)菌DNA為模板對(duì)[WTBX][WTBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以羊種布氏菌5號(hào)疫苗為陽(yáng)性對(duì)照。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min,60 ℃(57 ℃) 1 min,72 ℃ 1 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。擴(kuò)增預(yù)期片段分別為650 bp和750 bp。引物序列分別為PM25-F:5′-GAATTCATGCGCACTCTTAAGTCTCTC-3′;OPM25-R:5′-GTCGACTTAGAACTTGTAGCCGATGCC-3′;OPM31 -F:5′-GCGAATTCATGAAGTCCGTAATT-3′;OPM31-R:5′-GCCTCGAGTTAGAACTTGTAGTT-3。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

    DNA膠回收試劑盒純化、回收目的片段后,與pMD-18T載體4 ℃過(guò)夜連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,PCR鑒定正確的陽(yáng)性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

    1.2.2 OMP25和OMP31基因的核苷酸同源性分析 應(yīng)用MegAlign軟件對(duì)測(cè)序獲得的OMP25和OMP31基因的核苷酸序列與GenBank上登錄的已知序列進(jìn)行同源性比較,分析它們之間的親緣關(guān)系。

    1.2.3 OMP25蛋白和OMP31蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 運(yùn)用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角區(qū)域和卷曲區(qū)域 [10-11]。

    1.2.4 OMP25蛋白和OMP31蛋白B細(xì)胞抗原表位分析 應(yīng)用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的氨基酸親水性、蛋白柔性區(qū)域、溶劑表面可及性和抗原指數(shù),綜合各方法的結(jié)果并結(jié)合B細(xì)胞表位網(wǎng)上預(yù)測(cè)(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)來(lái)分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的B細(xì)胞抗原表位 [12-15]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1OMP25和OMP31基因的PCR擴(kuò)增

    提取羊種布魯氏菌NN1202株和LA1105株的DNA,分別對(duì)OMP25和OMP31 [STBZ]基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到650 bp和750 bp的擴(kuò)增片段,大小與陽(yáng)性對(duì)照羊種布魯氏菌5號(hào)疫苗的擴(kuò)增結(jié)果一致(圖1)。

    2.2 OMP25和OMP31 基因的核苷酸同源性分析

    NN1202株和LA1105株的陽(yáng)性O(shè)MP25質(zhì)粒測(cè)序后證實(shí)擴(kuò)增片段大小為650 bp,內(nèi)含1個(gè)642 bp的開放閱讀框,編碼213個(gè)氨基酸,它們的核苷酸序列已登錄GenBank,登錄號(hào)分別為KJ720202和KJ720201。將它們的核苷酸序列與GenBank登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比較,NN1202株和LA1105株OMP25之間的同源性為100%,與羊種布魯氏菌M5-90(CP001852)、豬種布魯氏菌S2(CP006961)、牛種布魯氏菌S19(CP000887)、犬種布魯氏菌ATCC23365(CP000872)、綿羊附睪種ATCC25840(CP000708)的同源性均為100%。

    NN1202株和LA1105株的陽(yáng)性O(shè)MP31 質(zhì)粒測(cè)序后證實(shí)擴(kuò)增片段大小為750 bp,內(nèi)含1個(gè)723 bp的開放閱讀框,編碼240個(gè)氨基酸,它們的核苷酸序列已登錄GenBank,登錄號(hào)分別為KJ720203和KJ720204。將它們的核苷酸序列與GenBank登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比較,NN1202株、LA1105株和羊種布魯氏菌M5-90(CP001852)[OMP25 之間的同源性均為100%;與豬種布魯氏菌S2(CP006961)、犬種布魯氏菌ATCC23365(CP000872)、綿羊附睪種ATCC25840(CP000708)的同源性為99%。

    2.3 OMP25蛋白和OMP31蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

    綜合Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法的分析,OMP25蛋白有4個(gè)α-螺旋區(qū)域(13~29、75~79、100~104、109~114),9個(gè)β-折疊區(qū)域(6~10、49~55、62~67、86~91、130~144、154~159、173~181、190~196、204~207)。在α-螺旋和β-折疊區(qū)域的間隙分布著長(zhǎng)短不一的13個(gè)轉(zhuǎn)角區(qū)域和11個(gè)卷曲區(qū)域(圖2)。OMP31蛋白有4個(gè)α-螺旋區(qū)域(4~21、121~134、144~145、172~176),9個(gè)β-折疊區(qū)域(22~25、75~77、82~88、97~102、112~115、135~139、147~152、156~163、230~240)。在α-螺旋和β-折疊區(qū)域的間隙分布著長(zhǎng)短不一的17個(gè)轉(zhuǎn)角區(qū)域和12個(gè)卷曲區(qū)域(圖3)。

    2.4 OMP25蛋白和OMP31蛋白的氨基酸親水性分析

    Kyte-Doolittle方法分析表明,OMP25蛋白有較多的親水[CM(25]性區(qū)域(≥0.5),分布較為均勻,主要有27~32、44~46、

    2.5 OMP25蛋白和OMP31蛋白的柔性區(qū)域分析

    2.6 OMP25蛋白和OMP31蛋白的溶劑表面可及性分析

    Emini方法分析表明,59~63、70~75、101~107、177~189和196~202區(qū)域出現(xiàn)在OMP25蛋白溶劑表面可及性較大(≥1)(圖8)。OMP31蛋白的溶劑表面可及性區(qū)域較少,只有2個(gè)區(qū)域(63~69和177~182)(圖9)。

    2.7 OMP25蛋白和OMP31蛋白的抗原指數(shù)分析

    Jameson-Wolf方法分析表明,OMP25蛋白抗原指數(shù)較高的區(qū)域(≥0)有:26~33、56~65、68~75、93~99、101~105、117~127、143~156、165~179、183~190、195~207,以C端區(qū)域的抗原指數(shù)較高,跨度較大,存在抗原表位的可能性也較大(圖10)。OMP31蛋白抗原指數(shù)較高的區(qū)域(≥0)分布較均勻,以23~33、51~75、102~111、118~130、136~147、167~173、177~184和206~227區(qū)域存在抗原表位的可能性較大(圖11)。

    2.8 OMP25蛋白和OMP31蛋白B細(xì)胞表位綜合分析

    應(yīng)用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法并結(jié)合B細(xì)胞表位網(wǎng)上預(yù)測(cè)分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/),OMP25蛋白的27~34、59~65、69~75、101~107、148~154、182~189、197~202[CM(21*2/3]區(qū)域以及OMP31蛋白的25~32、50~58、63~70、

    102~111、125~130、166~173、176~183區(qū)域均具有較好的親水性、柔性和溶劑表面可及性,抗原指數(shù)也較高,結(jié)合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)上含有容易形成抗原表位的轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)域,因此,這些區(qū)域極有可能是OMP25蛋白和OMP31蛋白的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位。

    3 討論

    研究證實(shí),布魯氏菌[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 基因是免疫原性基因,它們編碼的蛋白對(duì)小鼠具有免疫保護(hù)作用 [6-7]。本研究對(duì)羊種NN1202株和LA1105株[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 基因核苷酸同源性比較結(jié)果表明,[OMP25和OMP31 基因在布魯氏菌種間高度保守,OMP25和OMP31蛋白可以作為布魯氏菌合成肽疫苗的候選靶蛋白。

    利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)病原微生物的抗原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析是研制合成肽疫苗的基礎(chǔ) [16]。研究表明,B細(xì)胞抗原表位的形成取決于蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。蛋白在形成立體構(gòu)象時(shí),多肽鏈中的α-螺旋和β-折疊的氫鍵鍵能高,形成穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu),在蛋白內(nèi)部中起著“骨架”作用,不易與抗體結(jié)合,成為B細(xì)胞抗原表位的幾率低。相反,轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)域的氫鍵鍵能低,形成盤旋、扭曲等松散的柔性結(jié)構(gòu)暴露在蛋白表面,與抗體結(jié)合的幾率大,成為B細(xì)胞抗原表位的可能性高 [17]。此外,氨基酸的親水性、極性也決定了其是否暴露在蛋白表面,因此,蛋白的親水部位和溶劑表面可及性也與B細(xì)胞抗原表位有密切關(guān)系。

    B細(xì)胞抗原表位的分析方法主要有蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析、氨基酸親水性分析、蛋白柔性區(qū)域分析、溶劑表面可及性分析 [10-14]。Jamson等將上述4種方法綜合,以蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析占40%、氨基酸親水性分析占30%、蛋白柔性區(qū)域分析占15%、溶劑表面可及性分析占15%的計(jì)算模式,提出一種抗原指數(shù)分析法 [15]。根據(jù)該方法分析,發(fā)現(xiàn)OMP25蛋白的26~33、56~65、68~75、93~99、101~105、117~127、143~156、165~179、183~190、195~207區(qū)域以及OMP31蛋白的23~33、51~75、102~111、118~130、136~147、167~173、177~184和206~227區(qū)域存在抗原表位的可能性較大,但由于蛋白在形成立體構(gòu)象時(shí),蛋白表面的氨基酸會(huì)遮蓋一些抗原指數(shù)較高的區(qū)域,使其不能成為優(yōu)勢(shì)抗原表位,因此,根據(jù)綜合分析,筆者選擇OMP25蛋白的27~34、59~65、69~75、101~107、148~154、182~189、197~202區(qū)域以及OMP31蛋白的25~32、50~58、63~70、102~111、125~130、166~173、176~183區(qū)域作為后續(xù)合成肽疫苗研究的靶位點(diǎn)。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 4版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2007:1-152.

    [2]Cloeckaert A,Vizcaíno N,Paquet J Y,et al. Major outer membrane proteins of Brucella spp.:past,present and future[J]. Veterinary Microbiology,2002,90(1/4):229-247.

    [3]Verstreate D R,Creasy M T,Caveney N T,et al. Outer membrane proteins of Brucella abortus:isolation and characterization[J]. Infection and Immunity,1982,35(3):979-989.

    [4]曲 勍,王玉飛,徐 杰,等. 羊布魯氏菌外膜蛋白質(zhì)的組成鑒定[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2009,35(5):805-811.

    [5]Eschenbrenner M,Wagner M A,Horn T A,et al. Comparative proteome analysis of Brucella melitensis vaccine strain Rev 1 and a virulent strain 16M[J]. Journal of Bacteriology,2002,184(18):4962-4970.

    [6]Bowden R A,Cloeckaert A,Zygmunt M S,et al. Evaluation of immunogenicity and protective activity in BALB/c mice of the 25-kDa major outer-membrane protein of Brucella melitensis (Omp25) expressed in Escherichia coli[J]. Journal of Medical Microbiology,1998,47(1):39-48.

    [7]Cassataro J,Estein S M,Pasquevich K A,et al. Vaccination with the recombinant Brucella outer membrane protein 31 or a derived 27-amino-acid synthetic peptide elicits a CD+4 Thelper 1 response that protects against Brucella melitensis infection[J]. Infection and Immunity,2005,73(12):8079-8088.

    [8]Bowden R A,Estein S M,Zygmunt M S,et al. Identification of protective outer membrane antigens of Brucella ovis by passive immunization of mice with monoclonal antibodies[J]. Microbes and Infection,2000,2(5):481-488.

    [9]李 軍,陳澤祥,楊 威,等. 廣西家畜布魯氏菌病的監(jiān)測(cè)分析[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2012,28(7):754-758.

    [10] Garnier J,Osguthorpe D J,Robson B. Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins[J]. Journal of Molecular Biology,1978,120(1):97-120.[HJ1.8mm]

    [11]Chou P Y,F(xiàn)asman G D. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence[J]. Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology,1978,47:45-148.

    [12]Kyte J,Doolittle R F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J]. Journal of Molecular Biology,1982,157(1):105-132.

    [13]Karplus P A,Schulz G E. Prediction of chain flexibility in proteins[J]. Naturwissenschaften,1985,72(4):212-213.

    [14]Emini E A,Hughes J V,Perlow D S,et al. Induction of hepatitis a virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide[J]. Journal of Virology,1985,55(3):836-839.

    [15]Jameson B A,Wolf H. The antigenic index:a novel algorithm for predicting antigenic determinants[J]. Computer Applications in the Biosciences,1988,4(1):181-186.

    [16]張洪勇,金寧一. 合成肽疫苗的分子設(shè)計(jì)[J]. 生物技術(shù)通訊,2003,14(2):145-147.

    [17]來(lái)魯華. 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分子設(shè)計(jì)[M].

    猜你喜歡
    布魯氏菌
    9例布魯氏菌病并發(fā)感染性主動(dòng)脈瘤患者臨床診治分析
    傳染病信息(2022年6期)2023-01-12 08:57:44
    牛、羊布魯氏菌病的傳播風(fēng)險(xiǎn)與防控對(duì)策
    羊布魯氏菌病的診斷與治療
    衡陽(yáng)市牛、羊布魯氏菌病的流行現(xiàn)狀及防控策略建議
    羊布魯氏菌病流行情況調(diào)查及綜合防控措施
    布魯氏菌病脊柱炎藥物治療的影響因素分析
    傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:46
    梅里埃API 20NE生化鑒定系統(tǒng)在布魯氏菌鑒定中的局限性
    中蒙醫(yī)解毒化濕法治療布魯氏菌病
    牛布魯氏菌病的預(yù)防和控制
    奶牛結(jié)核病和布魯氏菌病的防制
    禁无遮挡网站| 嫩草影院新地址| 国产精品久久久久久精品电影| 男人舔奶头视频| 五月伊人婷婷丁香| 99在线人妻在线中文字幕| 午夜老司机福利剧场| 色视频www国产| 国产精品野战在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产成人精品婷婷| 国产淫片久久久久久久久| 如何舔出高潮| 特级一级黄色大片| 日韩欧美精品v在线| 精品午夜福利在线看| 一区二区三区免费毛片| 亚洲图色成人| 亚洲成av人片在线播放无| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产三级中文精品| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产黄片视频在线免费观看| 性色avwww在线观看| 青春草国产在线视频 | 成人性生交大片免费视频hd| 波多野结衣高清作品| 美女黄网站色视频| 国产极品天堂在线| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩成人伦理影院| 波野结衣二区三区在线| 高清在线视频一区二区三区 | av免费在线看不卡| 久久人人精品亚洲av| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品久久久久久久久久久久久| 校园春色视频在线观看| 青春草国产在线视频 | 亚洲不卡免费看| 亚洲国产色片| 春色校园在线视频观看| 一个人免费在线观看电影| 欧美日韩精品成人综合77777| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产乱人偷精品视频| 少妇人妻精品综合一区二区 | 免费观看在线日韩| 免费av不卡在线播放| 真实男女啪啪啪动态图| 99久久成人亚洲精品观看| 老司机福利观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 一边摸一边抽搐一进一小说| 嫩草影院精品99| 国产不卡一卡二| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 日韩 亚洲 欧美在线| 国产成人91sexporn| 午夜福利在线在线| 国产高清不卡午夜福利| 啦啦啦观看免费观看视频高清| av女优亚洲男人天堂| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲av免费高清在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 天堂网av新在线| 国产亚洲精品av在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美精品一区二区大全| 国产三级中文精品| 国产成年人精品一区二区| 久久精品国产亚洲av天美| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲色图av天堂| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲精品日韩av片在线观看| 美女国产视频在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 成人国产麻豆网| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲在线自拍视频| 国产成人aa在线观看| 久久精品夜色国产| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲最大成人中文| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日韩制服骚丝袜av| 嫩草影院新地址| 韩国av在线不卡| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久久精品大字幕| 内射极品少妇av片p| 成年女人看的毛片在线观看| 全区人妻精品视频| 午夜视频国产福利| 91精品国产九色| 亚洲av电影不卡..在线观看| 99久国产av精品| 一级黄片播放器| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲成人久久爱视频| 少妇熟女欧美另类| 成年免费大片在线观看| 中文字幕制服av| 少妇熟女欧美另类| 久久99热6这里只有精品| 色综合亚洲欧美另类图片| 91精品一卡2卡3卡4卡| a级毛色黄片| 一级av片app| 国产单亲对白刺激| 成人综合一区亚洲| 小说图片视频综合网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 看十八女毛片水多多多| 色哟哟哟哟哟哟| 久久99热这里只有精品18| 一区二区三区免费毛片| 99精品在免费线老司机午夜| 深夜a级毛片| 国产黄片视频在线免费观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产精品久久久久久精品电影| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| www日本黄色视频网| 欧美zozozo另类| 高清毛片免费看| 国产极品精品免费视频能看的| 97在线视频观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 欧美不卡视频在线免费观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 简卡轻食公司| 国产伦理片在线播放av一区 | 一本一本综合久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美激情在线99| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国语自产精品视频在线第100页| 2022亚洲国产成人精品| 舔av片在线| 午夜激情欧美在线| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 精品无人区乱码1区二区| 国产免费男女视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 丰满的人妻完整版| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产精品1区2区在线观看.| 男人舔奶头视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 97热精品久久久久久| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 此物有八面人人有两片| 久久久成人免费电影| 亚洲无线在线观看| 久久久久网色| 如何舔出高潮| 国产精品一区二区性色av| 嫩草影院精品99| 99久久人妻综合| 久久久久久九九精品二区国产| 一级毛片久久久久久久久女| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产高清三级在线| 日韩成人av中文字幕在线观看| 插阴视频在线观看视频| 美女高潮的动态| 日本一本二区三区精品| 白带黄色成豆腐渣| 又粗又爽又猛毛片免费看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产精品精品国产色婷婷| 久久久色成人| 日韩视频在线欧美| 成年版毛片免费区| 亚洲真实伦在线观看| 国产成人91sexporn| av卡一久久| 麻豆乱淫一区二区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 高清午夜精品一区二区三区 | 亚洲精品国产av成人精品| 成年av动漫网址| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲av男天堂| 免费看av在线观看网站| 亚洲成人久久性| 日本av手机在线免费观看| 丝袜喷水一区| 婷婷色综合大香蕉| 久久久久性生活片| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲av第一区精品v没综合| 免费观看精品视频网站| 日日撸夜夜添| 99久国产av精品| 国产高潮美女av| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品久久久久久精品电影| 秋霞在线观看毛片| 国产成人精品久久久久久| а√天堂www在线а√下载| 亚洲av成人精品一区久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 欧美色视频一区免费| 天天一区二区日本电影三级| 欧美一区二区国产精品久久精品| 丝袜喷水一区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 桃色一区二区三区在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| 国产黄片视频在线免费观看| 波多野结衣巨乳人妻| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲电影在线观看av| 亚洲av第一区精品v没综合| 免费人成在线观看视频色| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品一区www在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲欧美精品专区久久| 一个人免费在线观看电影| 日韩欧美国产在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 五月伊人婷婷丁香| 免费大片18禁| 桃色一区二区三区在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 精品国产三级普通话版| 嫩草影院入口| 国产色婷婷99| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 国产日本99.免费观看| 欧美潮喷喷水| 日韩中字成人| 一个人观看的视频www高清免费观看| 成年免费大片在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 草草在线视频免费看| 国产真实乱freesex| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产极品天堂在线| 国产黄色小视频在线观看| 又爽又黄a免费视频| 午夜福利高清视频| а√天堂www在线а√下载| 免费看av在线观看网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 国产高清三级在线| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 精品午夜福利在线看| 啦啦啦啦在线视频资源| 一个人看视频在线观看www免费| 久久精品国产自在天天线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产伦精品一区二区三区四那| 91aial.com中文字幕在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 在线a可以看的网站| 亚洲av免费在线观看| 成年免费大片在线观看| 国产黄片美女视频| 99久久精品热视频| 最近的中文字幕免费完整| 色综合色国产| 99热只有精品国产| 日韩一区二区三区影片| 国产老妇女一区| 一级毛片电影观看 | 亚洲精品国产成人久久av| 国产一级毛片在线| 亚洲中文字幕日韩| 免费看美女性在线毛片视频| 精品久久久久久成人av| 亚洲国产高清在线一区二区三| 欧美性猛交黑人性爽| 久久草成人影院| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 免费看日本二区| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久亚洲精品不卡| 亚洲国产色片| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 成人亚洲精品av一区二区| 国内精品一区二区在线观看| 久久精品国产自在天天线| 午夜福利在线观看吧| 亚洲人成网站高清观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 看免费成人av毛片| 美女国产视频在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 看免费成人av毛片| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产美女午夜福利| 91精品一卡2卡3卡4卡| 精品国产三级普通话版| 99在线视频只有这里精品首页| kizo精华| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 一级二级三级毛片免费看| 久久午夜亚洲精品久久| 哪里可以看免费的av片| 亚洲av免费高清在线观看| 久久这里有精品视频免费| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 亚洲五月天丁香| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日本免费a在线| 在线播放国产精品三级| 麻豆久久精品国产亚洲av| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲av不卡在线观看| 伦理电影大哥的女人| 午夜福利高清视频| 亚洲五月天丁香| 特级一级黄色大片| 亚洲精品粉嫩美女一区| 高清毛片免费看| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲av第一区精品v没综合| av在线老鸭窝| 精华霜和精华液先用哪个| 国产精品嫩草影院av在线观看| 婷婷亚洲欧美| 成人漫画全彩无遮挡| 天堂影院成人在线观看| 日本色播在线视频| 国产成人影院久久av| 黄色配什么色好看| 九九热线精品视视频播放| 成人美女网站在线观看视频| 91av网一区二区| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲成人av在线免费| 青青草视频在线视频观看| 免费观看精品视频网站| 高清日韩中文字幕在线| 婷婷色av中文字幕| 日韩一本色道免费dvd| 午夜福利在线观看吧| 日韩国内少妇激情av| 中国国产av一级| 男女那种视频在线观看| eeuss影院久久| 国产美女午夜福利| 欧美日韩综合久久久久久| 搡老妇女老女人老熟妇| 天堂网av新在线| 精品久久久久久久久亚洲| 一级毛片我不卡| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲精品色激情综合| 九九爱精品视频在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 欧美色视频一区免费| 一个人看视频在线观看www免费| 一边亲一边摸免费视频| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲欧美精品专区久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 高清午夜精品一区二区三区 | 国产日韩欧美在线精品| 国产精品一区二区性色av| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产亚洲精品av在线| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 欧美最新免费一区二区三区| 成年女人永久免费观看视频| 99热这里只有是精品50| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久久国产成人精品二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 日本欧美国产在线视频| 成年版毛片免费区| 天美传媒精品一区二区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产男人的电影天堂91| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 搞女人的毛片| a级毛片a级免费在线| 成人欧美大片| 一进一出抽搐gif免费好疼| 综合色av麻豆| 国产成人影院久久av| 国产毛片a区久久久久| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 一进一出抽搐动态| 变态另类成人亚洲欧美熟女| а√天堂www在线а√下载| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲欧洲国产日韩| 毛片一级片免费看久久久久| 国产探花在线观看一区二区| 99热只有精品国产| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲欧美精品专区久久| 成人性生交大片免费视频hd| 日本-黄色视频高清免费观看| av卡一久久| 中国美白少妇内射xxxbb| 床上黄色一级片| 国产一级毛片在线| 日本五十路高清| 国内精品宾馆在线| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲三级黄色毛片| 国产男人的电影天堂91| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 99热网站在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产亚洲欧美98| 不卡一级毛片| 亚洲国产精品成人综合色| 日韩欧美国产在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久精品国产自在天天线| 亚洲人与动物交配视频| 免费观看在线日韩| 一级二级三级毛片免费看| 欧美日韩精品成人综合77777| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 精品一区二区三区视频在线| 在线天堂最新版资源| 成人午夜高清在线视频| 在线播放无遮挡| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 欧美色视频一区免费| 欧美成人精品欧美一级黄| 身体一侧抽搐| 岛国在线免费视频观看| 可以在线观看毛片的网站| 在线免费观看的www视频| 国产av一区在线观看免费| 免费观看a级毛片全部| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲精品亚洲一区二区| 精品人妻熟女av久视频| 日本黄色视频三级网站网址| 日本av手机在线免费观看| 久久久欧美国产精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产一级毛片在线| 91aial.com中文字幕在线观看| 免费在线观看成人毛片| 此物有八面人人有两片| 国产成人影院久久av| 亚洲成人av在线免费| 久久久久九九精品影院| 亚洲欧美日韩东京热| 一个人免费在线观看电影| 97超碰精品成人国产| 男人狂女人下面高潮的视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 成人国产麻豆网| 成人二区视频| 国产精品福利在线免费观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 禁无遮挡网站| 色综合色国产| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产成人一区二区在线| 综合色av麻豆| 青春草视频在线免费观看| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲第一电影网av| 26uuu在线亚洲综合色| 老司机福利观看| 婷婷色综合大香蕉| 精品久久久久久成人av| 国产精品久久久久久精品电影| 直男gayav资源| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久久国产成人精品二区| 国产真实伦视频高清在线观看| 中出人妻视频一区二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 最近2019中文字幕mv第一页| 日韩人妻高清精品专区| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 精品久久国产蜜桃| 日本一本二区三区精品| 国产精品av视频在线免费观看| 午夜久久久久精精品| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| avwww免费| 亚洲图色成人| 国产成人91sexporn| 级片在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 99热只有精品国产| 亚洲人成网站高清观看| 麻豆国产97在线/欧美| 成人美女网站在线观看视频| 国产精品人妻久久久影院| 国产综合懂色| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 精品久久久久久成人av| av免费在线看不卡| av在线老鸭窝| 我的女老师完整版在线观看| 国产成人精品一,二区 | 亚洲国产精品国产精品| 26uuu在线亚洲综合色| 一本精品99久久精品77| 国产精品av视频在线免费观看| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产精品伦人一区二区| 黄片无遮挡物在线观看| 日韩一区二区三区影片| 久久99蜜桃精品久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 中文欧美无线码| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲自拍偷在线| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲在线观看片| 99热只有精品国产| 特大巨黑吊av在线直播| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 99热只有精品国产| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲五月天丁香| 一级黄色大片毛片| 禁无遮挡网站| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 夜夜爽天天搞| 亚洲av二区三区四区| 嫩草影院新地址| 国产精品国产高清国产av| 好男人视频免费观看在线| 国产精品.久久久| 岛国在线免费视频观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久久久久久久大av| 日本一本二区三区精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产av一区在线观看免费| 波多野结衣高清作品| 欧美高清性xxxxhd video| 久久精品国产清高在天天线| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲久久久久久中文字幕| 成人毛片60女人毛片免费| 精品一区二区免费观看| 如何舔出高潮| 国产精品久久久久久精品电影| 国产av一区在线观看免费| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 免费一级毛片在线播放高清视频| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美性感艳星| 亚洲欧美日韩东京热| 日韩av在线大香蕉| 高清午夜精品一区二区三区 | 成人综合一区亚洲| 国产成人精品婷婷| 亚洲在线自拍视频| 国产高清激情床上av| 日韩欧美国产在线观看| 亚州av有码| 精品国内亚洲2022精品成人| 成人漫画全彩无遮挡| 久久久a久久爽久久v久久| 精品午夜福利在线看| 可以在线观看毛片的网站| 黄色视频,在线免费观看| 日韩成人伦理影院| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品.久久久| 老司机影院成人| 国产高潮美女av| 美女 人体艺术 gogo| av天堂在线播放|